专利名称：一种利用芋头茎尖进行组织培养的快繁方法
技术领域：
本发明“一种利用芋头茎尖进行组织培养的快繁方法”，是由芋头茎尖离体条件下组织培养获得试管苗，属于生物技术领域。
背景技术：
江苏省拥有较多地方特色芋头品种，具有较好的营养保健品质，并含有多种维生素，既可以当粮食，又可做蔬菜，是老幼皆宜的滋补品，加工前景广阔，闻名并畅销国内外市场。目前，江苏省地方特色芋头的生产通常是采用群众自留种的方式进行繁殖，种性退化问题较为突出，抗病性和抗逆性减退。而且，国内对其组培快繁技术方面研究很少，因此开展江苏省地方特色芋头组培再生体系技术研究，不仅有利于品种的更新复壮，更为种苗工厂化生产和新品种选育提供技术支持与储备。目前，芋头组织培养研究国内外均有报道，但多以茎尖诱导愈伤组织为研究内容，不利于保持品种的稳定性。本发明利用茎尖离体条件获得试管苗，易于保持品种种性，同时可明显提高繁殖系数和繁殖速度，加快了快繁进程，保持了品种的优良特性，有效地保护了具有地方特色的种质资源。
发明内容
技术 问题
本发明的目的是找到既能提高芋头繁殖系数和繁殖速度，又能保持该品种稳定性的方法，此方法具有繁殖系数高、繁殖速度快、繁殖效率高，种苗病毒少，遗传稳定性好变异率低等优点，可以弥补现有繁殖方式成本高、系数低、愈伤组织诱导组培苗繁琐、时间长、变异率高的缺点，从而为芋头种苗扩繁提供一种新的方法。技术方案1、一种利用芋头茎尖进行组织培养的快繁方法，包括以下步骤:
(I)外植体的准备:选取保存完好，无腐烂斑点的芋，经0.2%的K2MnO4消毒5min后整齐地排列在周转箱中，用沙子覆盖到整个芋块的2/3处，放置到光照培养箱中待其萌发。(2)外植体的灭菌:当芽生长到l-3cm时切取茎尖，剥除茎尖外层2_3层叶片，流动水冲洗IOmin左右，在超净台上用75%酒精浸泡30s，用84消毒液灭菌10_15min，无菌水漂洗5-7次。(3)芽的诱导分化:外植体经灭菌后接种在添加TDZ浓度为0.5mg/L的基本培养基中，20d即可长成两片或两片叶片以上的幼苗。(4)继代增殖:诱导培养基上萌发出的不定芽长到2.0cm的时候，接种在添加TDZ浓度为1.0mg/L的基本培养基中，一般连续继代3-5次。(5)生根培养:将高2.0 cm以上、带有2片叶的健壮小苗切下，转入生根培养基上进行培养，生根培养基成分为1/2MS+琼脂7g/L+蔗糖30g/L+活性炭0.2g/L +6-BA 0.1mg/L+NAA 0.5mg/L ;培养30d左右即可形成完整的组培苗。(6)培养条件:培养室温度为25±2°C，光照强度1200-15001x，每天光照12h。基本培养基为MS中添加琼脂7 g /L，添加蔗糖30g/L。其中MS培养基为M0222.0050培养基。
有益效果
本发明第一次利用组织培养的方法解决具有江苏地方特色的芋头种芋快繁问题。本发明利用芋茎尖离体条件下获得试管苗，有利于实现芋头种苗繁殖工厂化生产。本发明具有繁殖系数高、繁殖速度快、繁殖效率高，种苗病毒少、遗传稳定性好的特点。本发明利用芋茎尖初代培养20天左右即可长成两片或两片叶片以上的幼苗，大大提高了初代培养的进程，继代培养一次增殖系数平均达到4.3，一般可连续继代5次，培养1470株苗(4.35=1470)，一年可以培养2批，形成组培种芋2940株，有利于芋大规模商品化生产；此方法也有易于获得遗传稳定性好变异率低的再生植株。
附图1初代培养；
附图2继代增殖；
附图3生根培养；
附图4组培苗。
具体实施例方式下面通过基于中国地理标志性农产品靖江香沙芋茎尖离体条件下获得试管苗进一步说明本发明。I材料与方法1.1试验材料
采用盆栽芋头，选用茎尖为外植体。1.2 方法1.2.1无菌材料的处理
选取保存完好，无腐烂斑点的芋，经0.2%的K2MnO4消毒5min后整齐地排列在周转箱中，用沙子覆盖到整个芋块的2/3处，放置到光照培养箱中待其萌发。待芽生长到l-3cm时切取茎尖，剥除外层2-3层叶片，流动水冲洗IOmin左右，在超净台上用75%酒精浸泡30s，分别用两种消毒剂3个时间段处理杀菌，每种处理分别接种12个茎尖于基本培养基中，观察杀菌效果。基本培养基为MS中添加琼脂7g/L和蔗糖30g/L。MS为M0222.0050培养基(荷兰 Duchefa Biochemie 公司)。①用84消毒液(江苏爱特福气雾剂有限公司)分别浸泡10、15、20min，比较其污染率；
②用5%的NaClO分别浸泡5、10、15min，比较其污染率。1.2.2芽诱导分化
外植体经灭菌后接种在添加不同浓度的6-BA和NAA组合及TDZ (噻苯隆)和IBA (口引哚丁酸)组合的基本培养基中，接种30d后比较芽的分化率、芽高度及叶片数等确定合适的培养基。激素浓度设置7个处理，每个处理各接种15个芽。①基本培养基+6-BA 0.5mg/L +NAA 0.2mg/L ；
②基本培养基+6-BA1.0mg/L +NAA 0.2mg/L ；
③基本培养基+6-BA 2.0mg/L +NAA 0.2mg/L ；
④基本培养基+6-BA 4.0mg/L +NAA 0.2mg/L ；
⑤基本培养基+TDZ0.5mg/L ；
⑥基本培养基+TDZ1.0mg/L ；
⑦基本培养基+TDZ1.0mg/L +IBA 0.4mg/L。
1.2.3继代增殖
诱导培养基上萌发出的芽体长到一定的程度后接种在添加不同浓度的6-BA和NAA组合及TDZ的基本培养基中观察其增殖倍数。激素浓度设置3个处理，每个处理各接种20个单牙。①基本培养基+6-BA 2.0mg/L +NAA 0.2mg/L ；
②基本培养基+TDZ0.5mg/L ；
③基本培养基+TDZ1.0mg/Lo1.2.4生根培养
将高2.0 cm以上、带有2片叶的健壮小苗切下，转入生根培养基上进行培养。调查不同处理的平均生根天数，30d的生根数，生根率，总叶片数，根系平均长度及根系形态。生根培养基设置4个处理，每个处理各接种15个小苗。①1/2MS+ 琼脂 7g/L+ 蔗糖 30g/L+ 活性炭 0.2g/L +6-BA 0.lmg/L +NAA 0.5mg/L ；
②1/2MS+ 琼脂 7g/L+ 蔗糖 30g/L+ 活性炭 0.2g/L +6-BA 0.lmg/L +NAA1.0mg/L ；
③1/2MS+ 琼脂 7g/L+ 蔗糖 30g/L+ 活性炭 0.2g/L +6-BA 0.lmg/L +NAA 2.0mg/L ；
④1/2MS+ 琼脂 7g/L+ 蔗糖 30g/L+ 活性炭 0.2g/L +6-BA 0.lmg/L +NAA 4.0mg/L。1.2.5培养基灭菌及培养条件
高压灭菌前用浓度0.lmol/L的氢氧化钠溶液调整培养基pH值至5.8，保持121°C灭菌20min。培养室温度为25±2°C，光照强度1200_15001x，每天光照12h/d。2结果与分析
2.1不同消毒液和灭菌时间对外植体灭菌效果的影响
从表I可以看出，外植体用84消毒液灭菌10-15min效果最好，灭菌成功率达83.3%以上。NaClO灭菌成功率，远远低于84消毒液灭菌成功率。因此，外植体的灭菌方法为:当芽生长到l-3cm时切取茎尖，剥除茎尖外层2-3层叶片，流动水冲洗IOmin左右，在超净台上用75%酒精浸泡30s，用84消毒液灭菌10-15min，无菌水漂洗5_7次。
表I不同消毒液和灭菌时间对外植体灭菌效果的影响
权利要求
1.一种利用芋头茎尖进行组织培养的快繁方法，包括以下步骤: (1)外植体的准备:选取保存完好，无腐烂斑点的芋，经质量比0.2%的K2MnO4消毒5min，用沙子覆盖到整个芋块的2/3处，放置到光照培养箱中待其萌发； (2)外植体的灭菌:当芽生长到l-3cm时切取茎尖，剥除茎尖外层2-3层叶片，流动水冲洗lOmin，在超净台上用75%酒精浸泡30s，用84消毒液灭菌10_15min，无菌水漂洗5_7次； (3)芽的诱导分化:外植体经灭菌后接种在添加TDZ浓度为0.5mg/L的基本培养基中，20d即长成两片或两片叶片以上的幼苗； (4)继代增殖:诱导培养基上萌发出的不定芽长到2.0cm的时候，接种在添加TDZ浓度为1.0mg/L的基本培养基中，一般连续继代3-5次； (5)生根培养:将高2.0 cm以上、带有2片叶的健壮小苗切下，转入生根培养基上进行培养，生根培养基成分为1/2MS+琼脂7g/L+蔗糖30g/L+活性炭0.2g/L +6-BA 0.1mg/L+NAA 0.5mg/L ； 上述步骤培养条件:培养室温度为25±2°C，光照强度1200-15001x，每天光照12h，基本培养基为MS中添加琼脂7g/L，蔗糖30g/L。
2.根据权利要求1所述的一种利用芋头茎尖进行组织培养的快繁方法，其中MS为M0222.0050 培养基。
全文摘要
本发明公开了一种利用芋头茎尖进行组织培养的快繁方法，属于生物技术领域。选取无病菌的芋茎尖为外植体，经过芽的诱导、继代增殖、生根培养等一系列操作步骤，最后形成完整的试管苗。此方法包括上述各阶段培养基成分以及诱导培养的处理方法，本发明利用芋茎尖初代培养20天左右即可长成两片或两片叶片以上的幼苗，大大提高了初代培养的进程，继代培养一次增殖系数平均达到4.3，一般可连续继代5次，培养1470(4.35)株苗，一年可以培养2批，形成组培种芋2940株，有利于芋大规模商品化生产；此方法也有易于获得遗传稳定性好变异率低的再生植株。
文档编号A01H4/00GK103070078SQ20131004782
公开日2013年5月1日 申请日期2013年2月7日 优先权日2013年2月7日
发明者韩晓勇, 殷剑美, 张培通 申请人:江苏省农业科学院