水稻转录因子Os01g36630基因CDS序列的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及水稻转录因子Os01g36630基因CDS序列的应用，其是利用转录因子激活基序VP64与水稻转录因子Os01g36630融合构建得到组成型转录因子，并将编码所述组成型转录因子的基因转化到农作物如水稻中，从而改良水稻籽粒性状，例如增加水稻籽粒长度。对于详细阐明调控种子发育机理具有重要的理论价值，并且可以通过转基因手段，改良水稻的粒型，因此在生产实践中也具有重要意义。
【专利说明】水稻转录因子0s01g36630基因 CDS序列的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及水稻转录因子0s01g36630基因⑶S序 列的应用。
【背景技术】
[0002] 水稻（Oryza sativa L.)是我国和全世界最重要的三大粮食作物之一，是世界一 半以上人口的主食，也是一个重要的功能基因研究的模式植物。与其相关的遗传学和分子 生物学研究一直倍受研究者的重视，转录水平的调控是基因表达调控的重要方式。当前水 稻增产的研究较依赖于有限的水稻种质资源，传统的杂交育种优势正在逐渐减弱，而水稻 转基因技术有可能发掘水稻进一步增产的潜力。
[0003] 在植物界中，能形成种子的植物约占植物总数的三分之二以上，作为重要的繁殖 器官，种子同时也为人们提供食物来源，水稻就是其中的重要代表，种子来源于受精后的胚 珠。从分子生物学的角度来说，种子的发育和萌发是一个有次序的、选择性的基因表达过 程。而转录因子在基因表达的精确调控中起到了关键性的作用。
[0004] 禾谷类作物的产量很大程度上取决于其籽粒的大小，因此水稻籽粒性状的基因调 控是重要的研究领域。Jumonji(JMJ)家族转录因子主要调控组蛋白的甲基化，组蛋白修饰 酶，包括组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylases，HDACs),组蛋白甲基转移酶（Histone methyltransferases，HMTs),以及组蛋白去甲基化酶（Histonedemethylase，HDMs)等，在 动植物发育过程中发挥着重要的作用。然而在单子叶植物模式物种水稻中，对这些修饰酶 的功能研究还相对较少。植物中第一个报道的具有去甲基化酶活性的jmjC家族基因是 IBMlQncrease in BONSAI methylation，JMJ25)。通过筛选 EMS 诱变的突变体库，检测可 以使BNS (BONSAI)基因的DNA甲基化升高的突变体，Saze等克隆了一个含有jmjc结构域的 基因 IBMl，其突变失活后引起多种表型，包括叶片卷曲变小，植株矮小，种子发育异常等，还 引起BNS基因 DNA甲基化增加，另外还证实IBMl可执行H3K9去甲基化酶的功能（Saze H， Shiraishl A,Miura A,Kakutanl T. (2008)Control of genic DNA methylation by ajmjC domain-containing protein in Arabidopsis thaliana. Science.)〇
[0005] 组蛋白赖氨酸甲基化是一个重要的表观遗传修饰，即可以激活也可以抑制相关基 因的表达。研究表明，在植物以外的模式系统中，含有Jumonji C(jmjC)结构域的蛋白可以 去除组蛋白甲基化。中国学者证明了在植物里含有jmjC结构域的蛋白与哺乳动物的同源 蛋白相比在功能上既有保守性也有特异性。特别是属于JMJD2家族的水稻jmjC基因 JMJ706 编码了一个异染色质富集蛋白。JMJ706蛋白能够在体外特异的去除组蛋白H3K9的二甲基 化和三甲基化。功能缺失突变体表现为H3K9的二甲基化和三甲基化增加，并影响了小穗发 育，同时伴有花器官形态和数目的改变。基因表达及组蛋白修饰分析实验证明了 JMJ706蛋 白调控一小组花发育调节基因。综合实验结果，表明水稻中JMJ706基因编码一个异染色质 相关的H3K9去甲基化酶，并在水稻花发育过程中起调控作用（Qianwen Sun and Dao-Xiu Zhou. (2008)Rice jmjC domain-containing gene JMJ706encodes H3K9demethyIase required for floral organ development. PNAS.XJMJ706 为定位在异染色质区域的核蛋 白，其突变后引起水稻花器官发育异常并导致H3K9me2及me3甲基化修饰程度积累。JMJ706 全长cDNA互补转化其突变体jmj6后，转基因植株花发育异常的表型得以恢复：amiRNA抑 制野生型JMJ706基因后，可产生类似jmj6的表型(孙前文.（2009)水稻组蛋白末端修饰 酶基因的功能研究，华南农业大学博士论文)。JMJ家族的另外一个基因 JMJ703,是水稻中 一种活性H3K4特异性去甲基酶，能特异的降低组蛋白H3K4的甲基化水平，参与控制转座子 的活性。JMJ703功能丧失性突变体具有多种表型，表现为植株矮化，倒一、二、三节间明显 比野生型短，叶片直立，二级枝梗减少，突变体种子长、宽以及厚度都减少（Xiekui Cui. et al. (2013)Control of transposon activity by a histone H3K4demethylase in rice. Proc Natl Acad Sci USA)。总之，控制水稻籽粒发育是一个复杂过程，涉及到多基因多条 途径的协调控制，目前发现调控该性状的基因不多，调控籽粒发育的分子机理尚未阐明，因 此，寻找控制籽粒性状发育的基因和新的发掘手段对作物改良并提高作物产量具有重要意 义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供水稻转录因子0s01g36630基因⑶S序列的应用。
[0007] 为了实现本发明目的，本发明首先提供一种组成型水稻转录因子，即融合蛋白 (VP16) 4-Linker-0s01g36630。
[0008] 其中，VP16为来自单纯疱疹病毒的VP16蛋白，将4个VP16功能域基序融合在一起 可构成一类增强子，增强转录因子的功能，从而在转基因植株中出现更明显的表型变化。上 述融合蛋白中涉及的（VP16) 4，即VP64是由4个VP16蛋白的氨基酸序列以Gly-Ser为间隔 形成的融合蛋白，其氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 4所示。
[0009] 上述融合蛋白中涉及的Linker由39个柔性氨基酸串联而成，其氨基酸序列如SEQ ID No. 9所示，编码该Linker的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
[0010] 上述融合蛋白中涉及的0s01g36630为水稻转录因子0s01g36630,其氨基酸序列 如SEQ ID No. 2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能 的氨基酸序列；水稻转录因子0s01g36630基因的⑶S序列为：SEQ ID No. 1所示的核苷酸 序列。
[0011] 本发明还提供编码所述组成型水稻转录因子的基因，以及在严格条件下，可与该 基因的核苷酸序列发生杂交的核苷酸序列。
[0012] 本发明还提供含有编码所述组成型水稻转录因子的基因的载体、工程菌及细胞 系。
[0013] 所述载体的构建方法如下：
[0014] (1)在植物转录因子数据库（http://rice, plantbiology. msu. edu/analyses_ search_locus. shtml)中找到0s01g36630基因，根据其序列设计PCR扩增引物对，其为正向 引物F :5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGTCGATGCGGGAGITT-3' 和反向引物 R :5' -CAAGAAAGCTGGGTC CTATCTATCAGAGAGAGCA-3' 。
[0015] (2)以野生日本晴'kitaake'水稻总cDNA为模板，利用上述引物F和R进行PCR， 获得0s01g36630基因完整的CDS序列。
[0016] (3)将上述PCR产物克隆到pDONER克隆载体上，经测序鉴定得到与目的基因完全 相同的序列。
[0017] (4)以植物双元表达载体pCambial301_UbiN (图6)左右边界包含的序列为骨架 序列，通过体外重组，将ubi promoter-VP64-Gateway表达单兀、35S promoter-asRED表达 单元和35S promoter-hyg表达单元与之融合构建，得到载体nVP64-hyg-asRED的全序列如 SEQ ID No. 5 所示。
[0018] (5)通过LR反应将0s01g36630基因的CDS序列构建到其目的基因的5'端连有 VP64编码基因的植物表达载体nVP64-hyg-asRED上，获得携带有编码所述组成型水稻转录 因子 VP64-Linker-0s01g36630 基因的表达载体 ubi :VP64-0s01g36630,其全序列如 SEQ ID No. 6所示。
[0019] 上述表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿 孔等常规生物技术方法导入植物细胞中（Weissbach，1998, Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第 411-463 页；Geiserson 和 Corey，1998, Plant Molecular Biology,2nd Edition)。
[0020] 本发明还提供一种转基因水稻植株的构建方法，具体为：采用农杆菌介导的方法， 将上述表达载体转入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的AAM培养液进行转化，转化 后的材料经过共培养-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选转基因水稻植株。
[0021] 本发明还提供编码所述组成型水稻转录因子的基因在改良水稻籽粒性状(例如增 加水稻粒长及千粒重）中的应用。
[0022] 本发明还提供了用于扩增水稻转录因子0s01g36630基因⑶S序列的引物对，包括 正向引物 F : 5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGTCGATGCGGGAGITT-3' 和反向引物 R : 5' -CAAGAAAGCTG GGTCCTATCTATCAGAGAGAGCA-3' 。
[0023] 本发明进一步提供水稻转录因子0s01g36630基因⑶S序列在调控水稻籽粒性状 中的应用。利用转录因子激活基序VP64(SEQ ID No. 10)与水稻转录因子0s01g36630融合 构建得到组成型转录因子，并将编码所述组成型转录因子的基因转化到农作物如水稻中， 从而改良转基因水稻籽粒的性状。
[0024] 前述的应用，是将水稻转录因子0s01g36630基因的⑶S序列构建到转录因子激活 基序VP64编码基因 （SEQ ID No. 4)的下游，转化水稻，从而改良转基因水稻籽粒的性状。优 选将水稻转录因子0s01g36630基因的CDS序列通过Gateway系统转录因子激活基序VP64 编码基因的下游。
[0025] 本发明首次利用转录因子激活基序VP64 (即4个转录因子激活基序VP16)与水稻 转录因子0s01g36630融合构建得到组成型转录因子，并将编码所述组成型转录因子的基 因转化到农作物如水稻中，从而改良水稻籽粒性状，例如水稻籽粒长度的增加。对于详细阐 明调控种子发育机理具有重要的理论价值，并且可以通过转基因手段，改良水稻的粒型，因 此在生产实践中也具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1为本发明实施例1中nVP64-hyg_asRED载体图谱。
[0027] 图2为本发明实施例1中ubi :VP64-0s01g36630载体图谱。
[0028] 图3为本发明实施例3中PCR检测VP64_0s01g36630转基因阳性株系，其中WT为 野生型水稻 'kitaake'，NV0584H-27、NV0584H-29 为 VP64-0s01g36630 转基因水稻株系。
[0029] 图4为本发明实施例4中转基因水稻籽粒性状的表型长度的比较；其中WT为野生 型水稻 'kitaake'，NV0584H-27、NV0584H-29 为 VP64-0s01g36630 转基因水稻株系。
[0030] 图5为本发明实施例4中转基因水稻籽粒性状的数据统计分析结果；其中WT为野 生型水稻 'kitaake'，NV0584H-27、NV0584H-29 为 VP64-0s01g36630 转基因水稻株系。
[0031] 图6为本发明实施例1中pCambial301_UbiN载体图谱。
【具体实施方式】
[0032] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0033] 实施例1
[0034] 0s01g36630基因⑶S序列的获得及植物表达载体的构建
[0035] 10s01g36630基因 CDS序列的获得
[0036] 在植物转录因子数据库（http://rice. plantbiology. msu. edu/analyses_ search_locus. shtml)中找到0s01g36630基因，根据其序列设计PCR扩增引物，正向引物 F :5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGTCGATGCGGGAGTTT-3' 和反向引物 R :5' -CAAGAAAGCTGGGTCCTAT CTATCAGAGAGAGCA-3'。以野生型日本晴'kitaake'水稻总cDNA为模板，利用引物F和R进 行PCR，获得0s01g36630基因完整的CDS序列（如SEQ ID No. 1所示)。
[0037] 2植物表达载体的构建
[0038] 将水稻转录因子0s01g36630基因的CDS序列通过Gateway系统构建到4个转录 因子激活基序VP16编码基因（如SEQ ID No. 4所示）的下游。
[0039] 2. 1将上述PCR产物克隆到pDONER克隆载体上
[0040] 按照PrimeSTAR聚合酶扩增体系和反应程序进行PCR。此过程中包含两轮 PCR，第一轮PCR的引物用加部分adaptor attB接头的基因引物（F和R)，而第二轮的 模板用第一轮的PCR产物，并且引物用完整的adaptor attB引物（attB5' adaptor : 5'-GTGGGGACAAGTTTG TACAAAAAAGCAGGCTTC-3'，attB3' adaptor :5'-GTGGGGACCAC TTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3'）。将 PCR 产物克隆到 pDONER 克隆载体(购自 Invitrogen)上， 经测序鉴定得到与目的基因完全相同的序列。
[0041] 2. 2植物表达载体的构建
[0042] 以植物双元表达载体pCambial301_UbiN (图6)左右边界包含的序列为骨架序列， 通过体外重组，将ubi promoter-VP64-Gateway表达单兀、35S promoter-asRED表达单兀和 35S promoter-hyg表达单元与之融合构建，得到载体nVP64_hyg_asRED的全序列如SEQ ID No. 5所示，载体图谱见图1。
[0043] 表达载体nVP64-hyg_asRED含有Gateway重组系统，pDONR带有目的基因的质粒 作为入门载体（Entery vector),通过LR反应可完成目的基因表达载体的构建。
[0044] 通过LR反应将0s05g27980基因的CDS序列构建到其目的基因的5'端连有VP64 编码基因的植物表达载体nVP64-hyg-asRED上，获得携带有编码所述组成型水稻转录因 子 VP64-Linker-0s05g27980 基因的表达载体 ubi :VP64-0s05g27980,其全序列如 SEQ ID No. 6所示，载体图谱见图2。
[0045] LR反应体系如下：
[0046] 表达载体 lyl(30-50ng)
[0047] 入门载体（pDONR-gene) 1 μ I (30_50ng)
[0048] LR Clonase Enzyme Mix I μ I
[0049] ddH20 2 μ I
[0050] 总体积 5μ I
[0051] 于25°C反应过夜。用反应体系转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆。
[0052] 实施例2转基因水稻植株的获得
[0053] 取水稻'kitaake'成熟种子，人工或机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子经消毒 之后接种到诱导培养基上进行诱导培养。选择外观良好，生长力好的水稻愈伤组织为受体 材料，采用农杆菌介导法将ubi :VP64-0s01g36630转入水稻愈伤组织中，用含有100 μ M的 乙酰丁香酮和OD值为0. 7的农杆菌的AAM培养液进行转化，将转化液浸泡过的愈伤组织置 于共培养基上进行共培养，25°C暗培养3d后置于筛选培养基上培养约30d，每IOd继代一 次。然后将筛出的抗性愈伤转移到分化培养基上分化约20d，每IOd继代一次。将分化出绿 色小苗的抗性愈伤转移到生根培养基上生根，待约7d长出发达根系后炼苗，并计算转化所 获转基因苗数。炼苗7d后转移至大田生长。获得30株转基因苗。
[0054] 本实施例中涉及的培养基配方如下：
[0055] 诱导培养基：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+铜钴母液+2. 5mg/L2, 4D+0. 6g/L 酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L鹿糖，以水配制，调pH至5. 8? 5. 9后加入植物凝胶4g/L。
[0056] 共培养基：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+2. 5mg/L2, 4D+0. 5g/L谷氨酰胺 +0. 6g/L酸水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L鹿糖，以水配制，调pH至5. 2后加入植物凝胶 4g/L。灭菌后，50°C左右加入AS (乙酰丁香酮）100?200yg/mL。
[0057] 筛选培养基：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+铜钴母液+2. 5mg/L2, 4D+0. 6g/L 酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L鹿糖，以水配制，调pH至5. 8? 5. 9后加入植物凝胶4g/L。灭菌后加入35mg/L潮霉素(购自上海纽津生物技术有限公司）。
[0058] 分化培养基：MS无机+MS-B5微量+MS有机+铁盐+MS-铜钴母液+0. 05mg/L NAA+2. Omg/L Kinetin (激动素）+30g/L山梨醇+2g/L水解酪蛋白+30g/L鹿糖，以水配制， 调pH至5. 8?5. 9后加入植物凝胶4g/L。
[0059] 实施例3转基因阳性株系的鉴定
[0060] 为检测实施例2获得的VP64-0s01g36630转基因水稻株系中ubi : VP64-0s01g36630基因在T2代转基因水稻（NV0584H-27、NV0584H-29)中的过表达情况，本 实施例在载体与目的基因接头处设计引物（正向引物：5' -GTGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAG GCTTC-3' 和反向引物：5'-GTGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3'）进行 PCR 检测，得到了 明显的特异性条带。由图3可见，扩增出的条带大小在IOOObp以上，且引物是在载体与目 的基因接头处设计的，扩增出的片段大小与目的基因（1188bp)基本一致。因此可以说明， 实施例2获得的转基因水稻株系NV0584H-27、NV0584H-29中含有VP64-0s01g36630融合基 因。
[0061] 实施例4转基因水稻表型分析和考种分析
[0062] 将实施例2获得的转基因水稻株系NV0584H-27、NV0584H-29和野生型水稻种子进 行比较，从表型上可以明显的看出，发现转基因材料的籽粒明显变长（图4)。考种数据分析 表明（图5)，本发明获得的VP64-0s01g36630转基因水稻籽粒的粒长显著大于野生型水稻 籽粒。
[0063] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1. 一种组成型水稻转录因子，其特征在于，其为融合蛋白（VP16)4~Linker-〇s01g36630 ； 其中，VP16为来自单纯疱疹病毒的VP16蛋白，（VP16)4是由4个VP16蛋白的氨基酸 序列以Gly-Ser为间隔形成的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No. 10所示；Linker由39 个柔性氨基酸串联而成，其氨基酸序列如SEQ ID No. 9所示；0s01g36630为水稻转录因子 0s01g36630,其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个 氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2. 编码权利要求1所述组成型水稻转录因子的基因。
3. 含有权利要求2所述基因的载体。
4. 含有权利要求2所述基因的工程菌。
5. -种转基因水稻植株的构建方法，其特征在于，采用农杆菌介导的方法，将权利要求 3所述的载体转入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的AAM培养液进行转化，转化后的 材料经过共培养-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选转基因水稻植株。
6. 权利要求2所述的基因在改良水稻籽粒性状中的应用。
7. 用于扩增水稻转录因子0s01g36630基因CDS序列的引物对，其特征在于， 包括正向引物 F :5'-CAAAAAAGCAGGCTTCATGTC GATGCGGGAGITT-3' 和反向引物 R : 5'-CAAGAAAGCTGGGTCC TATCTATCAGAGAGAGCA-3' ； 其中，水稻转录因子0s01g36630基因的⑶S序列为： SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
8. 水稻转录因子0s01g36630基因CDS序列在调控水稻籽粒性状中的应用。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，其是利用转录因子激活基序VP64与水稻 转录因子0s01g36630融合构建得到组成型转录因子，并将编码所述组成型转录因子的基 因转化水稻，从而改良转基因水稻籽粒的性状； 其中，所述转录因子激活基序VP64的氨基酸序列如SEQ ID No. 10所示。
10. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，其是将水稻转录因子0s01g36630基因 的⑶S序列通过Gateway系统构建到转录因子激活基序VP64编码基因的下游，转化水稻， 从而改良转基因水稻籽粒的性状； 其中，所述转录因子激活基序VP64编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。
【文档编号】A01H5/00GK104371023SQ201310351663
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年8月13日 优先权日:2013年8月13日
【发明者】刘斌, 张宫璞, 刘军, 赵涛, 李宏宇, 林辰涛 申请人:中国农业科学院作物科学研究所