以诱导独一味种子萌发幼苗为外植体的组织培养试管苗获得方法
【专利摘要】本发明公开了一种以诱导独一味种子萌发幼苗为外植体的组织培养试管苗获得方法,该方法是先将独一味种子经不同浓度GA3诱导培养，再经多菌灵喷施，经外植体消毒，接种于MS+6-BA0.5mg·L-1+NAA?1.0mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂7.0g·L-1中进行初代愈伤组织诱导培养，培养30d后，外植体表面即长出白色或黄白色的质地紧密的愈伤组织。经愈伤组织经芽诱导培养和根诱导培养后，形成组织培养试管苗。该方法很好的解决了，以独一味成株为外植体时，污染率大，不易产生无菌苗的问题；同时建立了在低海拔地区独一味有性生殖受阻，采用组织培养获得试管种苗的方法。
【专利说明】以诱导独一味种子萌发幼苗为外植体的组织培养试管苗获得方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种独一味组织培养获得试管苗的方法，特别是涉及一种以独一味种子诱导苗为外植体的组织培养试管苗获得方法。
【背景技术】
[0002]独一味Lamiophlomis rotata (Benth.)Kudo,为唇形科,独一味属植物，该属仅有独一味一个种。主产西藏，青海，甘肃，四川西部及云南西北部；生于高原或高山上强度风化的碎石滩中或石质高山草甸、河滩地，海拔2700-4500米。具有典型高山植物特征，如植物矮，茎短，根系发达，叶片较大，贴地展开。这些特征与其生长环境为高寒缺氧、干旱风大、辐射强及昼夜温差大等有关。
[0003]独一味属于传统藏药，民间用全草入药，治跌打损伤、筋骨疼痛、气滞闪腰、浮肿后流黄水、关节积黄水、骨松质发炎。此外据青海对大白鼠股动脉、肱动脉、颈动脉横切断止血试验，认为本种有较好的止血效果。随着野生独一味的存储量逐步降低，对独一味的研究也越来越受到重视。对将独一味引种到低海拔地区的研究工作也有部分开展。如金兰等通过将独一味根茎芽从海拔4300m的野生地移栽到海拔2366m和3100m的实验基地后，对移栽地独一味的花粉活力，花粉萌发及自然结束率进行了统计，结果发现独一味移栽到较低海拔后花粉活力低，柱头上无花粉萌发，自然结实率为O。因此，在低海拔地区对独一味的种苗获得，以植物组织培养方式更为可行。然后，独一味成株茎短，约1cm，叶片大，具皱，密布绒毛。这些特征使采用独一味成株为外植体时，灭菌获得无菌苗难度很大。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种以诱导独一味种子萌发幼苗为外植体的独一味组织
培养试管苗获得方法。
[0005]为达到上述目的，本发明采用的解决方法包括下列步骤:
[0006](I)选取当年收获健康饱满，具有活力的独一味种子，播种于浸有GA3 50mg .l-1的滤纸上进行催芽，待幼苗长至约Icm后，，喷施一次800倍液的多菌灵进行植株的表面消毒杀菌预处理，然后收集幼苗。
[0007](2)先将作为外植体的独一味幼苗用800倍多菌灵溶液侵泡30min，再用自来水冲洗Ih左右，，放入超净工作台内用浓度为75%的酒精消毒10s，无菌水冲洗3次，接着用浓度为0.1%的升萊消毒5min,最后用无菌水震荡洗4~6次,用无菌滤纸吸干幼苗表面的水分备用;
[0008](3)在无菌条件下用手术刀在独一味幼苗上划出伤口，接种于愈伤组织诱导培养基:MS+6-BA 0.5mg.L-1+NAA 1.0mg.I/1+ 鹿糖 30g.I71+ 琼脂 4.8g.L-1 中进行愈伤组织诱导，所采用的PH值为6.0，培养温度20°C、光照时数10h/d、光照强度为1000~1500Lx，培养时间30d ；[0009](4)30d后，选取颜色黄绿、有瘤状突起质地良好的愈伤组织作为外植体，接入丛生芽诱导培养基:MS+6_BA 1.0 -3.0mg.+NAA 0.1 -3mg *L:+ 鹿糖 30g *L:+ 琼脂 4.8g *L 1中进行丛生芽的诱导，所采用的培养基pH值为6.0，培养温度为20°C、光照时数12h/d、光照强度为1200-1800Lx，培养35d后，愈伤组织诱导分化出大量丛生芽。
[0010](5)根的诱导培养，待丛生芽长至2cm时，将丛生芽分成单芽，转接到生根培养基:1/2MS+IBA 0.5mg ?T'+NAA 0.1mg.171+ 蔗糖 15g.171+ 琼脂 4.8g.171，中诱导生根 20d 后，待不定根长至2-3cm时，即可移至高海拔地区温室大棚内进行炼苗移栽。
[0011]采用上述方案，本发明以种子萌发苗为外植体，可以有效的降低外植体接种后的污染率，快速在低海拔地区获得独一味组织胚芽试管苗。
【具体实施方式】
[0012]以下结合具体实 施例，对本发明进行详细说明。
[0013]实施例1
[0014](I)选取饱满、有生命力的独一味种子，用清水清洗后，阴干。放入浸透50g -L-1GAS的滤纸上，20°C培养，诱导萌发直到胚根和胚芽突破种皮长出，平均萌发率31.4%。长出后第4d，开始每日用800倍多菌灵喷施到平皿，连续喷施4d后，收集幼苗，用自来水冲洗干净，然后阴干，再在超净台用浓度为75%的酒精消毒15s,接着用浓度为0.1%的升萊消毒5min,最后用无菌水震荡洗5次，洗后用已灭菌的滤纸反复吸干幼苗表面的水分；
[0015](2)将消毒处理后的幼苗用无菌手术刀在子叶与茎交接处，划出伤口，然后创面向下，接种于 MS+6-BA 0.5mg ? L_1+NAA 1.0mg ? I71+ 鹿糖 30g ? I71+ 琼脂 7.0g ? L-1 中进行初代培养，所采用的pH 7.0，培养温度20°C、每天光照8h、光照强度为1200Lx。培养时间30d，外植体普遍膨胀，长出白色和淡黄色的愈伤组织，统计其愈伤组织诱导率为58.2%。
[0016](3)选取初代培养后培养出的相对致密愈伤组织，将愈伤组织切分为Icm3大小块状，再将其接入芽诱导培养基MS+6-BA 2.0mg ? L—'+NAA 0.5mg ? L—1+蔗糖30g ? L—1+琼脂
7.0g ? L—1中进行培养，所采用的培养基pH 7.0,培养温度为20°C、每天光照10h、光照强度为1500Lx，培养35d后，愈伤组织诱导分化出芽，出芽率48.6%。
[0017](4)生根培养，将诱导出芽的植物体，转接到生根培养基，1/2 MS+6-BA
1.0mg ? P+NAA 0.5mg ? L—1+鹿糖20g ? L—1+琼脂7.0g ? L_S诱导培养20d后开始长出不定根，试管苗成苗率36.7%。
[0018]实施例2
[0019]将实施例1步骤(I)中的种子诱导成苗改为，种子经50mg/L GA3浸泡I天后，接到清水浸泡后的滤纸上，诱导萌发，平均萌发率42.2%。其它步骤同实施例1，诱导培养90d左右获得组织培养试管苗，成苗率为37.1%。
[0020]应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
【权利要求】
1.一种以诱导独一味种子萌发幼苗为外植体的组织培养试管苗获得方法，其特征在于包括如下步骤: (1)选取当年收获健康饱满，具有活力的独一味种子，播种于浸有GA350mg -r1的滤纸上进行催芽，待幼苗长至约Icm后，，喷施一次800倍液的多菌灵进行植株的表面消毒杀菌预处理，然后收集幼苗； (2)先将作为外植体的独一味幼苗用800倍多菌灵溶液侵泡30min，再用自来水冲洗Ih左右，，放入超净工作台内用浓度为75%的酒精消毒10s，无菌水冲洗3次，接着用浓度为.0.1%的升萊消毒5min,最后用无菌水震荡洗4-6次,用无菌滤纸吸干幼苗表面的水分备用； (3)在无菌条件下用手术刀在独一味幼苗上划出伤口，接种于愈伤组织诱导培养基:MS+6-BA 0.5mg.L-1+NAA 1.0mg ? I71+ 鹿糖 30g ? I71+ 琼脂 4.8g ? L-1 中进行愈伤组织诱导，所采用的PH 值为6.0，培养温度20°C、光照时数10h/d、光照强度为1000-1500Lx，培养时间30d ； (4)30d后，选取颜色黄绿、有瘤状突起质地良好的愈伤组织作为外植体，接入丛生芽诱导培养基:MS+6_BA 1.0 -3.0mg ? +NAA 0.1 -3mg.L1+ 鹿糖 30g.L1+ 琼脂 4.8g ? L 1 中进行丛生芽的诱导，所采用的培养基PH值为6.0，培养温度为20°C、光照时数12h/d、光照强度为1200-1800Lx，培养35d后，愈伤组织诱导分化出大量丛生芽； (5)根的诱导培养，待丛生芽长至2cm时，将丛生芽分成单芽，转接到生根培养基:1/2MS+IBA 0.5mg ?T'+NAA 0.1mg.171+ 蔗糖 15g.171+ 琼脂 4.8g.171，中诱导生根 20d 后，待不定根长至2-3cm时，即可移至高海拔地区温室大棚内进行炼苗移栽。
【文档编号】A01H4/00GK103444551SQ201310436768
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月23日 优先权日:2013年9月23日
【发明者】张珏, 牟兰, 杨轶浠, 尹欢, 何诗虹, 郭翠平, 阮利霞 申请人:成都大学