专利名称：北虫草最佳组织分离期筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种北虫草，特别涉及一种北虫草最佳组织分离期筛选方法。
背景技术：
北冬虫夏草又称北虫草、蛹虫草，隶属于子囊菌门，盘菌亚门，粪壳菌纲，肉座菌目，麦角菌科虫草属。目前世界上已发现虫草属真菌400多种，我国记录有100种。北虫草是虫草属真菌的模式种，其宿主主要为鳞翅目的蚕蛾科、舟蛾科、天蚕蛾科等，它是由子座(即草部分)与菌核(即虫或蛹的尸体部分)两部分组成的复合体子座有单生或数个，从寄主头部或节部长出，呈橙黄色。冬季幼虫蛰居土里，菌类寄生其中吸收营养，最后其体内充满菌丝而死，而蛹虫尸体却完好无损；到了夏季，自其尸体之上生出“幼苗”(子实体)，形似草，夏至前后采集而得其主要分布在吉林、辽宁、陕西、河北、辽宁、湖北、广东等地。北虫草是冬虫夏草的同属异种真菌，两者的化学成分和营养成分以及药用功效都十分相似，北冬虫夏草中的虫草素、虫草酸、虫草多糖和蛋白质含量明显高于天然冬虫夏草，其含量分别为冬虫夏草的29倍、27倍和32倍，而氨基酸含量基本接近，食用和药用价值可与天然冬虫夏草相媲美，是天然冬虫夏草的理想代用品。20世纪90年代以来，对作为药物和保健产品的北虫草的药化、药理、毒理和毒性进行了大量的研究和安全评价、证明了人工栽培的北虫草无毒副作用，它具有滋补强身、补肺益肾、镇静、平喘、抗心率失常、抗疲劳、抑制疡细胞、治疗肺结核、抗疲劳、抗肿瘤、抑制癌细胞等特殊功效，而且可以增强机体免疫功能，可以与人参、鹿茸相媲美，再加上资源奇缺，采集困难，因此，有“国宝”之誉。北冬虫夏草和冬虫夏草是我国最常见的分布最广的药用价值极高的两种虫草菌，国外也对北冬虫夏草进行了研究。20世纪60年代，加拿大、美国、德国等，已对虫草进行研究，日本于1900年成立了“北冬虫夏草研究会”与中国医学专家互相交流，使北虫草的研究取得了较快的发展。野生的北冬虫夏草在自然界数量很少，价格昂贵。北虫草人工栽培驯化已获得成功，可进行商·业化生产，但生产中所使用的菌种大多是用野生虫草分离得到的，关于北虫草组织分离的报道很少，而北虫草生长发育不同时期组织分离母种的研究则更是未见报道。
发明内容
本发明的目的就在于提供一种长速最快、长势最好、转色最快、转色效果较好的北虫草最佳组织分离期筛选方法。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的:本发明的北虫草最佳组织分离期筛选方法，选用北虫草子实体的五个不同生长发育期，即原基、子实体生长15天、子实体生长30天、子实体生长45天、子实体生长60天的组织进行母种分离，以便筛选最优的组织分离材料，该筛选方法具体步骤如下:(I)选取培养基与配制配方:马铃薯200g、琼脂20g、葡萄糖20g、蛋白胨5g、酵母片5g、K2HPO40.5g、pH自然、水1000ml，其配制方法是:先将配方中各组分用电子天平称量好，然后将称好的马铃薯切成条状，放入沸水中煮20-30分钟，期间用玻璃棒不断搅拌，以防马铃薯被煮焦；再将煮好的马铃薯用纱布过滤两遍，取滤液；然后将滤液放到电磁炉上边加热边将琼脂加入其中，并用玻璃棒不断搅拌，最后将其它成分依次加入其中；待各种组分充分溶解后，定容至1000ml,用180mmX 18mm的试管分装,每支试管分装8ml,加盖棉塞，并盖几层报纸，置高压灭菌锅内灭菌，121°C维持30分钟，然后取出摆斜面，冷却，无菌检验后待用;(2)组织分离，北虫草母种分离材料的选取与采样:分离材料选取的前提条件是栽培中未被污染，分别在五个不同生长发育时期选取生长发育良好的虫草作为组织分离的材料，具体方法如下，原基时期的选取原基较多、分布均匀的栽培瓶，子实体时期的选取虫草形态良好，生长健壮的子实体，将选好的栽培瓶放入无菌操作室内待用；组织分离接种与培养:接种前将接种所用工具及摆好斜面的培养基试管放到超净工作台中，然后将接种室和超净工作台中的紫外灯打开，照射30分钟之后暗处理20分钟，在超净工作台内用酒精棉球擦拭双手和栽培瓶外表，然后在酒精灯火焰旁打开栽培瓶的封口膜，原基直接用接种锄挑取一小块接入到培养基中央，对于其他时期的分离材料，用无菌剪刀剪取虫草子实体上端一小截，然后用接种锄接入到培养基上，每一时期的虫草分别接10支，然后置于恒温培养箱内23°C下培养，每天定时观察，记录不同时期的组织块在培养基上的定植萌发及菌丝生长情况；(3)转色，将培养完成的长满菌丝体的试管置于温度为20°C有散射光照射的环境中进行转色，每天定时进行观察，记录不同时期的转色速度，七日后观察不同时期的转色率；(4)第(2)、⑶步骤重复三次。与现有技术相比，本发明的优点在于:北虫草不同时期组织分离得到的菌丝体生长情况差异显著，得到了较为理想的北虫草母种组织分离时期。北虫草原基期进行组织分离得到的母种菌丝体生长速度最快，为3.18mm/d，与其它四个时期组织分离得到的母种菌丝体生长速度有极显著差异，该时期分离得到的菌丝体长势也明显优于其它四个时期分离得到的母种菌丝体，菌丝体生长整齐、纯白、浓密、转色效果好，为北虫草最佳的组织分离期。
具体实施例方式下面将结合附图
对本发明作进一步说明。实施例:本发明的北虫草最佳组织分离期筛选方法，选用北虫草子实体的五个不同生长发育期，即原基、子实体生长15天、子实体生长30天、子实体生长45天、子实体生长60天的组织进行母种分离，以便筛选最优的组织分离材料，该筛选方法具体步骤如下:(I)选取培养基与配制配方:马铃薯200g、琼脂20g、葡萄糖20g、蛋白胨5g、酵母片5g、K2HPO40.5g、pH自然、水1000ml，其配制方法是:先将配方中各组分用电子天平称量好，然后将称好的马铃薯 切成条状，放入沸水中煮20-30分钟，期间用玻璃棒不断搅拌，以防马铃薯被煮焦；再将煮好的马铃薯用纱布过滤两遍，取滤液；然后将滤液放到电磁炉上边加热边将琼脂加入其中，并用玻璃棒不断搅拌，最后将其它成分依次加入其中；待各种组分充分溶解后，定容至IOOOml,用180mmX 18mm的试管分装,每支试管分装8ml,加盖棉塞，并盖几层报纸，置高压灭菌锅内灭菌，121°C维持30分钟，然后取出摆斜面，冷却，无菌检验后待用;(2)组织分离，北虫草母种分离材料的选取与采样:分离材料选取的前提条件是栽培中未被污染，分别在五个不同生长发育时期选取生长发育良好的虫草作为组织分离的材料，具体方法如下，原基时期的选取原基较多、分布均匀的栽培瓶，子实体时期的选取虫草形态良好，生长健壮的子实体，将选好的栽培瓶放入无菌操作室内待用；组织分离接种与培养:接种前将接种所用工具及摆好斜面的培养基试管放到超净工作台中，然后将接种室和超净工作台中的紫外灯打开，照射30分钟之后暗处理20分钟，在超净工作台内用酒精棉球擦拭双手和栽培瓶外表，然后在酒精灯火焰旁打开栽培瓶的封口膜，原基直接用接种锄挑取一小块接入到培养基中央，对于其他时期的分离材料，用无菌剪刀剪取虫草子实体上端一小截，然后用接种锄接入到培养基上，每一时期的虫草分别接10支，然后置于恒温培养箱内23°C下培养，每天定时观察，记录不同时期的组织块在培养基上的定植萌发及菌丝生长情况；(3)转色，将培养完成的长满菌丝体的试管置于温度为20°C有散射光照射的环境中进行转色，每天定时进行观察，记录不同时期的转色速度，七日后观察不同时期的转色率；(4)第(2)、⑶步骤重复三次。通过上述步骤得出以下表格，表I不同时期组织分离母种菌丝体生长情况及多重比较结果单位mm/d
权利要求
1.一种北虫草最佳组织分离期筛选方法，其特征在于，选用北虫草子实体的五个不同生长发育期，即原基、子实体生长15天、子实体生长30天、子实体生长45天、子实体生长60天的组织进行母种分离，以便筛选最优的组织分离材料，该筛选方法具体步骤如下 (1)选取培养基与配制配方马铃薯200g、琼脂20g、葡萄糖20g、蛋白胨5g、酵母片5g、K2HPO4O. 5g、pH自然、水1000ml，其配制方法是先将配方中各组分用电子天平称量好，然后将称好的马铃薯切成条状，放入沸水中煮20-30分钟，期间用玻璃棒不断搅拌，以防马铃薯被煮焦；再将煮好的马铃薯用纱布过滤两遍，取滤液；然后将滤液放到电磁炉上边加热边将琼脂加入其中，并用玻璃棒不断搅拌，最后将其它成分依次加入其中；待各种组分充分溶解后，定容至1000ml,用180mmX 18mm的试管分装,每支试管分装8ml,加盖棉塞,并盖几层报纸，置高压灭菌锅内灭菌，121°C维持30分钟，然后取出摆斜面，冷却，无菌检验后待用； (2)组织分离，北虫草母种分离材料的选取与采样分离材料选取的前提条件是栽培中未被污染，分别在五个不同生长发育时期选取生长发育良好的虫草作为组织分离的材料，具体方法如下，原基时期的选取原基较多、分布均匀的栽培瓶，子实体时期的选取虫草形态良好，生长健壮的子实体，将选好的栽培瓶放入无菌操作室内待用；组织分离接种与培养接种前将接种所用工具及摆好斜面的培养基试管放到超净工作台中，然后将接种室和超净工作台中的紫外灯打开，照射30分钟之后暗处理20分钟，在超净工作台内用酒精棉球擦拭双手和栽培瓶外表，然后在酒精灯火焰旁打开栽培瓶的封口膜，原基直接用接种锄挑取一小块接入到培养基中央，对于其他时期的分离材料，用无菌剪刀剪取虫草子实体上端一小截，然后用接种锄接入到培养基上，每一时期的虫草分别接10支，然后置于恒温培养箱内23°C下培养，每天定时观察，记录不同时期的组织块在培养基上的定植萌发及菌丝生长情况； (3)转色，将培养完成的长满菌丝体的试管置于温度为20°C有散射光照射的环境中进行转色，每天定时进行观察，记录不同时期的转色速度，七日后观察不同时期的转色率； (4)第(2)、(3)步骤重复三次。
全文摘要
本发明公开了一种北虫草最佳组织分离期筛选方法，选用北虫草子实体的五个不同生长发育期，即原基、子实体生长15天、子实体生长30天、子实体生长45天、子实体生长60天的组织进行母种分离，以便筛选最优的组织分离材料，通过上述筛选方法可以得出，北虫草生长至原基时期组织分离得到的母种菌丝体长速最快、长势最好、转色最快、转色效果最好，所以北虫草生长至原基时是最适合做母种组织分离的时期，原因是与北虫草生长不同时期的菌丝体细胞活力有关，原基时期的菌丝体细胞分化程度最低，细胞活力最高，在这个时期进行组织分离得到的母种活力最好，长势也最好。
文档编号A01G1/04GK103250566SQ201310185768
公开日2013年8月21日 申请日期2013年5月20日 优先权日2013年5月20日
发明者贺晓龙, 任桂梅, 高小朋, 邓振山, 刘佳, 王殿振, 刘年强, 郝文娟 申请人:延安大学