用于增强大豆生长的壳寡糖和方法
【专利摘要】公开的是增强大豆植物生长的方法，包括用有效量的至少一种壳寡糖处理大豆种子或从种子萌发的大豆植物，其中，与未经处理的大豆植物或从未经处理的大豆种子收获的大豆植物相比，在收获时该大豆植物表现出按蒲式耳/英亩测量的增加的植物产量、增加的根数量、增加的根长度、增加的根质量、增加的根体积和增加的叶面积中的至少一种。
【专利说明】用于增强大豆生长的壳寡糖和方法
【背景技术】
[0001] 革兰氏阴性土壤菌根瘤菌科（Rhizobiaceae)和慢生根瘤菌科 (Bradyrhizobiaceae)与豆科植物例如大豆之间的共生关系有较多文献记载。这些关系的 生化基础包括分子信号传导的交换，其中，植物对细菌的信号化合物包括黄酮、异黄酮和黄 烷酮类，而细菌对植物的信号化合物包括慢生根瘤菌和根瘤菌nod基因表达的终产物，称 为脂壳寡糖（LC0)。这些细菌与豆科植物之间的共生使得豆科植物能够固定大气氮用于植 物生长，由此免去对氮肥的需求。由于氮肥会显著增加作物的成本，并且与许多污染效应相 关，农产业继续努力运用这种生物关系并开发新的用于提高植物产量而不增加氮类肥料的 使用的试剂和方法。
[0002] 美国专利第6, 979, 664号教导了增强植物作物的种子萌发或出苗的方法，包括以 下步骤：提供包含有效量的至少一种脂壳寡糖和农业上适用的载体的组合物，以及在种子 或幼苗的紧邻处以相较于未经处理的种子或幼苗能增强种子萌发或出苗的有效量施用该 组合物。
[0003] 关于该概念的进一步拓展在W02005/062899中有过教导，其涉及至少一种植物诱 导剂（即LC0)与杀真菌剂、杀虫剂或其组合的结合，以增强植物特性如植物挺立（plant stand)、生长、强健度（vigor)和/或产量。教导称这些组合物和方法适用于豆科植物和非 豆科植物，并且可以用于处理种子（临种植前）、幼苗、根或植物。
[0004] 相似地，W02008/085958教导了用于在豆科植物和非豆科植物中增强植物生长和 作物产量的组合物，其包含LC0与另一种活性剂如几丁质或壳聚糖、类黄酮化合物、或除草 剂的组合，其可以同时或相继地施用于种子和/或植物。与在' 899公开中的情况一样，' 958 公开教导了在临种植前对种子进行处理。
[0005] 最近，Halford，"Smoke Signals"，Chem. Eng. News (2010 年 4 月 12 日）第 37 ?38 页报道，在森林起火后，烟中所含的卡里金（karrikin)或丁烯羟酸内酯起到生长刺激剂的 作用并促使种子萌发，并且能滋补已储存的种子如玉米、西红柿、莴苣和洋葱。这些分子是 美国专利第7, 576, 213号的主题。
[0006] 但是，对于促进或增强植物生长的体系仍存在需求。
【发明内容】
[0007] 本发明的第一方面涉及一种增强大豆植物生长的方法，包括：a)用有效量的至少 一种壳寡糖（C0)来处理（例如，施用于）大豆种子或从种子萌发的大豆植物，其中，与未经 处理的大豆植物或者从未经处理的大豆种子收获的大豆植物相比较，在收获时上述大豆植 物表现出以下的至少一种：按蒲式耳/英亩测量的增加的植物产量、增加的根数目、增加的 根长度、增加的根质量、增加的根体积和增加的叶面积。
[0008] 在一些实施方式中，使用至少两种C0。在一些实施方式中，对大豆种子的处理包 括将至少一种C0直接施用于种子，然后其可以进行种植或者在种植之前储存一段时间。对 大豆种子的处理还可以包括间接处理，例如，通过将至少一种C0引入至土壤中（在本领域 中称为犁沟施用）。在另外的实施方式中，可以例如经由叶喷将至少一种CO施用于由种子 萌发的植物。该方法可以进一步包括使用其它的农艺学有益的试剂，例如痕量营养素；脂肪 酸及其衍生物；植物信号分子（(C0以外的），例如脂壳寡糖、（C0以外的）几丁质化合物、 类黄酮、茉莉酸及其衍生物、亚油酸及其衍生物、亚麻酸及其衍生物和卡里金及其衍生物）； 除草剂、杀真菌剂和杀虫剂；解磷微生物、固氮生物（根瘤菌菌剂）、和/或菌根真菌。
[0009] 如总结了温室中和田地中进行的实验的工作实施例所说明的，本发明的方法所取 得的结果显示，将至少一种C0施用于大豆种子或从种子萌发的大豆植物，引起增强的植物 生长。这些结果据信是出人意料的，特别是就以下观点而言：已知C0与系统获得性抗性 (SAR)有关，但并非必要地参与植物生长的直接促进。本文所述的结果表明，在一些情形 中，本发明的方法实现了基本上等同的LC0所实现的促进植物生长的效果，或者在一些情 形中，胜过LC0所实现的促进植物生长的效果。获自温室实验的结果在这一方面特别显著， 在于其在基本上无病的条件下进行。
【专利附图】
【附图说明】
[0010] 图la和2a显示了可用于实施本发明的壳寡糖化合物（C0)的化学结构。
[0011] 图lb和2b显示了与图la和2a中的C0对应的脂壳寡糖化合物（LC0)的化学结 构，其也可用于实施本发明。
[0012] 图3a和4a显示了其它可用于实施本发明的C0的化学结构。
[0013] 图3b和4b显示了与图3a和3b中的C0对应的Myc-因子的化学结构，其也可用 于实施本发明。
[0014] 图5是如下的柱状图，显示了用图2a所示的C0与图2b所示的LC0相比较以及用 几丁质酶产生的C0混合物、异黄酮和对照处理大豆种子的效果，其以叶表面积表示。
[0015] 图6是如下的柱状图，显示了用图2a所示的C0、图lb所示的LC0、异黄酮以及（经 由酶促方法由壳聚糖得到的）非本发明的几丁质化合物的混合物处理大豆种子的效果，其 以大豆植物的平均干重表示。
[0016] 图7是如下的柱状图，显示了用单独的或者与两种不同脂肪酸之一组合的图2a所 示的C0与用图lb所示的LC0相比对大豆种子的效果，其以平均根长度表示。
[0017] 图8是如下的柱状图，显示了用图2a所示的C0与用图lb所示的LC0相比较以及 用几丁质酶产生的C0混合物处理大豆植物的效果，其以平均植物干生物质表示。
【具体实施方式】
[0018] 壳寡糖
[0019] 本领域已知C0是β-1-4连接的N-乙酰基葡糖胺结构，其被鉴别为几丁质寡 聚物，也被鉴别为Ν-乙酰基壳寡糖。C0具有独特且不同的侧链修饰，这使其与几丁质 分子[(C8H 13N0丄，CAS No. 1398-61-4]和壳聚糖分子[(C5HnN04)n，CAS No. 9012-76-4]不 同。参见，例如，Hamel等人，Planta232:787-806(2010)(例如图1，其显示了几丁质、 壳聚糖、Nod因子（LC0)和对应的C0(其缺少18C、16C或20C乙酰基）的结构）。本 发明的C0相对于几丁质和壳聚糖也是相对水溶性的，在一些实施方式中，如下文所 述，是五聚的。描述可适用于本发明的C0的结构和制备的代表性文献如下：Muller等 人，Plant Physiol. 124:733-9(2000)(例如，其中图 1) ;Van der Holst 等人，Current Opinion in Structural Biology, 11:608-616(2001)(例如，其中图 1) ;Robina 等 人，Tetrahedron58:521-530(2002) ;D，Haeze 等人，Glycobiol.l2(6):79R-105R(2002 )；Rouge 等人，Chapter27, 〃The Molecular Immunology of Complex Carbohydrates〃in Advances in Experimental Medicine and Biology, Springer Science ;Wan 等人，Plant Cell21:1053-69(2009) ;PCT/F100/00803 (9/21/2000);和 Demont-Caulet 等人，Plant Physiol. 120(1) :83-92(1999)。
[0020] 就结构而言CO与LC0的不同之处主要在于其缺少侧边的（pendant)脂肪酸链。可 以用于实施本发明的源自根瘤菌的C0以及其非天然出现的合成衍生物可以用下式表示：
[0021]
【权利要求】
1. 一种增强大豆植物生长的方法，包括用有效量的至少一种CO处理大豆种子或从种 子萌发的大豆植物，其中，与未经处理的大豆植物或从未经处理的大豆种子收获的大豆植 物相比，在收获时所述植物表现出按蒲式耳/英亩测量的增加的植物产量、增加的根数量、 增加的根长度、增加的根质量、增加的根体积和增加的叶面积中的至少一种。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种C0由下式表示：
其中&和R2各自独立地表示氢或甲基；R3表示氢、乙酰基或氨基甲酰基；R4表示氢、乙 酰基或氨基甲酰基；R5表示氢、乙酰基或氨基甲酰基；R6表示氢、阿拉伯糖基、岩藻糖基、乙 酰基、硫酸酯、3-0-S-2-0-MeFuc、2-0-MeFuc和4-0-AcFuc ;R7表示氢、甘露糖基或甘油；R8 表示氢、甲基或-CH20H;R9表示氢、阿拉伯糖基或岩藻糖基；R1(l表示氢、乙酰基或岩藻糖基； 且η表示0、1、2或3。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种C0如图la所示。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种C0如图2a所示。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种C0由下式表示：
其中η = 1或2 表示氢或甲基；且R2表示氢或S03H。
6. 根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种CO如图3a所示。
7. 根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种C0如图4a所示。
8. 根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种C0是合成的。
9. 根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种C0是重组的。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中至少一种重组C0为至少60%纯。
11. 根据权利要求9所述的方法，其中至少一种重组C0为至少70%纯。
12. 根据权利要求9所述的方法，其中至少一种重组C0为至少80%纯。
13. 根据权利要求9所述的方法，其中至少一种重组C0为至少90%纯。
14. 根据权利要求1所述的方法，其中在种植之前或者在大约种植时将所述至少一种 CO施用于所述大豆种子。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述至少一种C0的有效量为大约ΚΓ5至大约 ΚΓ14摩尔。
16. 根据权利要求1所述的方法，其中在犁沟中将所述至少一种C0施用于所述大豆种 子。
17. 根据权利要求16所述的方法，其中所述至少一种C0的有效量为1 μ g/英亩至大约 70 μ g/英亩。
18. 根据权利要求1所述的方法，其中经由叶处理将所述至少一种CO施用于所述大豆 植物。
19. 根据权利要求18所述的方法，其中所述至少一种C0的有效量为1 μ g/英亩至大约 30 μ g/英亩。
20. 根据权利要求1所述的方法，进一步包括将至少一种农艺学有益的试剂施用于所 述大豆植物或其种子。
21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述至少一种农艺学有益的试剂是痕量营养 素。
22. 根据权利要求21所述的方法，其中所述痕量营养素选自维生素和痕量矿物质。
23. 根据权利要求20所述的方法，其中所述农艺学有益的试剂是脂肪酸或其衍生物。
24. 根据权利要求20所述的方法，其中所述至少一种农艺学有益的试剂是植物信号分 子。
25. 根据权利要求24所述的方法，其中所述植物信号分子是脂壳寡糖（LC0)。
26. 根据权利要求25所述的方法，其中所述LC0如图lb所示。
27. 根据权利要求25所述的方法，其中所述LC0如图2b所示。
28. 根据权利要求25所述的方法，其中所述LC0如图3b所示。
29. 根据权利要求25所述的方法，其中所述LC0如图4b所示。
30. 根据权利要求24所述的方法，其中所述植物信号分子选自几丁质化合物、类黄酮、 茉莉酸及其衍生物、亚油酸及其衍生物、亚麻酸及其衍生物和卡里金及其衍生物。
31. 根据权利要求20所述的方法，其中所述农艺学有益的试剂是除草剂、杀虫剂、杀真 菌剂或其任意组合。
32. 根据权利要求20所述的方法，其中所述农艺学有益的试剂是解磷微生物、固氮生 物（根瘤菌菌剂）和/或菌根真菌。
33. 根据权利要求32所述的方法，其中至少一种解磷微生物包括真菌青霉属 (Penicillium)的菌株。
34. 根据权利要求32所述的方法，其中至少一种解磷微生物包括拜赖青霉 (P.bilaiae)的菌株。
35. 根据权利要求34所述的方法，其中所述拜赖青霉的菌株选自NRRL50162、 NRRL50169、ATCC20851、ATCC22348 和 ATCC18309。
36. 根据权利要求32所述的方法，其中至少一种解磷微生物包括P. gaestrivorus的菌 株。
【文档编号】A01N43/16GK104066328SQ201280057714
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2012年9月24日 优先权日:2011年9月23日
【发明者】R.S.史密斯, A.哈比卜 申请人:诺维信生物农业公司, 诺维信生物股份有限公司