一种利用温度处理提高白桦丛生苗总三萜、齐墩果酸和黄酮含量的方法
【专利摘要】本发明属于生物工程领域，具体涉及一种利用温度处理提高白桦丛生苗中总三萜、齐墩果酸和黄酮含量的方法。以白桦愈伤组织接种于NT+2mg/L6-BA的固体培养基诱导白桦丛生苗，继代两次后转移至NT+0.5mg/L6-BA固体培养基，筛选获得总三萜含量高的白桦丛生苗。将上述筛选丛生苗接种于相同液体培养基中，接种量为5g/100ml，震荡培养第七天分别进行高温45℃和低温4℃胁迫处理，此后24h-48h收获，检测丛生苗中总三萜、总黄酮和齐墩果酸含量。两种温度胁迫处理总三萜含量可比对照提高49.20%～5.03倍，最高含量可达59.66mg/g；齐墩果酸含量比对照提高3.68倍～10.56倍，最高含量可达2.33mg/g；总黄酮含量比对照提高10%～38.37%，最高可达4.0mg/g。该申请发明无污染、低成本、可操作性强，效率高，为解决天然植物药物来源紧缺和工业化大规模生产白桦总三萜和齐墩果酸药物提供了一种新技术。
【专利说明】一种利用温度处理提高白桦丛生苗总三萜、齐墩果酸和黄酮含量的方法
所属【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程领域，具体涉及一种利用温度处理提高白桦丛生苗总三萜、黄酮和齐墩果酸含量的方法。
【背景技术】
[0002]白桦三萜作为最有潜力的新型药物制剂，具有更为广阔的应用前景。然而，目前使用的白桦三萜药物主要来自桦树皮及其人工化学合成，数量少、化学合成效率低、成本高等因素是制约白桦三萜不能进行临床大规模应用的主要原因。
[0003]由于利用植物组织或器官发酵培养生产植物天然活性物质具有不受气候、病虫害等自然条件的影响，而且不占用土地，不消耗自然资源，生产周期短和人为可控等优点，因而被认为是解决植物药生产与天然植物 资源可持续发展之间矛盾的一种新型生物技术。温度是调节植物代谢水平的主要环境因子之一，同时其可以刺激次生产物的合成。温度对于芥子油苷代谢具有很大的影响，适当的高温或低温可以使植物积累较高浓度的芥子油苷。高温可刺激次生代谢产物的的合成，如高温对银杏光合作用、叶片中黄酮苷和萜类内酯含量的影响，高温降低银杏光合速率，引起黄酮苷和萜类内酯含量增加。黄豆在低温培育24h，根部总酚酸、染料木黄酮、染料木苷和大豆黄素的代谢水平显著增高。在低温条件下，桅子、山梨、苹果、石榴中发现有与抗低温有关的多元醇如甘油、甘露醇、山梨醇等的积累。可见，温度胁迫同其他生物和非生物诱导子类似，均具有刺激次生代谢产物的作用；同时具有低成本，无污染、易控制的优势，可进行大规模的生物反应器调控次生产物的合成。
[0004]通过不同激素组合的协调诱导植物外植体或者愈伤组织分化丛生苗，应用在稀有药材、珍贵物种和需求量大的植物中，如牡丹、文心兰、黄檗、霍山石斛和千层金等，诱导分化丛生苗并建立无性繁殖体系，可为进一步开发利用、工厂化育苗、营造人工林和种质资源保存奠定基础。由于白桦悬浮培养的愈伤组织易结团，培养时间长了易发生褐化，并且其次生代谢产物的合成稳定性差，本发明为了进一步获得稳定、充足和高产三萜的白桦药源，通过对不同激素浓度的探究，诱导白桦茎段愈伤组织长出丛生苗，同时进行温度胁迫处理，以期提供具有生长稳定且高产三萜的白桦材料新来源及白桦三萜生物反应器规模化生产的实用技术。
【发明内容】
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[0005]为保护白桦自然资源，建立稳定、可持续开发利用的白桦三萜资源生产技术，利用来自白桦愈伤组织诱导具有三萜物质合成能力的丛生苗，并进一步进行温度胁迫诱导处理，提高白桦总三萜、黄酮和齐墩果酸的合成量。为进行工业化法大规模生产白桦三萜类药物提供了新技术。
[0006]技术方案是:所用实验材料为白桦组培苗茎段接种于固体培养基(NT+0.1mg/L6-BA+0.01mg/L TDZ)诱导愈伤组织。挑选生长状态良好的愈伤组织将其转接在以NT为基本培养基，添加2mg/L6-BA诱导丛生苗。培养周期为4周，经过两代的转接，将其接种在NT为基本培养基，附加0.5mg/L6-BA,建立稳定的丛生苗固体培养体系。然后转接相同液体培养基，经过6代以上的转接，建立稳定的悬浮培养丛生苗体系，悬浮培养继代周期为14d，接种量为5g丛生苗于IOOmL液体培养基中。
[0007]在悬浮培养的第7d进行温度处理，温度胁迫水平:45°C 4h、4°C 4h和对照处理(25°C)。分别在处理后的不同时间取样，重复三次。温度处理后24h?48h收获细胞，经过滤，烘干，粉碎，有机溶剂提取步骤，利用液相色谱方法对总三萜、黄酮及齐墩果酸检测和定量分析。
[0008]本专利具有一下特点:
[0009]I)生产环境不受地域、季节、水质、病虫害、气候等自然环境的影响。
[0010]2)生产周期短，生产过程不产生大量废渣废水，安全无污染，具有生态效益。
[0011]3)利用低成本、无污染的温度处理促进白桦丛生苗中总三萜、黄酮及齐墩果酸的高效积累，降低成本，且有利于实现白桦天然植物资源及其药用成分的开发利用。
【具体实施方式】
[0012]I)植物材料来源
[0013]以东北白桦组培苗茎段为外植体，NT为基本培养基，附加激素0.lmg/L6_BA和
0.01mg/L TDZ，诱导愈伤组织，挑选生长状态良好的愈伤组织将其多次继代。
[0014]固体培养基:NT培养基+0.lmg/L6-BA+0.0lmg/L TDZ，蔗糖 20g/L、琼脂粉5.3g/L、pH值为6.0-6.5。液体培养基为不加琼脂粉的固体培养基。固体愈伤组织继代周期为25d，液体培养继代周期为15d，培养基均以121°C高压蒸汽灭菌20min，培养温度为24?26°C，光照强度为20001x，光照时间16h/d，湿度为40%-50%，摇床转速120r/min。
[0015]2)从生苗的诱导培养及培养体系建立
[0016]挑选生长状态良好的愈伤组织将其多次继代后转移至NT+2mg/L6_BA的固体培养基诱导丛生芽，培养周期为4周，经过两代的转接，将其接种在NT为基本培养基，附加
0.5mg/L6-BA，建立稳定的丛生苗固体培养体系。然后转接相同液体培养基，经过6代以上的转接，建立稳定的悬浮培养丛生苗体系，悬浮培养继代周期为14d，接种量为5g丛生苗于IOOmL液体培养基中。
[0017]3)温度处理
[0018]在悬浮培养的第7d进行温度处理，45°C 4h、4°C 4h和对照处理(25°C)。分别在处理后的不同时间取样，重复三次。经过滤，烘干，粉碎，有机溶剂提取步骤，利用液相色谱方法对总三萜、黄酮及齐墩果酸检测和定量分析。
[0019]4)总三萜的提取及含量测定
[0020]精密称取0.05g细胞干样，加入2ml95%乙醇并浸泡24h。70°C水浴Ih后再超声40min，取100 μ L上清液于IOml离心管中并置于70°C水浴蒸干。加入200 μ L5%香草醛-冰乙酸和800 μ L高氯酸，70°C水浴15min，冰上迅速冷却。乙酸乙酯定容至5ml后测定其在551nm的吸光值(对照组为200 μ L5%香草醛-冰乙酸+800微升高氯酸+4ml乙酸乙酯)。
[0021]总三萜的标准曲线以齐墩果酸为标准品进行绘制，其回归方程为y=43.044x-0.6438，相关系数R2=0.997，齐墩果酸在4?32mg/L含量范围内具有良好的线性关系。
[0022]5)齐墩果酸提取及含量测定
[0023]齐墩果酸和白桦脂醇的提取参照谭朝阳等的方法，具体方法如下:精密称取0.5g细胞干样，加入25mL盐酸-乙醇溶液(2: 8)，加热回流3h，放冷，摇匀并滤过，精密量取续滤液15mL，加蒸馏水15mL，置于80°C水浴上蒸去乙醇，然后用乙醚萃取3次，每次20mL，合并乙醚萃取液并于40°C低温蒸干，加Iml甲醇溶解残渣，并将其用0.45 μ m有机滤膜滤过，此为样品检测液，然后利用高效液相色谱进行检测。
[0024]高效液相色谱(HPLC)检测条件:用Waters公司600-717-2487色谱系统，色谱柱HiQ sil C18V4.6mmX 250mm ;流动相为乙腈:水=9:1 ;柱温25V ;灵敏度16AUFS ;流速
1.0mT,/miη ;检测波长 210nm,进样 20uL。
[0025]齐墩果酸线性关系考察:精密吸取浓度为0.5mg/mL的齐墩果酸标准品溶液0.2、
0.5、l、2、3、4、5mL，分别置于5mL容量瓶中，加95%乙醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取20 μ L进样，测定其峰面积积 分值。以浓度为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。齐墩果酸回归方程为:y = 107x+33446, R2 = 0.9992。结果表明，齐墩果酸在0.2-5.0 μ g范围内具有良好的线性关系。
[0026]6)黄酮的提取及含量测定
[0027]A、对照品溶液的配置:精确称取芦丁对照品IOmg置于IOml的容量瓶中，加入4ml的50%乙醇溶解,定容制成对照品。
[0028]B、检测波长的选择:取500ul的芦丁对照品置于250ml容量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液1ml，摇匀静置6min，再加入10%硝酸铝溶液1ml，摇匀静置6min，加10%氢氧化钠10ml，并用50%乙醇定容至刻度，摇匀静置15min，置石英比色皿中在波长400-600nm之间测定吸光值，最后确定最大波长为550nm。
[0029]C、供试品溶液的制备:将干燥好的白桦叶片用研钵磨成粉末，精确称取0.200g样品于50ml的三角瓶中，加入20ml50%乙醇,密封好后超声提取90min,过滤并定容至25ml备用。
[0030]D、标准曲线的绘制:精确吸取标准品 250ul、400ul、500ul、600ul、750ul、1000ul、Oul，分别置于25ml容量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液1ml，摇匀静置6min，再加入10%硝酸铝溶液1ml，摇匀静置6min，加10%氢氧化钠10ml，并用50%乙醇定容至刻度，摇匀静置15min，加lml5%亚硝酸钠溶液摇匀，加入lmll0%硝酸铝溶液和10mll0%氢氧化钠做空白对照，于550nm下检测吸光值。标准曲线为:y=0.0875x+0.0002,检测含量范围4?40mg/L含量范围内具有良好的线性关系。
[0031]E、样品检测:取4ml “C”所得的供试品溶液，按照“B”所述方法加入药品，检测550nm下的吸光值。根据“D”得到的标准曲线方程计算白桦丛生苗中黄酮的含量。
[0032]8)丛生苗震荡培养第七天分别进行45°C 4h和4°C 4h诱导处理，此后24h_48h收获，检测从生苗组织中总三萜、总黄酮和齐墩果酸含量。两种温度胁迫处理总三萜含量可比对照提高49.20%?5.03倍，最高含量可达59.66mg/g ;齐墩果酸含量比对照提高3.68倍?
10.56倍，最高可达2.33mg/g ;总黄酮含量比对照提高10%?38.37%，最高可达4.0mg/g。
[0033]9)该申请发明无污染、低成本、可操作性强，效率高，为解决天然植物药物来源紧缺和工业化大规模生产白桦总三萜和齐墩果酸药物提供了一种新技术。
【权利要求】
1.一种利用温度处理提高白桦丛生苗总三萜、齐墩果酸和黄酮含量的方法，其特征在于包括以下步骤: (O以白桦愈伤组织接种于NT+2mg/L6-BA的固体培养基诱导白桦丛生苗，继代两次后转移至NT+0.5mg/L6-BA固体培养基，筛选获得总三萜含量高的白桦丛生苗。将上述筛选丛生苗接种于相同液体培养基中，接种量为5g/100ml，震荡培养第七天分别进行45°C 4h和4°C 4h诱导处理，此后24h-48h收获，检测丛生苗组织中总三萜、总黄酮和齐墩果酸含量。两种温度胁迫处理总三萜含量可比对照提高49.20%?5.03倍，最高含量可达59.66mg/g ；齐墩果酸含量比对照提高3.68倍?10.56倍，最高可达2.33mg/g ;总黄酮含量比对照提高10% ?38.37 %，最高可达 4.0mg/g。
【文档编号】A01H4/00GK103430849SQ201310372994
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月24日 优先权日:2013年8月24日
【发明者】詹亚光, 尹静, 赵微, 肖佳雷, 由香玲, 曾凡锁, 范桂枝 申请人:东北林业大学, 詹亚光, 尹静