专利名称：一种报春花的人工杂交繁殖方法
技术领域：
:本发明涉及植物的杂交育种方法，具体涉及一种报春花的人工杂交繁殖方法。
背景技术：
:报春花(Primula L.)是世界著名观赏花卉，因其色彩艳丽、观赏价值较高而备受园艺学家青睐，被誉为“世界三大园艺植物”之一。而灯台报春组(Section ProliferaePax)是报春花属中最受园艺学家们喜爱的组之一。霞红灯台报春(Primula beesiana)和橘红灯台报春(Primula bulleyana)均为多年生草本花丼，花美丽并且适应性较强(图1)。霞红灯台报春花冠紫色，橘红灯台报春花冠黄色，是典型的自交不亲和(self-1ncompatibility)植物,长期的异花授粉使其后代性状分离广泛,花型、花色等性状上的一系列变异都难以稳定遗传。目前国内多数花卉企业主要依靠进口国外的报春花杂种一代种子进行生产，传统的育种方法中，采用连续多代自交的方法可以有效获得性状稳定遗传的纯合体，由于其具有自交不亲和性，可采用蕾期授粉、切除柱头、子房内授粉、离体受精、植物激素处理雌蕊等方法克服自交不亲和性，使植物获得自交系，但是这些方法的实施技术要求较高且繁琐，得到的新品种的特异性、一致性、稳定性都不能让人满意
发明内容
:本发明的目的是提供一种报春花的人工杂交繁殖方法。该方法培育的杂交Fl代植株株型及花径显著增大，花量明显增多，新颖性明显，既能盆栽观赏，也能做花坛、花带的布置、绿化等，该育种方法易于实施，成本低廉，效果显著。本发明的下述技术方案用于达到上述的发明目的。一种报春花 的人工杂交繁殖方法，包括以下步骤:(I) 7月中旬，以橘红灯台报春(Primula bulleyana)长柱花作为母本X霞红灯台报春(Primula beesiana)长柱花为父本的杂交组合,套袋去雄,进行人工授粉,授粉后,再套袋，并挂牌标记，待花凋落时，去袋，保证果实在自然条件下发育，待果实成熟时，杂交种子采收、检测并育种；(2)将检测后的杂交种子灭菌，灭菌过程为:种子在流动的自来水中冲洗30min后，用滤纸吸干表面水分，然后浸入到75%的酒精中消毒10s，取出，用无菌水冲洗3-5遍后，浸入0.1%升萊中消毒8min,取出，用无菌水冲洗3_5遍；(3)激素浸种，用 300mg/L GA+20mg/L IBA+50mg/L 6-BA 浸泡种子 12 小时；(4)无菌播种与小苗移栽:播种培养基为1/2MS培养基；萌发后30天左右，将其转Λ MS+lmg/L ZT+0.lmg/L NAA增殖培养基进行增殖；生根培养基为l/2MS+lmg/LNAA ;培养30天后将培养瓶移至大棚70°/Γ75%自然光遮光度下炼苗10 15天，然后将其取出，洗净根部的培养基；(5)将步骤(4)的小苗移栽到消毒处理过的基质，所述基质为红土:腐殖土:珍珠岩:蛭石按体积比为1:1:1: 2混合；保持湿度在75%，遮光度为70% 75%，30天后成活率达到95%以上。所述的方法中，步骤(I)中的杂交种子检测方法为:种子通过数字化X光样品成像系统(MX-20-DC12，Faxitron, USA)的X射线照射，然后照相，统计所检测种子的胚败育情况，选择具有正常发育胚的种子进行后续繁育。所述的方法中，步骤(I)中的人工授粉时机为柱头分泌粘液。本发明的方法可更具体地描述为:1、本发明分别以霞红灯台报春与橘红灯台报春，各自的长柱花和短柱花分别作为父母本，进行了以下8个组合的人工授粉实验:a)霞红灯台报春(pin)早X橘红灯台报春(pin) ;b)霞红灯台报春(pin)早X橘红灯台报春(thrum) ; c)霞红灯台报春(thrum)早X橘红灯台报春(pin) ; d)霞红灯台报春(thrum)早X橘红灯台报春(thrum) ; e)橘红灯台报春(pin)早X霞红灯台报春(pin) ; f)橘红灯台报春(pin)早X霞红灯台报春(thrum) ; g)橘红灯台报春(thrum)早X霞红灯台报春(pin) ;h)橘红灯台报春(thrum)早X霞红灯台报春(thrum)古。2、在7月中旬，将尚未开放的花套袋；待花开放后，用镊子去雄，按照以上组合进行相互授粉实验。授粉后，再套袋，并挂牌标记。待花凋落时，去袋，保证果实在自然条件下发育。待果实成熟时，统计坐果率和每颗果实的种子数目。3、将8种处理组合得到的种子进行标记，并将随即选取的种子通过数字化X光样品成像系统(MX-20-DC12，Faxitron, USA)的X射线照射，然后照相，并统计所检测种子的胚败育情况。4、进行下一步无菌播种的报春花杂交F1代种子为:经X射线检测后，具有正常发育胚的种子，种子灭菌，灭菌过程为:种子在流动的自来水中冲洗30min后，用滤纸吸干表面水分，然后浸入到75%的酒精中消毒10s，取出，用无菌水冲洗3-5遍后,浸入0.1 %升汞中消毒8min,取出，用无菌水冲洗3_5遍。并采用激素浸种，用300mg/LGA+20mg/LIBA+50mg/L6-BA浸泡种子12小时。 5、无菌播种与小苗移栽:播种培养基为1/2MS培养基，萌发后30天左右，将其转Λ MS+lmg/L ZT+0.lmg/LNAA进行增殖，生根培养基为l/2MS+lmg/LNAA，培养30天后将培养瓶移至大棚70°/Γ75%自然光遮阴度下炼苗10 15天，然后将其取出，洗净根部的培养基，移栽到消毒处理过的基质，所述基质=红土:腐殖土:珍珠岩:蛭石按体积比为1:1:1:2混合，注意保持湿度在70°/Γ80%，遮光度在70°/Γ75%，30天后成活率达到95%以上。步骤2中在花开放前套袋和杂交授粉后套袋均是为避免由于传粉昆虫授粉导致的花粉污染。野外挂牌标记时，用塑料牌和铅笔，两者都可以很好地防止雨水的冲刷。步骤3中的种子检测是每个处理50粒种子，5次重复；胚的完好与败育的标准是:种子经过照射后，若中间部分发亮说明胚完好，若黑暗说明胚败育。最后，本发明所用的X射线成像系统为美国生产的MX-20-DC12, Faxitron系列。本发明相对现有技术的有益效果为:1、由于霞红灯台报春和橘红灯台报春为原始种的杂交,不同原始种间杂交表现出的都是远交衰退现象，因此，远交衰退必不可免，进而败育很高。杂交后，虽然有较高果实率，果实里面也有种子，但是检测后种子里面没有胚。败育会体现在很多环节，比如:不结果实；或者结了果实，但里面没有种子；或者产生了种子，但种子全部空瘪；或者即便种子完好，萌发后小苗死亡等等环节，本申请选择对杂交组合选择了八种情形分别研究，得出橘红灯台报春(Pin)早X霞红灯台报春(pin) 组合Fl代种子萌发率，可育率最高，其它组合则全部败育或者基本不可育(见表I)。2、由于考虑到杂交后得种子败育问题，本发明得到种子后，首先对胚进行了检测，选择有胚的种子进行下一步的繁殖实验。本发明利用数字化X光样品成像系统，所述X射线成像系统为美国生产的MX-20-DC12，Faxitron系列。对种子胚的败育情况进行了科学的检测，种子经过照射后，若中间部分发亮说明胚完好，若昏暗说明胚败育，利用该方法可以在短时间内选育出更具观赏价值的潜在报春花新品种，并应用组织培养的手段，规模化繁殖出优良杂交报春F1代。3、考虑到杂交种子本身活力较低、竞争力较弱，本申请先通过消毒，在无菌的培养基上播种，获得了无菌的小苗，所有繁殖方式都是在无菌条件下，且本发明在试验中发现，按照常规的灭菌操作后种子被杀伤，不容易诱导萌发，经反复实验，多次结果的比较，才得到本发明种子的具体灭菌方法，不仅取得了理想的灭菌效果，还保证了诱导培养的种子数，这一结果与发明针对的特定对象杂交种子所含的成分有很大关系，本发明所采用的种子灭菌方法是在理论研究的基础上，得到大量实验结果支持的有效灭菌方法，大大保证了种子的萌发率。
4、激素种类和浓度对种子的生长发育有显著的作用，本申请用300mg/LGA+20mg/LIBA+50mg/L6-BA浸泡种子12小时，能够显著改善杂交种子的萌发率，单因子实验结果表明，采用该激素浸泡后，种子萌发率提高了 11.5%，大大缩短了萌发时间。同时本申请通过大量实验确定了针对F1代的最佳萌发-增殖-生根培养基配方使得成活率达到95%以上。5、基质配方不仅影响苗木地上部分地生长，同时也是影响苗木根系构型的重要因素，不同地基质配比不仅对苗木苗期生长反应有所不同，且对后期的生长，这种影响仍然存在，本申请发明人经过多年创造性劳动，进行筛选对比实验，从大量扦插基质中筛选红土:腐殖土:珍珠岩:蛭石按体积比为1:1:1:2的混合基质中，各基质间互作互应，达到透气、保湿、固根的效果。6、由于报春的自交不亲和性，本发明采用上述杂交育种方法可以有效地固定性状，使品种内各单种趋于纯合，其获得的Fl代杂交种花色花型性状得到稳定，其植株长势旺盛、叶色深绿，其它的观赏性状如花径等也有了很大改善，观赏价值增加，在整个营养生长和生殖生长过程种，随即选取母本、父本以及F1代三个品种50株测量其株高、叶长、叶宽、花径、花葶数目等性状指标，并用SPSS软件数据分析，得出结论，杂交F1代植株株型及花径显著增大，花量明显增多，新颖性明显，既能盆栽观赏，也能做花坛、花带的布置、绿化等，本发明的育种方法易于实施，成本低廉，效果显著。
:图1霞红灯台报春⑴与橘红灯台报春(2)的花部形态。图2霞红灯台报春⑴、橘红灯台报春(2)及其杂交F1代(3)种子经过X射线照射后，胚的典型特征。
具体实施方式
:以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。实施例1:于2010年7月中旬处于盛花期开展以霞红灯台报春(Primula beesiana)为母本和以橘红灯台报春(Primula bulleyana)为父本的人工杂交试验。共4个处理:即a)霞红灯台报春(pin)早X橘红灯台报春(pin) i ;b)霞红灯台报春(pin)早X橘红灯台报春(thrum) ; c)霞红灯台报春(thrum)早X橘红灯台报春(pin) ; d)霞红灯台报春(thrum)早X橘红灯台报春(thrum)古。橘红灯台报春花粉收集:由于两亲本的花期重叠，橘红灯台报春的花粉可以即取即用。霞红灯台报春花去雄:7月10日选取即将开放的霞红灯台报春的花序套袋，并用镊子去雄标记；然后套袋。待12日所处理花朵全部开放时，进行杂交授粉实验。判断柱头具有可授粉的标准是柱头是否分泌粘液。在去雄后，逐一检查柱头是否带有少量花粉。若有，则将这些受污染的柱头排除杂交授粉实验。杂交操作:7月12日杂交当天手持摘取的橘红灯台报春花粉直接涂于已经去雄的霞红灯台报春花朵上。操作时动作要轻。同时，用眼睛仔细观察，杂交授粉的主柱头已经完全被花粉覆盖。处理后套袋，每个处理至少保证50朵以上。7月20-25日除去纸袋。9月5日采收果实，剥出种子置于4°C下贮藏。坐果率和种子数目具体见表I。表1:8种人工杂交授粉实验的坐果率和种子数目，其中，A为霞红灯台报春；B为橘红灯台报春；p为长柱花；τ为短柱`花；^为母本； 为父本。
早X S坐果率种子数/果实可育种子率
A(P) XB(P) 04138O
A(P) XB(T) 058TlO
A(T) XB(P) 0 8080O
A(T) XB(T) 0 6540O
B(P) XA(P) 0 888130%
B(P) XA(T) 0 33426%
B(T) XA(P) Τθ 3180%
B(T) XA(T) OOO种子胚检测:将4种处理组合得到的种子进行标记，并将随即选取的种子通过数字化X光样品成像系统(MX-20-DC12，Faxitron, USA)的X射线照射，然后照相，并统计所检测种子的胚败育情况。结果表明，以霞红灯台报春为母本得到的F1代种子的胚经过X射线检测后全部败育。实施例2:于2010年7月中旬处于盛花期开展以橘红灯台报春(Primula bulleyana)为母本和以霞红灯台报春(Primula beesiana)为父本的人工杂交试验。共4个处理:即a)橘红灯台报春(pin)早X霞红灯台报春(pin) ^ ;b)橘红灯台报春(pin)早X霞红灯台报春(thrum) ^ ; c)橘红灯台报春(thrum)早X霞红灯台报春(pin) ^ ; d)橘红灯台报春(thrum)早X霞红灯台报春(thrum)古。霞红灯台报春花粉收集:由于两亲本的花期重叠，霞红灯台报春的花粉可以即取即用。橘红灯台报春去雄:7月10日选取即将开放的橘红灯台报春的花序套袋，并用镊子去雄标记；然后套袋。待12日所处理花朵全部开放时，进行杂交授粉实验。判断柱头是否具有可授性的标准是检测柱头是否分泌粘液。在去雄后，逐一检查柱头是否在试验操作中，是否带有少量花粉。若有，则将这些受污染的柱头排除杂交授粉实验。杂交操作:7月12日杂交当天手持摘取的霞红灯台报春花粉直接涂于已经去雄的橘红灯台报春花朵上。操作时动作要轻。同时，用眼睛仔细观察，杂交授粉的主柱头已经完全被花粉覆盖。处理后套袋，每个处理至少保证50朵以上。7月20-25日除去纸袋。9月5日采收果实，剥出种子置于4°C下贮藏。坐果率和种子数目具体见表I。种子胚检测:将4种处理组合得到的种子进行标记，并将随即选取的种子通过数字化X光样品成像系统(MX-20-DC12，Faxitron, USA)的X射线照射，然后照相，并统计所检测种子的胚败育情况。
无菌播种与小苗移栽:将检测后的种子将检验后的种子灭菌，灭菌过程为:种子在流动的自来水中冲洗30min后，用滤纸吸干表面水分，然后浸入到75%的酒精中消毒10s，取出，用无菌水冲洗3-5遍后,浸入0.1%升萊中消毒8min,取出，用无菌水冲洗3_5遍。激素浸种，用300mg/LGA+20mg/LIBA+50mg/L6-BA 浸泡种子 12 小时；播种培养基为1/2MS培养基，萌发后30天左右，将其转入MS+lmg/L ZT+0.1mg/LNAA进行增殖，生根培养基为l/2MS+lmg/LNAA，培养30天后将培养瓶移至大棚70% 75%自然光遮阴度下炼苗10 15天，然后将其取出，洗净根部的培养基，移栽到消毒处理过的基质=红土:腐殖土:珍珠岩:蛭石按体积比为1:1:1:2的混合基质中，注意保持湿度在70% 80%，遮光度在70% 75%，30天后成活率达到95%以上。通过橘红灯台报春(Primula bulleyana)长柱花作为母本X霞红灯台报春(Primula beesiana)长柱花为父本的杂交组合获得的F1代花色花型性状得到稳定，其植株长势旺盛、叶色深绿，其它的观赏性状如花径等也有了很大改善，观赏价值增加，在整个营养生长和生殖生长过程种，随即选取母本、父本以及F1代三个品种50株测量其株高、叶长、叶宽、花径、花葶数目等性状指标，并用SPSS软件数据分析，得出结论，杂交Fl代植株株型及花径显著增大，花量明显增多。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的 基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种报春花的人工杂交繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)以橘红灯台报春(Primulabulleyana)长柱花作为母本X霞红灯台报春(Primulabeesiana)长柱花为父本的杂交组合，套袋去雄，进行人工授粉，授粉后，再套袋，并挂牌标记，待花凋落时，去袋，保证果实在自然条件下发育，待果实成熟时，杂交种子采收、检测并育种； (2)将检测后的杂交种子灭菌，灭菌过程为:种子在流动的自来水中冲洗30min后，用滤纸吸干表面水分，然后浸入到75%的酒精中消毒10s，取出，用无菌水冲洗3-5遍后，浸入0.1 %升萊中消毒8min,取出，用无菌水冲洗3_5遍； (3)激素浸种，用300mg/L GA+20mg/L IBA+50mg/L 6-BA 浸泡种子 12 小时； (4)无菌播种与小苗移栽:播种培养基为1/2MS培养基；萌发后30天左右，将其转入MS+lmg/L ZT+0.lmg/L NAA增殖培养基进行增殖；生根培养基为l/2MS+lmg/LNAA ;培养30天后将培养瓶移至大棚70°/Γ75%自然光遮光度下炼苗10 15天，然后将其取出，洗净根部的培养基； (5)将步骤(4)的小苗移栽到消毒处理过的基质，所述基质为红土:腐殖土:珍珠岩:蛭石按体积比为1:1:1: 2混合；保持湿度在75%，遮光度为70°/Γ75%。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(I)中的杂交种子检测方法为:种子通过数字化X光样品成像系统(MX-20-DC12，Faxitron，USA)的X射线照射，然后照相，统计所检测种子的胚败育情况，选择具有正常发育胚的种子进行后续繁育。
3.根据 权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(I)中的人工授粉时机为柱头分泌粘液。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，具体公开了一种报春花的人工杂交繁殖方法，该方法以极具观赏价值的报春花属植物霞红灯台报春与橘红灯台报春各自的长柱花和短柱花分别作为父母本，进行了人工杂交授粉。将得到的杂交F1代种子，首先通过数字化X光样品成像系统对种子进行胚败育检测，然后选择胚发育正常的种子进行消毒、在培养基上萌发，最后炼苗、移栽。本发明实现了霞红灯台报春与橘红灯台报春的远缘杂交，并且利用数字化X光样品成像系统，对种子胚的败育情况进行了科学的检测，可以培育出更具有观赏价值的报春花新品种。
文档编号A01H1/02GK103070064SQ20121054570
公开日2013年5月1日 申请日期2012年12月17日 优先权日2012年12月17日
发明者马永鹏, 罗桂芬, 吴之坤, 田小玲, 薛瑞娟 申请人:中国科学院昆明植物研究所