一种诱导川贝母胚状体产生的方法
【专利摘要】本发明公开了一种诱导川贝母胚状体产生的方法，属于生物【技术领域】。该方法选取川贝母植株的幼嫩叶鞘为外植体，通过消毒后进行愈伤组织诱导，将愈伤组织接入MS+头孢噻肟钠培养基中培养50天后愈伤组织表面产生有胚状体，再将胚状体以1～3个为1组切下，接入其快速生长培养基MS+6-BA0.1～1mg·L-1+头孢噻肟钠100～450mg·L-1中，在培养温度为15～25℃、每天光照6～20h、光照强度为800～2500lx的培养条件下培养60天后，胚状体可生长为绿色的川贝母小植株。本发明成功地利用了一定浓度的抗生素类化学因子诱导出川贝母胚状体，为川贝母胚状体的繁殖提供了一条新途径。
【专利说明】一种诱导川贝母胚状体产生的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体地涉及一种诱导川贝母胚状体产生的方法。
【背景技术】
[0002]川贝母(Fritillaria cirrhosa D.Don)是百合科多年生草本植物，以鳞莖入药，生长在海拔3500nT4500m的高度，主产于四川、西藏、云南等省区。川贝母喜冷凉气候条件，具有耐寒、喜湿、怕高温、喜荫蔽的特性。川贝母是重要的治疗咳嗽的良药，用于肺热燥咳，干咳少痰，阴虚劳嗽，咯痰带血等症状。川贝母植物生长在海拔2800-4700m的高山灌丛或草地中，主要依靠种子进行有性繁殖，但因其种子存在形态和生理后熟的特性，因此存在川贝母种苗培育难度大、栽种时间长和繁殖系数低等问题。
[0003]组织培养技术是一项重要的生物技术。当前川贝母组培技术都是通过利用川贝母的组织器官，选择在不同生长素和细胞分裂素配比的情况下，经过诱导愈伤组织、芽分化、芽增殖和生根等多个环节获得再生植株。如刘帆等人的《提高卷叶贝母植株再生率的研究》和高燕等人的《贝母愈伤组织的诱导及植株再生》研究。这种培养方法不仅存在诱导培养周期长、花费成本高的问题，而且也存在培养材料在长时间的培养过程中易发生细胞的变异，从而难以确保原物种的稳定性。而利用组织培养技术培育的胚状体具有与植物受精卵形成合子胚相似的结构，不仅能快速、大量地获得川贝母的再生植株，而且由于胚状体一般都是起源于单个细胞，因此，培育出的川贝母胚状体都具有遗传背景上的一致性，对于开展川贝母植物的细胞分化和形态建成过程中各种生理生化的变化，结构变化以及基因表达等有关问题的研究具有重要的意义。当前还未见有通过采用培育川贝母胚状体的方式获得再生植株的报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克 服现有技术的不足，提供一种诱导川贝母胚状体产生的方法，该方法步骤简单，可操作性 强，工艺稳定，适用于在工业化大生产中的广泛应用。
[0005]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
一种诱导川贝母胚状体产生的方法，它包括以下步骤:
51:选取川贝母植株的幼嫩叶鞘为外植体，用流水冲洗干净后，用浓度为70%~75%的酒精消毒30~60s,然后用浓度为0.1%~0.15%的升萊消毒4~1Omin,最后用无菌水震荡洗3~6次，洗后用已灭菌的滤纸吸干材料表面的水分，将经过处理的叶鞘接种于培养基MS+6-BA 0.5 ~2.0mg.L:+2,4-D I ~2mg.L:+IAA 0.1 ~Img.L 1 + 鹿糖 20 ~60g.L 1+琼脂5.0~7.0 g.L—1中进行培养，所采用的培养温度16~20°C、每天光照6~14h、光照强度为1000~20001x的条件下诱导愈伤组织；
52:选取经过SI步骤处理的颜色为白色和淡黄色的愈伤组织，切成大小为0.5~
2.5cm2，然后接入MS+头孢噻肟钠200~600mg.11培养基中培养40~60天得到愈伤组织胚状体；S3:将愈伤组织胚状体以I~3个为I组切下，接入其快速生长培养基MS+6-BA 0.1~Img-1+头孢噻肟钠100~450mg -1中，所采用的培养温度为15~25°C、每天光照6~20小时、光照强度为800~25001x的培养条件下培养50~60天后，得到川贝母小植株。
[0006]优选地，SI步骤中所述的外植体是位于茎基部端的幼嫩叶鞘。
[0007]优选地，SI步骤中所述的培养基为 MS+6-BA 0.58mg.L_1+2,4-D 1.5mg.L_1+IAA
0.5 mg.L-1 + 鹿糖 40g.L-1 + 琼脂 6.0g.L'
[0008]优选地，SI步骤中所述的培养温度为20°C、每天光照10h、光照强度为15001x。
[0009]优选地，S2步骤中所述的培养基为MS+头孢噻肟钠200~600mg.培养条件为温度15~22°C、每天光照8~16h、光照强度为1500~25001x。
[0010]优选地，S2步骤中所述的培养基为MS+头孢噻肟钠400mg.L_\培养条件为温度18°C、每天光照12h、光照强度为18001x的条件下培养50天。
[0011]优选地，S3步骤中所述的胚状体按2个为I组切下，接入胚状体快速生长培养基MS+6-BA 0.5mg.L-1+头孢噻肟钠300mg.L-1中，所采用培养温度为22°C、每天光照16小时、光照强度为20001的培养条件下培养60天。
[0012]优选地，在完成S3步骤 培养后，打开培养瓶盖在室内炼苗2~4天后，将川贝母小植株从培养瓶中取出，洗去植株上的培养基后，再将其移栽至松软的土壤中生长。
[0013]本发明的有益效果在于:
本发明利用了一定浓度的抗生素类化学因子诱导出川贝母胚状体，为当今利用生物技术培育植物胚状体又提供了一条新途径。该技术可操作性强，具有投入少、成本低、效率高的的优点，并对有效地解决川贝母种苗短缺问题具有重要现实意义。
【具体实施方式】
[0014]下面结合实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述:
实施例1:一种诱导川贝母胚状体产生的方法，它包括以下步骤:
51:选取川贝母植株的幼嫩叶鞘为外植体，用流水冲洗干净后，用浓度为70%~75%的酒精消毒30~60s,然后用浓度为0.1%~0.15%的升萊消毒4~IOmin,最后用无菌水震荡洗3~6次，洗后用已灭菌的滤纸吸干材料表面的水分，将经过处理的叶鞘接种于培养基MS+6-BA 0.5 ~2.0mg.L:+2,4-D I ~2mg.L:+IAA 0.1 ~Img.L 1 + 鹿糖 20 ~60g.L 1+琼脂5.0~7.0 g.L—1中进行培养，所采用的培养温度16~20°C、每天光照6~14h、光照强度为1000~2000 Ix的条件下诱导愈伤组织；
52:选取经过SI步骤处理的颜色为白色和淡黄色的愈伤组织，切成大小为0.5~
2.5cm2，然后接入MS+头孢噻肟钠200~600mg.1培养基中培养40~60天得到愈伤组织胚状体；
53:将愈伤组织胚状体以I~3个为I组切下，接入其快速生长培养基MS+6-BA0.1~Img.1+头孢噻肟钠100~450mg -1中，所采用的培养温度为15~25°C、每天光照6~20小时、光照强度为800~25001x的培养条件下培养50~60天后，得到川贝母小植株。
[0015]实施例2:—种诱导川贝母胚状体产生的方法，它包括以下步骤:
S1:选取川贝母植株的幼嫩叶鞘为外植体，用流水冲洗干净后，用浓度为70%的酒精消毒30s，然后用浓度为0.1%的升汞消毒4min，最后用无菌水震荡洗3次,洗后用已灭菌的滤纸吸干材料表面的水分，将经过处理的叶鞘接种于培养基MS+6-BA 0.5mg.L^+2,4-DImg.U1HAA 0.1mg.L-1 +蔗糖20g.L-1 +琼脂5.0g.L-1中进行培养，所采用的培养温度16°C、每天光照6h、光照强度为1000Ιχ的条件下诱导愈伤组织；
S2:选取经过SI步骤处理的颜色为白色和淡黄色的愈伤组织，切成大小为0.5~2.5cm2，然后接入MS+头孢噻肟钠200mg.L-1培养基中培养40天得到愈伤组织胚状体；
S3:将愈伤组织胚状体以2个为I组切下，接入其快速生长培养基MS+6-BA 0.1mg .L-1+头孢噻肟钠IOOmg .L-1中，所采用的培养温度为15°C、每天光照6h、光照强度为SOOlx的培养条件下培养50天后，得到川贝母小植株。
[0016]实施例3:—种诱导川贝母胚状体产生的方法，它包括以下步骤:
S1:选取川贝母植株的幼嫩叶鞘为外植体，用流水冲洗干净后，用浓度为75%的酒精消毒60s，然后用浓度为0.15%的升汞消毒lOmin，最后用无菌水震荡洗6次,洗后用已灭菌的滤纸吸干材料表面的水分，将经过处理的叶鞘接种于培养基MS+6-BA 2.0 mg.L^+2,4-D2mg.L_1+IAA Img.L—1 +鹿糖60g.L—1 +琼脂7.0g.L—1中进行培养,所采用的培养温度20°C、每天光照14h、光照强度为20001x的条件下诱导愈伤组织；
S2:选取经过SI步骤处理的颜色为白色和淡黄色的愈伤组织，切成大小为2.5cm2，然后接入MS+头孢噻肟钠600mg.L-1培养基中培养60天得到愈伤组织胚状体；
S3:将愈伤组织胚状体以3个为I组切下，接入其快速生长培养基MS+6-BA Img.L-1+头孢噻肟钠450mg .L-1中，所采用的培养温度为25°C、每天光照20h、光照强度为25001x的培养条件下培养60天后，得到川贝母小植株。
[0017]实施例4:一种诱导川贝母胚状体产生的方法，它包括以下步骤:
51:选取川贝母植株的幼嫩叶鞘为外植体，用流水冲洗干净后，用浓度为70%~75%的酒精消毒30~60s，然后用浓度为0.1%~0.15%的升汞消毒6min，最后用无菌水震荡洗5次，洗后用已灭菌的滤纸吸干材料表面的水分，将经过处理的叶鞘接种于培养基MS+6-BA0.58 mg.L_1+2,4-D 1.5mg.L_1+IAA 0.5mg.L-1 + 鹿糖 40g.L-1 + 琼脂 6.0g.L-1 中进行培养，所采用的培养温度20°C、每天光照10h、光照强度为15001x的条件下诱导愈伤组织；
52:选取经过SI步骤处理的颜色为白色和淡黄色的愈伤组织，切成大小为1.5cm2，然后接入MS+头孢噻肟钠400mg.L-1培养基中培养50天得到愈伤组织胚状体，培养条件为18°C、每天光照12h、光照强度为20001x ；
53:将愈伤组织胚状体以2个为I组切下，接入其快速生长培养基MS+6-BA 0.5mg .L-1+头孢噻肟钠350mg吨4中，所采用的培养温度为22°C、每天光照16小时、光照强度为20001x的培养条件下培养60天后，得到川贝母小植株。
[0018]在完成S3步骤培养后，打开培养瓶盖在室内炼苗2~4天后，将川贝母小植株从培养瓶中取出，洗去植株上的培养基后，再将其移栽至松软的土壤中生长。
[0019]实施例5:—种诱导川贝母胚状体产生的方法，它包括以下步骤:
S1:选取川贝母植株位于茎基部端的幼嫩叶鞘为外植体，用流水冲洗干净后，用浓度为72%的酒精消毒40s，然后用浓度为0.12%~0.15%的升汞消毒5 min，最后用无菌水震荡洗4次，洗后用已灭菌的滤纸吸干材料表面的水分，将经过处理的叶鞘接种于培养基MS+6-BA0.8 mg.L_1+2,4-D 1.2mg.L_1+IAA 0.6mg.L-1 + 鹿糖 30g.L-1 + 琼脂 5.5g.L-1 中进行培养，所采用的培养温度18°C、每天光照8h、光照强度为12001x的条件下诱导愈伤组织；
52:选取经过SI步骤处理的颜色为白色和淡黄色的愈伤组织，切成大小为0.5~
1.0cm2，然后接入MS+头孢噻肟钠300mg. 1培养基中培养45天得到愈伤组织胚状体；
53:将愈伤组织胚状体以2个为I组切下，接入其快速生长培养基MS+6-BA 0.6mg - 1+头孢噻肟钠250mg吨4中，所采用的培养温度为18°C、每天光照10小时、光照强度为12001x的培养条件下培养55天后，得到川贝母小植株。
[0020]在完成S3步骤培养后，打开培养瓶盖在室内炼苗3天后，将川贝母小植株从培养瓶中取出，洗去植株上的培养基后，再将其移栽至松软的土壤中生长。
[0021]实施例6:—种诱导川贝母胚状体产生的方法，它包括以下步骤:
S1:选取川贝母植株位于茎基部端的幼嫩叶鞘为外植体，用流水冲洗干净后，用浓度为70%~75%的酒精消毒30~60s，然后用浓度为0.1%~0.15%的升汞消毒4~lOmin，最后用无菌水震荡洗3~6次，洗后用已灭菌的滤纸吸干材料表面的水分，将经过处理的叶鞘接种于培养基 MS+6-BA 0.5 ~2.0mg.L:+2,4-D I ~2mg.L:+IAA 0.1 ~Img.L 1 + 鹿糖20~60g. 1 +琼脂5.0~7.0g. 1中进行培养，所采用的培养温度16~18°C、每天光照10~12h、光照强度为1500~18001x的条件下诱导愈伤组织；
52:选取经过SI步 骤处理的颜色为白色和淡黄色的愈伤组织，切成大小为1.0~
2.0cm2,然后接入MS+头孢噻肟钠300~400mg.L—1培养基中培养45~50天得到愈伤组织胚状体；
53:将愈伤组织胚状体以3个为I组切下，接入其快速生长培养基MS+6-BA 0.5~Img - 1+头孢噻肟钠300~400mg - 1中，所采用的培养温度为18~20°C、每天光照10~15小时、光照强度为1500~20001x的培养条件下培养50~55天后，得到川贝母小植株。
[0022]在完成S3步骤培养后，打开培养瓶盖在室内炼苗2~4天后，将川贝母小植株从培养瓶中取出，洗去植株上的培养基后，再将其移栽至松软的土壤中生长。
[0023]实施例7:—种诱导川贝母胚状体产生的方法，它包括以下步骤:
51:选取川贝母植株的幼嫩叶鞘为外植体，用流水冲洗干净后，用浓度为70%~75%的酒精消毒50~60s,然后用浓度为0.1%~0.15%的升萊消毒6~8min,最后用无菌水震荡洗5次，洗后用已灭菌的滤纸吸干材料表面的水分，将经过处理的叶鞘接种于培养基MS+6-BA 2.0 mg.L-1+2,4_D 2mg.L_1+IAA Img.L-1 + 鹿糖 50g.L-1 + 琼脂 6.0g.L-1 中进行培养，所采用的培养温度16~18°C、每天光照10~12h、光照强度为1800~2000 Ix的条件下诱导愈伤组织；
52:选取经过SI步骤处理的颜色为白色和淡黄色的愈伤组织，切成大小为0.5~
1.5cm2，然后接入MS+头孢噻肟钠400~500mg. 1培养基中培养40天得到愈伤组织胚状体；
53:将愈伤组织胚状体以3个为 I组切下，接入其快速生长培养基MS+6-BA 0.5~Img - 1+头孢噻肟钠400~450mg - 1中，所采用的培养温度为20~25°C、每天光照15~20h、光照强度为2000~25001x的培养条件下培养50天后，得到川贝母小植株。
[0024]在完成S3步骤培养后，打开培养瓶盖在室内炼苗2~4天后，将川贝母小植株从培养瓶中取出，洗去植株上的培养基后，再将其移栽至松软的土壤中生长。
[0025]实施例8:一种诱导川贝母胚状体产生的方法，它包括以下步骤:S1:选取川贝母植株位于茎基部端的幼嫩叶鞘为外植体，用流水冲洗干净后，用浓度为70%~75%的酒精消毒30~60s，然后用浓度为0.1%~0.15%的升汞消毒4~lOmin，最后用无菌水震荡洗3~6次，洗后用已灭菌的滤纸吸干材料表面的水分，将经过处理的叶鞘接种于培养基 MS+6-BA 0.58mg.L_1+2,4-D 1.5mg.L_1+IAA 0.5mg. 1 + 蔗糖 40g. 1 + 琼脂6.0g.L-1中进行培养，所采用的培养温度为20°C、每天光照10h、光照强度为15001x的条件下诱导愈伤组织；
52:选取经过SI步骤处理的颜色为白色和淡黄色的愈伤组织，切成大小为0.5~
2.5cm2,然后接入MS+头孢噻肟钠，400mg. 1培养基中培养，培养条件为温度18°C、每天光照12h、光照强度为18001X的条件下培养50天，得到愈伤组织胚状体；
53:将愈伤组织胚状体以I~3个为I组切下，接入其快速生长培养基MS+6-BA 0.1~Img. 1+头孢噻肟钠100~450mg. 1中，所采用的培养温度为18°C、每天光照12小时、光照强度为18001x的培养条件下培养50天后，得到川贝母小植株。
[0026]在完成S3步骤培养后，打开培养瓶盖在室内炼苗3天后，将川贝母小植株从培养瓶中取出，洗去植株上的培养基后，再将其移栽至松软的土壤中生长。
[0027]实施例9:一种诱导川贝母胚状体产生的方法，它包括以下步骤:
51:选取川贝母植株的幼嫩叶鞘为外植体，用流水冲洗干净后，用浓度为70%~75%的酒精消毒40~50s,然后用浓度为0.1%~0.15%的升萊消毒6~8 min,最后用无菌水震荡洗5次，洗后用已灭菌的滤纸吸干材料表面的水分，将经过处理的叶鞘接种于培养基MS+6-BA 0.5 ~2.0mg.L:+2,4-D I ~2mg.L:+IAA 0.1 ~Img.L 1 + 鹿糖 20 ~60g.L 1+琼脂5.0~7.0 g.L—1中进行培养，所采用的培养温度16~20°C、每天光照6~14h、光照强度为1000~2000 Ix的条件下诱导愈伤组织；
52:选取经过SI步骤处理的颜色为白色和淡黄色的愈伤组织，切成大小为0.5~
2.5cm2，然后接入MS+头孢噻肟钠200~600mg. 1培养基中培养，培养条件为温度18°C、每天光照12h、光照强度为18001X的条件下培养50天，得到愈伤组织胚状体；
53:将愈伤组织胚状体以I~3个为I组切下，接入其快速生长培养基MS+6-BA 0.1~Img- 1+头孢噻肟钠100~450mg -T1中，所采用的培养温度为15~25°C、每天光照6~20小时、光照强度为800~25001x的培养条件下培养50~60天后，得到川贝母小植株。
[0028]在完成S3步骤培养后，打开培养瓶盖在室内炼苗2~4天后，将川贝母小植株从培养瓶中取出，洗去植株上的培养基后，再将其移栽至松软的土壤中生长。
[0029]实施例10:—种诱导川贝母胚状体产生的方法，它包括以下步骤:
S1:选取川贝母植株位于茎基部端的幼嫩叶鞘为外植体，用流水冲洗干净后，用浓度为70%~75%的酒精消毒30~60s，然后用浓度为0.1%~0.15%的升汞消毒4~lOmin，最后用无菌水震荡洗3~6次，洗后用已灭菌的滤`纸吸干材料表面的水分，将经过处理的叶鞘接种于培养基 MS+6-BA 0.58mg.L_1+2,4-D 1.5mg.L_1+IAA 0.5mg. 1 + 蔗糖 40g. 1 + 琼脂6.0g.L-1中进行培养，所采用的培养温度为20°C、每天光照10h、光照强度为15001x的条件下诱导愈伤组织；
S2:选取经过SI步骤处理的颜色为白色和淡黄色的愈伤组织，切成大小为0.5~
2.5cm2,然后接入MS+头孢噻肟钠400mg.?Λ培养条件为温度18°C、每天光照12h、光照强度为18001X的条件下培养50天，得到愈伤组织胚状体；S3:将愈伤组织胚状体以3个为I组切下，接入其快速生长培养基MS+头孢噻肟钠400mg.L_\培养条件为温度22°C、每天光照16h、光照强度为20001x的条件下培养60天，得到川贝母小植株。
[0030]在完成S3步骤培养后，打开培养瓶盖在室内炼苗2~4天后，将川贝母小植株从培养瓶中取出，洗去植株上的培养基后，再将其移栽至松软的土壤中生长。
[0031]实施例11:一种诱导川贝母胚状体产生的方法，它包括以下步骤:
S1:选取川贝母植株茎基部端的幼嫩叶鞘为外植体，用流水冲洗干净后，放在超净台上用浓度为70%的酒精消毒40s，接着用浓度为0.1%的升汞消毒8min，最后用无菌水震荡洗5次，洗后用已灭菌的滤纸吸干材料表面的水分，接种于MS+6-BA 0.8mg.^+2,4-D1.5mg.r+IAA 0.5mg.L-1 + 蔗糖 40g.L-1+ 琼脂 6.0g.L-1 中，在培养温度 20°C、每天光照10h、光照强度为15001x的条件下诱导愈伤组织；
52:选取颜色为白色和淡黄色、质地较紧密和生长速度快的愈伤组织，切成大小为2cm2的大小接入MS+头孢噻肟钠400mg. 1培养基中，在培养条件为温度18°C、每天光照12h、光照强度为18001x的条件下培养50天后，可见在愈伤组织的表面有3~6个左右白色或黄白色、体积较大的园球形胚状体产生；
53:将胚状体按2个为I组切下，接入胚状体快速生长培养基MS+6-BA 0.5mg. 1+头孢噻肟钠300mg - 1中，在培养温度为22°C、每天光照16h、光照强度为20001x的培养条件下培养60天后，可见胚状体快 速生长为健壮的川贝母绿色小植株。
[0032]选取生长在2cm以上的川贝母小植株，打开瓶盖在室内炼苗3天后，将川贝母小植株从培养瓶中取出，并将川贝母小植株分割为单株后，洗去植株上的培养基，再将其移栽至松软的土壤中生长。
[0033]下面通过实验进一步说明本发明的效果:
实验一:本发明川贝母胚状体产生实验
S1:选取川贝母植株茎基部端的幼嫩叶鞘为外植体，用流水冲洗干净后，放在超净台上用浓度为70%的酒精消毒40s，接着用浓度为0.1%的升汞消毒8min，最后用无菌水震荡洗5次，洗后用已灭菌的滤纸吸干材料表面的水分，接种于MS+6-BA 0.8mg.^+2,4-D1.5mg.r+IAA 0.5mg.L-1 + 蔗糖 40g.L-1+ 琼脂 6.0g.L-1 中，在培养温度 20°C、每天光照10h、光照强度为15001x的条件下诱导愈伤组织；
52:选取颜色为白色和淡黄色、质地较紧密和生长速度快的愈伤组织，切成大小为2cm2的大小接入MS+头孢噻肟钠400mg. 1培养基中，在培养条件为温度18°C、每天光照12h、光照强度为18001x的条件下培养50天后，可见在愈伤组织的表面有3~6个左右白色或黄白色、体积较大的园球形胚状体产生；
53:将胚状体按2个为I组切下，接入胚状体快速生长培养基MS+6-BA 0.5mg. 1+头孢噻肟钠300mg - 1中，在培养温度为22°C、每天光照16h、光照强度为20001x的培养条件下培养60天后，可见胚状体快速生长为健壮的川贝母绿色小植株。
[0034]选取生长 在 2cm以上的川贝母小植株，打开瓶盖在室内炼苗3天后，将川贝母小植株从培养瓶中取出，并将川贝母小植株分割为单株后，洗去植株上的培养基，再将其移栽至松软的土壤中生长。
[0035]实验二:在实验一 S2步骤中将诱导胚状体产生的培养基改为MS+头孢噻肟钠200mg吨―1，其它步骤同实验一；经50天培养后，在愈伤组织的表面上产生胚状体数量较少，只有I~3个。
[0036]实验三:在实验一 S2步骤中将诱导胚状体产生的培养基改为MS+头孢噻肟钠600mg吨―1，其它步骤同实验一；经50天培养后，在愈伤组织的表面上产生胚状体数量较多，有6~10个左右。但产生胚状体的质量不佳，形状均为细长的圆锥形，颜色也多为黄色，并伴有少量的褐化现象。
[0037]实验四:在实验一 S3步骤中，将胚状体再生川贝母小植株的培养条件改为:培养温度为15°C、每天光照6小时和光照强度为SOOlx的培养条件下培养，其它步骤同实验一；经60天培养后，胚状体再生川贝母小植株为绿黄色、较矮小。[0038]实验五:在实验一 S2步骤中改选为黄色、质地疏松的愈伤组织为外植体诱导胚状体产生，其它步骤同实验一；经50天培养后，可见在疏松愈伤组织的表面有形状为细长锥形的胚状体产生，但产生的胚状体质量不佳，并伴有明显的玻璃化现象，使得后期培养的川贝母小植株不能健康生长。
[0039]实验六:将实验一 S2步骤中，诱导胚状体的培养基改为只选择基本培养基MS0，而未加任何浓度的抗生素，其它步骤同实施例1 ;经50天培养后，发现愈伤组织只产生了少量的增殖，但未见有胚状体产生。
[0040]实验七:在实验一 S3步骤中，胚状体再生川贝母小植株的培养基改为MS+6-BA2mg.L-1+头孢噻肟钠600mg.L-1中，其它步骤同实施例1 ;经60天培养后，再生的川贝母小植株生长缓慢，形态矮小，并有部分出现褐化状况。
[0041]实验八:在实验一 S3步骤中胚状体再生川贝母小植株的培养条件改为在每天在无光照的条件下培养，其它步骤同实施例1 ;经60天培养后，胚状体表现为自身体积明显增大，但生长出的川贝母植株为矮小的黄化苗。
[0042]实验九:在实验一 S3步骤中，胚状体再生川贝母小植株的培养条件改为，在培养温度为26°C、每天光照24小时以上和光照强度为30001x的培养条件下培养60天后，尽管胚状体抽苗较快，但抽出的川贝母植株多为细高状，颜色也多为黄绿色、还伴有明显的玻璃化现象产生。
[0043]本发明采用组织培养技术，以川贝母植株幼嫩叶鞘诱导的愈伤组织为培养材料，建立了由抗生素类化学因子诱导出川贝母胚状体的快速繁殖技术，该研究为川贝母优良品种的培育和大量快速繁殖提供了新途径。另外实施本发明方法，只需有简单的植物组织培养设备即可进行，因此实用性强，培养成本降，可行性高，同时也为利用组织培养技术培育植物胚状体又提供了一条新途径。
【权利要求】
1.一种诱导川贝母胚状体产生的方法，其特征在于:它包括以下步骤: S1:选取川贝母植株的幼嫩叶鞘为外植体，用流水冲洗干净后，用浓度为70%~75%的酒精消毒30~60s,然后用浓度为0.1%~0.15%的升萊消毒4~IOmin,最后用无菌水震荡洗3~6次，洗后用已灭菌的滤纸吸干材料表面的水分，将经过处理的叶鞘接种于培养基MS+6-BA 0.5 ~2.0mg *L:+2,4-D I ~2mg *L:+IAA 0.I ~Img *L 1 + 鹿糖 20 ~60g.L1+琼脂5.0~7.0g.1中进行培养，所采用的培养温度16~20°C、每天光照6~14h、光照强度为1000~20001x的条件下诱导愈伤组织； S2:选取经过SI步骤处理的颜色为白色和淡黄色的愈伤组织，切成大小为0.5~2.5cm2，然后接入MS+头孢噻肟钠200~600mg.1培养基中培养40~60天得到愈伤组织胚状体； S3:将愈伤组织胚状体以I~3个为I组切下，接入其快速生长培养基MS+6-BA 0.1~Img-1+头孢噻肟钠100~450mg -T1中，所采用的培养温度为15~25°C、每天光照6~20小时、光照强度为800~25001x的培养条件下培养50~60天后，得到川贝母小植株。
2.根据权利要求1所述的一种诱导川贝母胚状体产生的方法，其特征在于:S1步骤中所述的外植体是位于茎基部端的幼嫩叶鞘。
3.根据权利要求1所述的一种诱导川贝母胚状体产生的方法，其特征在于:S1步骤中所述的培养基为 MS+6-BA 0.58mg.L:+2,4-D 1.5mg.L:+IAA 0.5mg.L 1 + 鹿糖 40g.L 1+ 琼脂 6.0g.L'
4.根据权利要求1所述的一种诱导川贝母胚状体产生的方法，其特征在于:S1步骤中所述的培养温度为20°C、每天光照10h、光照强度为15001x。
5.根据权利要求1所述的一种诱导川贝母胚状体产生的方法，其特征在于:S2步骤中所述的培养基为MS+头孢噻肟钠200~600mg.L—1，培养条件为温度15~22°C、每天光照8~16h、光照强度为1500~25001x。
6.根据权利要求1所述的一种诱导川贝母胚状体产生的方法，其特征在于:S2步骤中所述的培养基为MS+头孢噻肟钠400mg.L_\培养条件为温度18°C、每天光照12h、光照强度为18001x的条件下培养50天。
7.根据权利要求1所述的一种诱导川贝母胚状体产生的方法，其特征在于:S3步骤中所述的胚状体按2个为I组切下，接入胚状体快速生长培养基MS+6-BA 0.5mg -1+头孢噻肟钠300 mg.1中，所采用培养温度为22°C、每天光照16小时、光照强度为20001x的培养条件下培养60天。
8.根据权利要求1所述的一种诱导川贝母胚状体产生的方法，其特征在于:在完成S3步骤培养后，打开培养瓶盖在室内炼苗2~4天后，将川贝母小植株从培养瓶中取出，洗去植株上的培养基后，再将其移栽至松软的土壤中生长。
【文档编号】A01H4/00GK103461137SQ201310436775
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月24日 优先权日:2013年9月24日
【发明者】薛刚, 王跃华, 余强, 王晓蓉 申请人:薛刚