一种促进齿瓣石斛种子萌发形成幼苗的菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物保护技术领域，具体是涉及一种能够有效促进齿瓣石斛种子共生 萌发形成原球茎，并生长发育形成大量幼苗的胶膜菌属真菌菌株。同时，本发明还涉及所述 菌株在齿瓣石斛繁育中的具体应用。
【背景技术】
[0002] 齿瓣石斛（Dendrobium devonianum)作为传统中药材，有着极高的药用价值，其栽 培规模在云南部分地州已发展成为仅次于铁皮石斛的第二支柱产业。产业所用的种苗来源 大概有四种：第一种为野生植株，主要见于上世纪90年代一些小型个体企业，随着野生资 源的匮乏，这种做法无法持续，加之国家相关部门对野生兰科植物的保护，采集野生植株用 作交易已是非法的；第二种是扦插繁殖种苗，除了需要投入大量的人力外，种苗繁殖系数极 低，不适合大规模产业发展；第三种方法是种子无菌萌发获取幼苗，技术相对成熟，萌发率 虽高，但幼苗从无菌环境至室外过程中成活率较低、并且由于无法与自然界中的真菌建立 共生关系，所以存在后期生长缓慢等致命缺陷；目前主要采用第四种方法即组织培养法，虽 然可以获得大量种苗，但在炼苗和移栽过程中需要一定的技术摸索和大量的人力，幼苗生 长过程中需要建造温棚、现代化的喷水设施等基础投入，更甚者需要喷施大量的农药和化 肥，导致种苗品质降低。种苗来源已成为整个石斛产业的关键环节。
[0003] 上述问题很大一部分原因是由兰科植物种子本身的生物学特性决定的。兰科植物 的种子非常细小没有胚乳或子叶，仅有发育不完全的胚，在自然条件下种子萌发需要完全 依靠特定的共生真菌来获取营养物质。如果能够从兰科植物原球茎上分离获取有效的真 菌，利用这种真菌来促进齿瓣石斛种子的共生萌发，进而促进种苗的繁育，应当可以有效地 克服上述弊端。从理论上说，共生萌发不仅能简化幼苗生产过程，大幅提高种苗量，显著降 低生产成本，更重要的是能显著提高齿瓣石幼苗回归到自然环境中的存活率和幼苗生长速 度，使幼苗具有更好的环境适应性。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种能够有效促进齿瓣石斛种子萌 发形成幼苗的菌株。
[0005] 本发明的目的还在于提供所述的菌株在齿瓣石斛繁育中的具体应用。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
[0007] 1、本发明从齿瓣石斛种子野外萌发形成的原球茎上分离了一株优势微生物CY作 为试验菌株，其分类命名为胶膜菌（Tulasnella sp).CY，保藏号为CGMCC No. 9551。
[0008] 为确认本发明菌株的生物遗传学信息，已将其nrDNA ITS序列提交美国国立生 物技术信息中心数据库（NCBI, http://www.ncbi. nlm.nih.gov/)保存，其Genbank号为： KM226996. 1。对该菌株进行BLAST比对分析，其与KC928375. lTulasnella sp.相似性最高 达96%。根据菌落、显微形态特征及分子生物学手段认定该菌株为胶膜菌属真菌。
[0009] 本发明的胶膜菌（Tulasnella sp).CY菌株在PDA平板上培养7天，其菌落呈灰 白色，略显水浸状，不规则圆形发散生长，气生菌丝不发达，中等稀疏。光学显微镜下观察， 菌丝具隔膜，粗（2. 0)2. 5~5.5 ym，细胞长（16. 0)21.0~74. 0(78.0) ym，分枝近直角， 分枝菌丝在分枝不远处有隔膜；菌丝大致分两种类型，一类菌丝较规则，细长；另一类略显 不规则，其上生有较多厚垣孢子；老菌丝细胞壁有加厚现象；培养1周以上开始形成串珠状 的厚垣孢子，厚垣孢子数量不等2~7个，多数5~6个，孢子可生出孢子链，孢子出芽生殖 或从孢子侧壁长出孢子链，孢子之间有隔膜开，孢子细胞壁稍微加厚，大小为：(9. 0) 9. 5~ 16. 5(17. 0) X (7. 5)8. 0 ~14. 0(14. 5) ym，长宽比值 Q = 1. 1 ~1. 8(2. 2)多数 1. 2 ~1. 4， 近球状或窄椭球状。
[0010] 2、本发明还提供了所述胶膜菌（Tulasnella sp).CY菌株在齿瓣石斛繁育中的具 体应用，即应用所述胶膜菌CY菌株促进齿瓣石斛种子萌发形成幼苗的方法，具体如下：
[0011] 1、制备共生萌发培养基：配制燕麦琼脂培养基置于旋口瓶中，旋紧瓶盖，灭菌、冷 却后备用；
[0012] 所述的燕麦琼脂培养基OMA，4g ? I71燕麦粉+8g ? L4琼脂，pH = 5. 6~5. 8 ;灭菌 条件 121°C，20min。
[0013] 2、将所述的胶膜菌.CY菌株接种到已灭菌的PDA培养基中，培养10天，待菌丝长 满整个平板，在无菌状态下将长有菌丝的培养基切成lcm 3大小的若干琼脂块备用；
[0014] 3、将消毒灭菌后的齿瓣石斛种子放入lg ? I71的无菌琼脂悬浮液制成种子悬浮 液；
[0015] 4、用移液枪取lmL种子悬浮液播种在准备好的共生萌发培养基上，然后接种步骤 (2)备用的琼脂块，在25±2°C条件下培养获得共生幼苗。
[0016] 与现有技术相比，本发明具有以下突出的优点：
[0017] 1、本发明以从齿瓣石斛原球茎分离获取的一株胶膜菌属真菌菌株为材料，研宄了 其对齿瓣石斛种子萌发的促进作用，结果证实此菌株极显著地促进齿瓣石斛种子萌发形成 幼苗，且表现出具有较强的专一性，此菌株和齿瓣石斛种子共生是获取共生种苗的可靠来 源。
[0018] 2、该菌株对于解决齿瓣石斛通过种子获取共生种苗具有十分重要的现实意义，可 用于苗圃育苗或者野外树干种子直播，相对于组织培养具有成本低廉，野外成活率高，无组 织退化问题等优点，具有代替组织培养获得共生种苗的应用价值。
[0019] 3、本发明工艺简单，操作容易，成本低，适于推广应用，在珍稀濒危兰科植物的回 归、药用兰科植物的仿生态栽培、解决齿瓣石斛栽培产业种苗来源瓶颈问题等方面都具有 巨大的推广价值。
[0020] 保藏生物材料的说明
[0021] 本发明的菌株，已于2014年07月18日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心（CGMCG);该中心地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国 科学院微生物研宄所。该菌株分类命名为胶膜菌（Tulasnella sp).CY，保藏号为CGMCC No.9551〇
【具体实施方式】
[0022] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例及试验数 据，对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发 明，并不用于限定本发明。
[0023] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0024] 实施例1、胶膜菌（Tulasnella sp) ? CY菌株的分离与鉴定
[0025] -、胶膜菌CY菌株的分离
[0026] 1、原球茎的获得：于西双版纳傣族自治州景洪市基诺乡龙帕古茶园茶树上自然生 长的齿瓣石斛成年植株附近，收集自然萌发的齿瓣石斛原球茎，用茶树树干上生长的湿润 苔藓包裹好后带回实验室用于后续实验。
[0027] 2、原球茎内共生真菌的诱导、分离纯化及保存：取出萌发的原球茎，放入盛有1% 次氯酸钠（NaCIO)溶液的灭菌烧杯中，轻轻摇动烧杯，5min后用灭菌钝头镊子取出，用无菌 水冲洗3~4次。在超净工作台上，用无菌刀片将原球茎切成两半，置于PDA培养基中25°C 培养箱培养。待在原球茎伤口处长出真菌菌丝，不断地切取菌丝尖端到新的PDA培养基上 作系列转移，转移3~5次后，可得纯菌落。
[0028] 3、真菌保存：利用常规的试管斜面法对已纯化的真菌进行保存。将配制好的适量 PDA培养基倒入规格为18X 20mm的玻璃试管中，培养基倒入量约为试管体积的1/3。硅胶 塞后，放入高压灭菌锅内灭菌（121°C，20min)。灭菌后将试管置于超净工作台内摆成斜面待 用。在超净工作台上，将纯化后的菌株用无菌接种针挑取边缘菌丝接种于PDA斜面上，并注 明菌种、编号、日期。将接种后的试管置于人工气候箱内25±2