专利名称：提高黄瓜子叶节离体再生及转化率的方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程，特别涉及一种通过筛选黄瓜最优苗态做外植体，提高黄瓜子叶节离体再生和转化率的方法。
背景技术：
黄瓜(Cucumis sativus L.),为葫芦科(Cucurbitaceae)甜瓜属，一年生蔓生或攀援草本植物。其果实食用方便，脆嫩多汁，风味独特，果菜兼用，营养价值极高，甚至可用于美容，深受现代人喜爱。近年来，黄瓜育种目标集中在品质、抗逆和抗病虫方面，以提高单位面积产量而获取更大的经济效益。由于黄瓜遗传基础狭窄，存在远缘杂交障碍，因此利用基因工程技术将是今后黄瓜品种改良的有效手段。此外，因黄瓜花性型分化多样，黄瓜已逐渐成为研究植物性型分化的模式材料。当前，越来越多的研究者加入到黄瓜分子育种和以黄瓜为研究材料的相关分子生物学研究领域。尤其是黄瓜基因组测序的完成，加速了黄瓜分子育种和相关分子生物学研究的进程，而植物基因工程则是进行上述研究的核心手段。目前，植物上一般采取以农杆菌介导的遗传转化系统进行转基因操作，因此，成熟且稳定的植物组织离体再生培养和遗传转化体系成为利用植物基因工程进行遗传改良和分子育种的瓶颈。黄瓜的离体再生培养和遗传转化研究始于1979年，影响黄瓜再生及遗传转化的因素诸多，包括基因型、外植体类型、苗态、植物生长调节剂、农杆菌菌株及活性、外力(如超声波的使用)、酚类物质的使用、预培养时间、侵染时间、共培养时间、芽诱导的选择压、生根选择压等。目前，研究者已对黄瓜子叶、子叶节、真叶、下胚轴、胚根等进行了再生植株的研究，但仍存在出芽率、再生率和转化率低下等一系列问题，严重阻碍了植物基因工程在黄瓜分子遗传改良上的应用。赵军良[1996，山西农业科学，黄瓜子叶组织培养再生植株]对六个黄瓜品种的子叶和下胚轴(培养基为BA 和NAA的MS培养基)进行了研究，结果发现子叶基部能直接分化出不定芽，而子叶的上部分则不能再生，下胚轴也不能分化，认为最适宜的黄瓜外植体为子叶节。侯爱菊[2003，园艺学报，诱导黄瓜直接器官发生主要影响因素的研究]和杜胜利[2000，天津农业科学，苗龄、基因型和外植体类型对黄瓜离体器官发生的影响]等也得到类似结果。在黄瓜子叶节离体再生系统中，ABA与激动素相配合可促进植株分化。Sekioka等研究表明在黄瓜的组织培养中，低浓度ABA可促进胚状体的正常发育[1981，Hort Science Differentiation in callus culture of cucumber(Cucumis sativusL.)]，控制胚状体处于球形胚或球形胚后期[陈峥等，2001，天津农业科学，提高黄瓜农杆菌遗传转化体系再生频率的研究]。在植物组织培养过程中，细胞生长会产生并累积乙烯，进而影响细胞的分化，硝酸银中Ag+为乙烯活性抑制剂，能竞争性地结合于乙烯作用部位，减轻了乙烯的作用，从而促进植物器官发生和体细胞胚胎发生[Mohiuddin A K M，1997，Plant Cell,Tissue and Organ Culture,Influences of silver nitrate oncucumber invitro shoot regeneration ;高武军,2002,中国农学通报,硝酸银在油菜基因转化中的影响作用]。曹利仙等研究表明，AgNO3能显著地提高黄瓜芽再生频率，以2.0mg/L AgNO3效果最为明显[2001，甘肃农业大学学报，硝酸银对黄瓜离体子叶培养芽再生的促进效应]。外植体的大小是影响子叶节再生频率的重要内在因素之一。外植体大小研究方面主要以苗龄为依据，认为最佳苗龄为l-7d的均有报道，由于同样苗龄的外植体，其生理状态并不相同，且一般情况下黄瓜种子的发芽率和发芽势也有差异，所以采用不同苗态黄瓜子叶节更趋合理。
发明内容
本发明的目的，是为了提供一种提高黄瓜子叶节离体再生及转化效率的方法，研究不同苗态对黄瓜遗传转化效率的影响情况，筛选出对黄瓜遗传转化最有利的苗态，及再生率高的最优培养基，丰富黄瓜离体再生体系，为今后黄瓜遗传转化体系的建立提供理论和技术基础。本发明所采取的技术方案如下:—种提高黄瓜子叶节离体再生及遗传转化率的方法，包括以下步骤:(I)选择两片子叶刚脱离种壳的黄瓜子叶节为外置体；(2)在步骤(I)所得黄瓜子叶节基部轻轻划上伤口 ；(3)将步骤(2)所得黄瓜子叶节接到芽诱导培养基中培养，该芽诱导培养基由MS培养基与6-BA、ABA、AgNO3配制而成，其中6-BA的浓度为1.5mg/L, ABA的浓度为0.5mg/L,AgNO3 的浓度为 2.0mg/L ；(4)将黄瓜子叶节接到芽诱导培养基后，经过芽诱导、伸长、生根，最后获得完整植株。上述方法中，所述MS培养基为含5.8g/L琼脂、30g/L蔗糖的培养基，pH为5.8。本发明以黄瓜子叶节作为外植体，研究了不同苗态对黄瓜离体再生及转化效率的影响，包括苗态的筛选、不同苗态下的gus瞬时表达、植物生长调节剂(在本方法中为芽诱导培养基)配比的优化。具体按下列步骤进行:1、苗态的筛选4种苗态定义为:⑴、子叶脱壳1/2-2/3 ；⑵、两片子叶刚脱离种壳；(3)、下胚轴直立，但子叶未展平；(4)、两片子叶初展平(参见图1)。剪下带l_2mm叶柄的子叶，每片子叶斜切去除生长点，并切除子叶上半部分的1/3-1/2，将子叶节近轴面朝上75度角斜插入芽诱导培养基中(MS+1.5mg/L 6-BA+1.5mg/L ABA+2.0mg/LAgN03)，每2周继代I次，待出芽后统计出芽外植体数、芽数，据此结果筛选出最优苗态。2、不同苗态下的gus瞬时表达将萌发到不同苗态的子叶切割，近柄端子叶节分别进行三种处理:(I)不划伤口 ；
(2)轻轻地划伤口 ；(3)较重地划伤口。之后接到芽诱导培养基上预培养ld，之后用含有pCAMBIA2301-gus表达载体的菌液(OD6tltl = 0.3-0.6)侵染20min，结束后转至共培养培养基上(芽诱导培养基+50 u mol/L乙酰丁香酮)培养3d，结束后将外植体转至含有卡那霉素(Kan)的芽诱导培养基(添加300mg/L特美汀以抑制农杆菌的生长)中选择培养，5d后，gus染色检测其瞬时表达率,确定最优预培养时间。gus染色方法:先将外植 体置于染色液(100mmol/L磷酸钠缓冲液,2mmol/LX_glue,2mmol/L铁氰化钾溶液，2mmol/L亚铁氰化钾溶液,0.5% (V/V)TritonX-100)中染色过夜，倒去染色液，加入丙酮:乙醇(I: 2，V/V)混合液中脱色过夜，解剖镜下观察染色情况并拍照。3、植物生长调节剂配比的优化以筛选的最佳苗态的子叶节为外植体进行切割，近轴面朝上75度角斜插入添加不同浓度6-BA (6-苄氨基腺嘌呤)和ABA (脱落酸)的MS培养基中(含5.8g/L琼脂，30g/L蔗糖，pH 5.8，下同)，添加适量AgNO3 (2.0mg/L AgNO3可显著提高芽再生频率)进行芽诱导。6-BA 设 3 个浓度梯度(1.0、1.5、2.0mg/L) ,ABA 设 4 个浓度梯度(0.5、2.0、1.5、2.0mg/L)，双因素互作，共12个处理组合。将外植体接到含6-BA和ABA的诱导培养基上，每2周继代I次，待出芽后统计出芽外植体数、芽数，根据结果选出优化培养基配方。待芽长至l_2cm时，将其切下接到1/2MS培养基至根部发达，计算从接种至获得完整植株所需时间。4、诱导率与平均出芽数的计算诱导率=出芽外植体数/外植体散X 100% ；平均出芽数=总芽数/出芽外植体数。全部数据采用SPSS 14.0 for Windows软件进行LSD统计分析。本发明的方法提供了提高黄瓜子叶节再生及转化效率的最佳苗态和芽诱导培养基，优化了黄瓜S52的子叶节再生体系，方法简单、易操作；同时培养出来的不定芽数目多、质量好、健壮、玻璃化低，再生率高，再生周期短。为黄瓜遗传转化和分子改良提供了坚实的技术支撑，对利用现代基因工程技术创新黄瓜种质和新品种将具有重要的现实意义。
图1是四种苗态，其中，(I)号苗态为子叶脱壳1/2-2/3 ; (2)号苗态为两片子叶刚脱离种壳；(3)号苗态为下胚轴直立，但子叶未展平；(4)号苗态为两片子叶初展平。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。1、无菌苗的获得黄瓜S52为华南品种，雌雄异花同株，取籽粒饱满且均匀的黄瓜种子，在清水中室温浸泡30min至lh，然后在超净工作台内用70%乙醇浸泡30s，再用1% NaClO溶液消毒IOmin,无菌水冲洗3-5次(每次3min)，之后在无菌水中浸泡4_5h，平铺于1/2MS培养基上，每瓶接15粒种子，培养温度25±1°C，黑暗条件下培养至种子露白后转至光下培养、萌发。培养温度25±1°C，光照时间16h，光照强度20001x。2、不同苗态对黄瓜子叶节再生的影响4种苗态定义为:⑴、子叶脱壳1/2-2/3 ；⑵、两片子叶刚脱离种壳；(3)、下胚轴直立，但子叶未展平；(4)、两片子叶初展平。每个处理组合20个外植体，共3次重复。剪下带l_2mm叶柄的子叶，每片子叶斜切去除生长点，并切除子叶上半部分的1/3-1/2，将子叶节近轴面朝上75度角斜插入芽诱导培养基中(MS+1.5mg/L6-BA+l.5mg/LABA+2.0mg/L AgNO3)，每2周继代I次，待出芽后统计出芽外植体数、芽数，如表I所示，据此结果筛选出最优苗态。从表I可看出，不同苗态的黄瓜外植体丛生芽诱导率不同，黄瓜外植体过小或过大时的再生频率及平均每块外植体出芽数均较低。(I)至(3)苗态的子叶节均能高频诱导出不定芽，其中苗态(2)时的再生频率及每块外植体再生芽数最高，再生频率高达100%，平均出芽数达到4.13，显著高于其他苗态。苗态(4)时的诱导率(48.33% )及每块外植体再生芽数(0.48)最低，显著低于其他苗态。综上所述，选择苗态(2)的子叶节为最佳外植体苗态。表I不同苗态外植体对黄瓜子叶节再生的影响
权利要求
1.一种提高黄瓜子叶节离体再生及遗传转化率的方法，包括以下步骤: (1)选择两片子叶刚脱离种壳的黄瓜子叶节为外置体； (2)在步骤(I)所得黄瓜子叶节基部轻轻划上伤口； (3)将步骤(2)所得黄瓜子叶节接到芽诱导培养基中培养，该芽诱导培养基由MS培养基与6-BA、ABA、AgNO3配制而成，其中6-BA的浓度为1.5mg/L,ABA的浓度为0.5mg/L, AgNO3的浓度为2.0mg/L ； (4)将黄瓜子叶节接到芽诱导培养基后，经过芽诱导、伸长、生根，最后获得完整植株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述MS培养基为含5.8g/L琼脂、30g/L蔗糖的培养基，pH为 5.8。
全文摘要
一种提高黄瓜子叶节离体再生及转化率的方法，包括以下步骤(1)选择两片子叶刚脱离种壳的黄瓜子叶节为外置体；(2)在黄瓜子叶节基部轻轻划上伤口；(3)将黄瓜子叶节接到芽诱导培养基中培养；(4)经过芽诱导、伸长、生根，最后获得完整植株。本发明的方法提供了提高黄瓜子叶节再生及转化效率的最佳苗态和芽诱导培养基，优化了黄瓜S52的子叶节再生体系，方法简单、易操作；同时培养出来的不定芽数目多、质量好、健壮、玻璃化低，再生率高，再生周期短。为黄瓜遗传转化和分子改良提供了坚实的技术支撑，对利用现代基因工程技术创新黄瓜种质和新品种将具有重要的现实意义。
文档编号A01H4/00GK103098714SQ201310064149
公开日2013年5月15日 申请日期2013年2月28日 优先权日2013年2月28日
发明者蔡润, 别蓓蓓, 潘俊松, 何欢乐 申请人:上海交通大学