专利名称：拟南芥热激转录因子基因hsfa3及其编码蛋白与应用的制作方法
技术领域：
:本发明涉及植物分子生物学与转基因相关技术领域，具体为拟南芥热激转录因子(Heat Shock Transcription Factors, HSFs)基因家族成员HSFA3抗高温新功能的验证，以及该基因在抗高温植物新品种培育中的应用。
背景技术：
:温度的变化对植物生长发育具有重要的影响，适宜的温度能够保证或促进植物正常的生长发育，而不适宜的温度条件则会抑制植物的生长，甚至使植物死亡。自二十世纪以来，随着世界人口的飞速增长及工业化程度的不断加深，温室效应越来越严重，全球温度的逐步升高已成为作物正常生长、发育和获得高产的一个重要限制因素。现代分子生物学和基因工程相关技术的日益成熟，使人们从分子水平上探知植物对高温胁迫的响应及高温诱导相关信号在植物体内的传导途径成为现实，并且为改良作物的抗高温性能开辟了新的途径，在了解植物响应高温的分子机制的基础上，充分利用植物自身的基因资源，发掘植物抗高温相关基因，对培育抗高温性能提高的作物具有重要的指导意义。拟南芥(Arabidopsis thaliana)属十字花科,芸薹属植物,它不仅是第一个被测定基因组序列的模式植物(Athanasios Theologis et al.,NATURE, VOL.408:816_820),而且具有基因组规模较小、植株株型矮小、生长周期短、自花授粉而又易于杂交等优点。因此以拟南芥作为分子遗传学和基因工程研究的模式植物，从中鉴定和克隆与热胁迫相关的基因，并结合转基因操作技术是培育耐高温性能增强植物的一条有效途径。转录因子(Transcription factors, TFs)又称反式作用因子，是一类和专一'I"生DNA序列特异结合并能激活或抑止相关基因转录的蛋白质分子。热激转录因子(Heat shocktranscription factors, HSFs)是一类能够调控不同热激蛋白(Heat shock proteins,HSPs)基因表达的专用转录因子。基因组研究发现拟南芥中包含21个HSFs基因家族成员。已有研究证明HSFAls、HSFA2等亚家族成员在应答热胁迫信号和控制生长发育等过程中起到重要作用(HSIANG-CHIN LIU, HSIU-TINGLIAO&YEE-YUNG CHARNG, Plant,Cell and Environment(2011) 34,738-751 ；Yee-yung Charng.et al, Plant Physiology,January2007，Vol.143，pp.251-262)。但至今还没有关于HSFA3基因热胁迫反应的报道，这就给人们理解该基因的功能增加了难度，相关的理论和技术研究也往往因此而变得无所适从。
发明内容
本发明的目的是提供一个拟南芥热激转录因子(HSF)基因，以及该基因在应答热激胁迫反应中的功能和在培育耐高温植物中的作用。所提供的HSF 基因为 HSFA3 (AT5G03720)。上述基因具有SEQ ID N0.1的碱基序列。 上述基因编码的蛋白质具有SEQ ID N0.2的氣基酸序列。
HSFA3基因的T-DNA插入突变体salk_011131 是从ABRC(Arabidopsis BiologicalResource Center)定购获得。通过PCR鉴定获得纯合插入突变体，通过RT-PCR在mRNA水平上鉴定基因的敲除情况。通过上述鉴定，获得HSFA3基因T-DNA插入突变体salk_011131的纯合株系，并以之为材料进行热激处理。然后对热胁迫处理后的拟南芥幼苗进行耐高温相关指标的测定，包括根长及地上部生物量测定。
:图1显示野生型和突变体PCR和RT-PCR检测的电泳结果，结果表明所获HSFA3基因突变株系salk_011131为T-DNA纯合插入株系，其转录本被敲除。图2显示热胁迫处理流程和方法。图3显示野生型和突变体热胁迫10天后的表型图片，结果表明突变体经热胁迫处理后根长及地上部生物量均大于野生型，表现耐热表型。
具体实施方式
:下面结合实验方法和数据进一步阐述本发明。1.拟南芥幼苗培养:野生型和突变体种子分别用0.5%次氯酸钠溶液浸泡消毒lOmin，消毒后的种子放入4°C冰箱春化2天后点布于含I %琼脂的MS (Murashige and Skoog)固体培养基上,置于22°C光照培养箱中萌 发生长。2.纯合突变体鉴定:DNA提取:所用实验药品均购自中科瑞泰生物工程有限公司。取约0.5g拟南芥新鲜叶片，研磨成糊状，加 400 μ I SDS 提取液(0.5% SDS(ff/V) ；200mMTris-HCl, pH = 8.0 ；250mM NaCl ；25mM EDTA) ;12，OOOr/min离心3min ;取上清，加等体积异丙醇轻轻摇晃，静置30min ;13，000r/min离心5min ;弃上清,用lml95%酒精冲洗1_2次后，自然风干,加去离子水30μ 1，4°C保存备用。RNA提取:所用实验药品均购自中科瑞泰生物工程有限公司。所用研钵、枪头、离心管等一应物品事先用I % DEPC水浸泡过夜后高温高压灭菌备用。取新鲜幼苗约Ig左右，于液氮中研磨成粉状，加Iml TRIZOL提取液混匀，静置IOmin ;4°C下12000r/min离心IOmin ;取上清加300 μ I氯仿混勻，静置IOmin后4°C, 12000r/min离心15min,样品分为3层，RNA位于上层水相中；取500 μ I上层水相转移到新离心管中，加等体积异丙醇沉淀10-20min ； 12000r/min 离心 IOmin,弃上清；用 75%酒精洗漆 1-2 次,7000r/min 离心 2min,晾干Imin左右，加60 μ I无RNase水，轻轻震荡使RNA溶解，置于_70°C冰箱保存备用。RT-PCR:所用反转录试剂盒(#kl621)购自 Fermentas。First strandcDNAsynthesis:管中加入 RNAly I, oligo (dT) 18primerl μ I, RNase-free water I μ I,65 °C 处理 5min 后迅速冰浴冷却；然后再加 5XReaction buffer4 μ I, Ribolock RNaseinhibitor (20u/ul)I μ I,IOmM dNTP Μ χ2μ I, RevertAid H Minus M-MuLV ReverseTranscriptase (200u/μ I) I μ 1，42°C反应 60min ;70°C终止反应 5min，产物于 _20°C冰箱保存备用。
PCR检测:所用实验药品均购自中科瑞泰生物工程有限公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。我们设计了 2对引物，I对用于T-DNA插入检测(LPl:5' -TTTGTCGGTTACTTCCTTCCC-3' ,RPl:5/ -AGCAAGTTTGGTTGGATTGTG-3'并结合T-DNA左边界通用引物LBbl.3:5' -ATTTTGCCGATTTCGGAAC-3')，通过PCR鉴定获得纯合插入突变体。进一步设计 2 条引物:LP2:5' -ATTTCAGTACCCGTTTCGAGAC-3' ；RP2:5/ -CATCATCATCACCAGT TGGC-3 '，通过RT-PCR在mRNA水平上鉴定基因的敲除情况。PCR 反应体系如下:10X buffer buffer2 μ I, dNTP0.8 μ I, Primer LP/RP 各 Ιμ ，DNAl μ 1，dH2014 μ 1，Taq 酶 0.2 μ I。PCR 程序如下:94°C 3min ； (94°C 45sec ；58°C 45sec ；72°C 60sec) X30cycles ；72°C 5min。产物采用1% (ff/V)琼脂糖凝胶电泳分离，恒压100V电泳20min,用BIO-RAD凝胶成像扫描仪拍照记录检测结果。3.热胁迫处理:在含1%琼脂的固体MS培养基上生长5天的幼苗，转移到新的培养基中，野生型和突变体各转5-6株，排列整齐以便于观察表型。24h后置于烘箱中热激，热激条件为:38°C，lh30min ;22°C，4h ；48°C, lh30min ;22°C光照培养箱中生长10天后拍照。结果表 明热胁迫处理后突变体根长及地上部生物量积累均大于野生型，表现耐热表型。
权利要求
1.拟南芥热激转录因子基因HSFA3，其碱基序列如SEQID No. I。
2.权利要求I所述的拟南芥热激转录因子基因HSFA3编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2。
3.权利要求I所述的拟南芥热激转录因子基因HSFA3突变体的热胁迫处理方法及条件。
4.权利要求I所述的拟南芥热激转录因子基因HSFA3突变体在热胁迫处理下所获得的表型及其相关试验数据。
5.权利要求I所述的热激转录因子基因HSFA3，在制备耐热及其它抗性转基因植物中的应用。
全文摘要
本发明属于植物分子生物学与转基因相关技术领域。具体为拟南芥热激转录因子基因HSFA3抗高温功能的验证，以及该基因在抗高温植物新品种培育中的应用。本发明以模式植物拟南芥为材料，利用HSFA3基因T-DNA插入纯合突变体株系salk_011131研究HSFA3基因在植物抗高温方面的功能。实验结果显示HSFA3基因敲除突变体在热激胁迫下表现耐热表型，其根长和地上部生物量均显著大于野生型；说明HSFA3基因在植物应答热激胁迫的信号转导途径中具有重要的作用，预计该基因的过量表达可提高植物的耐热性并在植物抗逆分子育种中具有较大经济价值。
文档编号A01H5/00GK103255145SQ201310047409
公开日2013年8月21日 申请日期2013年2月6日 优先权日2013年2月6日
发明者徐江, 徐小栋, 东方阳, 鲁黎明, 王西瑶, 张少斌, 迟志海, 洪雪, 麻艳超, 赵明, 丁在松, 付金东 申请人:中国农业科学院作物科学研究所