一种根肿菌单孢分离、寄主扩繁建立单孢系的方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及单孢分离接种方法领域，具体而言，涉及一种根肿菌单孢分离、寄主扩 繁建立单孢系的方法。
【背景技术】
[0002] 根肿病是由活体寄生的芸薹根肿菌引起的十字花科作物上的世界性重要病害。抗 根肿病育种和合理利用抗病品种是防治该病的重要途径和方法。由于根肿菌种下存在生理 小种，而传统利用Williams鉴别寄主鉴定生理小种的接种菌源为根瘤，而不是采用单孢， 故被认为鉴定的结果应是"致病型"而不是生理小种。采用单孢分离、寄主扩繁，建立根肿 菌单孢系鉴定根肿菌生理小种，对抗根肿病育种和合理利用抗病品种具有重要意义。
[0003] 现在比较流行的根肿菌单孢分离方法主要有两种：一是通过稀释孢子悬浮液，使 悬浮液达到0. 5 y L含有一个孢子的浓度，然后用微管吸取悬浮液在载玻片上进行反复观 察，确定只有一个孢子后进行接种。二是使用架在显微镜上的打孔器法进行分离，对分布在 琼脂块上的根肿菌孢子先在显微镜下进行观察，再用架设在物镜转换器上的微型打孔器进 行打孔，挑取打孔后的琼脂接种到事先准备好的寄主植物根上。培养一段时间后观察发病 情况。
[0004] 但是，上述方法中的第一种方法由于微管反复吸取悬浮液观察时容易出现孢子沾 在微管壁上，甚至出现观察不到的情况，效率较低，第二种方法由于物镜转换器上安置微型 打孔器非常困难，在操作过程中无法确定是否有休眠孢子沾在打孔器上，并且对打孔器的 实时消毒灭菌也比较难实现。并且使用以上方法挑取单孢的时候耗时比较久，成功率不高。
[0005] 有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一目的在于提供一种根肿菌单孢分离方法，此方法提高了挑取孢子的 效率，而且挑单孢的成功率高，所用的针灸针也容易灭菌，操作方便等优点。
[0007] 本发明的第二目的在于提供一种采用根肿菌单孢分离后的寄主扩繁建立单孢系 的方法，此扩繁方法进行扩繁的土壤可长期使用，提高根瘤利用率，操作方便等优点。
[0008] 本发明实施例提供了一种根肿菌单孢分离方法，包括如下步骤：
[0009] (A)将十字花科作物患根肿病的根瘤经过腐熟、加水研磨以及过滤分离步骤后得 到孢悬液；
[0010] (B)将上述步骤得到的溶液浓度控制在1 X 107-3X 107个孢子/ml，然后再用蒸馏 水稀释30-50倍得到稀释孢悬液；
[0011] (C)用针灸针在所述稀释孢悬液中挑取孢子后按压在琼脂块上，并用光学显微镜 观察在所述琼脂块上只有一个孢子后进行标记保留。
[0012] 本发明实施例提供的根肿菌单孢分离方法，挑取过程中单孢只会在琼脂表面可以 被显微镜观察的地方，观察比较方便，使用10倍物镜即可满足观察要求，而且针灸针容易 消毒灭菌。其中溶液浓度也是一个重要的控制指标，应首先控制在IX 107-3X 107个孢子/ ml，然后再对其进行进一步的稀释，稀释的倍数在30-50倍之间，可以选取33、34、35、36倍 等均可。如果溶液的浓度过高，会影响挑取的成功率，也不容易使用显微镜观察，因此需要 控制在适宜的范围内。
[0013] 本发明中，将患根肿病的根瘤经过腐熟、加水研磨以及过滤分离的步骤中，先用8 层纱布进行初步过滤，然后进行分离时采用离心分离的方式进行，一般需要进行4-5次离 心分离，第一次离心分离留上清液弃沉淀，因为沉淀中会含有一些大块的土块，用于除去液 体中的寄主细胞等杂质，后几次离心分离则是留沉淀弃上清液，分离出比孢子轻的组份，如 一些细菌，已经萌发后的休眠孢子囊等。
[0014] 步骤（C)中，挑取孢子后最好选择按压在琼脂块的边缘上，而且挑取的速度尽量 快，防止在进行操作的过程中由于开设通风系统容易将琼脂吹干，影响显微镜观察，压在琼 脂上也不要太用力，压中间容易太深不好观察，因此压在琼脂块的边缘方便控制力度也至 于太用力压的过深。
[0015] 另外，在整个操作过程中最好选择在无菌环境下操作，防止根肿菌污染到整个实 验区域，影响实验结果。
[0016] 本发明实施例还提供了根肿菌单孢分离后的一种寄主扩繁方法，包括如下步骤：
[0017] (D)将含有单个孢子的所述琼脂块置于经过无菌处理的十字花科作物幼苗根毛 上，培育一段时间得到患根肿病的根瘤；
[0018] (E)将所述根瘤研磨后倒入灭菌土中形成培育土，将经过无菌处理的十字花科作 物种子在所述培育土上进行播种，培育一段时间得到患根肿病的根瘤，取出部分根瘤研磨 后倒入所述培育土中以保证所述培育土的根肿菌含量并长期使用。
[0019] 本发明实施例提供的扩繁方法通过培育一段时间培育出的根瘤取出部分进行研 磨后重新放入土壤中，以保证土壤中的根肿菌含量，可以使得土壤作为进行扩繁的长期有 效基质，并且提高了作为扩繁初始的根肿菌休眠孢子的利用率，不像现有技术中土壤进行 完一代扩繁后则直接丢弃，既浪费原料又不能保证扩繁的连续性。
[0020] 本发明中，十字花科作物幼苗的培养过程为：取一定量的十字花科种子，在75% 的酒精中消毒5min后用无菌水冲洗3次，一粒粒放入到铺好滤纸片的搪瓷盘中，喷水保湿， 用透明的保鲜膜塑料纸将搪瓷盘包裹封口后，放入恒温光照人工气候箱内培养72h。使用此 方法可以保证培养过程中不被其他菌种所污染，使用塑料纸包裹封口可以有效防止水分挥 发。通过反复实验，发现所用的十字花科作物最好选用早熟五号大白菜这个品种，因为这个 品种更容易受到侵染，发病率较高，能显著提高根肿菌的侵染率。
[0021] 培育出幼苗之后，将含有单个孢子的琼脂块置于经过无菌处理的十字花科作物幼 苗根毛上，继续培育，其培育的具体步骤最好为：先在恒温人工气候箱中且黑暗的条件下培 养40-50h，然后在育苗盘上培养60-65d，而且最好温室培养，由于根肿菌休眠孢子萌发后 产生游动孢子，光照会使休眠孢子的萌发率降低和对游动孢子的活力有影响。在黑暗的条 件下培养一段时间是为了提高休眠孢子萌发率，提高侵染几率。
[0022] 最后扩繁的过程中，正常培育60-65d即可，一般选择在普通的花盆中进行，播种 的过程中要注意密度的控制，不要过密也不要过于疏松，过密影响作物的正常生长空间，过 疏浪费能源不经济，一般控制在25-35株/盆的密度即可，花盆的直径为12-15cm。
[0023] 本发明中，还配制了根渗液，用以提高休眠孢子的萌发率从而进一步提高根肿菌 在根毛上的侵染成功率，在所述步骤（A)与所述步骤（B)之间，还包括如下步骤：将植物种 子经过消毒杀菌后进行培养一段时间后取根渗液，将所述根渗液与所述孢悬液的体积比控 制在1:8-10的比例之间得到溶液。其根渗液与孢悬液的具体体积比需要在一个适宜的范 围内，因为一方面其具体比例影响了后续（B)步骤中溶液的浓度，如果溶液的浓度过高会 影响显微镜的观察难易度，另外一方面控制在这个范围可以使得孢悬液中的休眠孢子的萌 发率达到最佳，其比例还可以取1:8. 5、1:9、1:9. 5等。
[0024] 溶液最好在25-30°C的黑暗条件下保存48-50h，溶液的PH值控制在6-7,因为在这 个操作参数条件下，其休眠孢子的萌发效果最佳。
[0025] 制备根渗液的具体方法为：将植物种子用1 %的次氯酸钠或用75%酒精消毒3min 后再用无菌水冲洗3次，将种子放在装有潮湿无菌滤纸的培养皿中。培养皿放在光照人工 气候箱中培养人工气候箱。当苗长到2-lOcm时将根部用硫酸链霉素（50ppm)消毒5min，再 用无菌水冲洗3次。在一次性塑料杯中加入一定量的Hoagland营养液，杯口用纱布包裹， 将植物幼苗插入纱布中固定，放置于人工气候箱培养，并用加湿器进行加湿，12-14d后取根 渗液，保存备用。使用Hoagland营养液具有进一步提高休眠孢子萌发率的效果，由于幼苗 长势较高则采用纱布包裹，用纱布包裹杯子中的培养液易挥发因此需要采用加湿器保证其 生长所需的湿度。
[0026] 植物种子可以选取黑麦草、韭葱、辣椒、白萝卜以及白菜的种子中的其中一种。其 中，黑麦草种子制备出的根渗液对休眠孢子的萌发最有效果，而且为了进一步提高效果，可 以在所述十字花科作物幼苗根毛上滴所述根渗液，起到双重保险的作用。
[0027] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0028] (1)根肿菌单孢分离方法提高了挑取孢子的效率，而且挑单孢的成功率高，在显微 镜下容易观测到，所用的针灸针也容易灭菌，操作方便；
[0029] (2)采用本发明的寄主扩繁方法使得进行扩繁的土壤可长期使用，而且扩繁过程 中根肿菌侵染率较尚，植株出现了上升的发病态势；
[0030] (3)通过使用Hoagland营养液制备的根渗液对休眠孢子进行处理，提高休眠孢子 萌发率，增大侵染成功率。
【附图说明】
[0031] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0032] 图1为本发明实施例的根肿菌单孢分离及寄主扩繁的方法步骤流程图；
[0033] 图2为本发明实验例1不同植物种子制备的根渗液对休眠孢子萌发影响的曲线 图。