一种提高寡孢节丛孢捕食器官数量的方法
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种提高寡孢节丛孢（Arthrobotrys oligospora)捕食器官数量的方 法，属于应用微生物学领域。
【背景技术】：
[0002] 作物病原线虫危害严重，全球每年因作物病原线虫造成的直接经济损失高达1570 亿美元。在我国，病原线虫引起的病害已成为农业生产中仅次于真菌病害的第二大类病害， 严重威胁我国粮、经作物安全。长期以来，线虫的防治主要依靠化学农药，但由于杀线虫化 学农药高毒性、高残留，严重影响到农产品安全。近年来对食线虫微生物的研宄，给人们提 供了另外一条途径一一生防防治。食线虫微生物是指一类能够侵染、捕捉和毒杀线虫的微 生物类群，是自然界中线虫种群控制的重要因子，也是生物防治植物寄生线虫的重要研宄 材料。其中捕食线虫真菌（Nematode-trapping fungi)是自然界中控制线虫种群数量的 一类重要的真菌。捕食线虫真菌根据形态学特征划分为节丛孢属（Arthrobotrys)、单顶孢 属（Monacrosporium)和隔指孢属（Dactylella)，它们利用营养菌丝特化形成的捕食器官， 如收缩环、非收缩环、粘球、粘性分枝、粘性网等完成对植物寄生线虫的捕捉和侵染过程。目 前，捕食线虫真菌作为一种有效的生物防治资源已经广泛应用于植物寄生线虫的生物防 治。与传统化学农药相比，微生物制剂具有安全、无污染、无残留的优点，同时也存在防效不 高的问题。了解捕食线虫真菌的侵染机制，开发新的生防菌剂、扩大生防应用范围，提高生 防效果，都是急需解决的问题。
[0003] 寡孢节丛孢是捕食线虫真菌的模式种，通过产生捕食器官一一三维菌网捕捉并杀 死线虫。捕食线虫真菌的捕食器官是其侵染植物寄生线虫的必要条件之一，产生的捕食器 官越多，真菌对线虫的捕食效率越高。因此通过提高寡孢节丛孢捕食器官的数量，能够有效 提高杀线虫效率。寡孢节丛孢产生三维菌网受多种因素影响，产生三维菌网效果不稳定，捕 器数量不多往往会影响到其生防效果。
[0004] 本发明提供的提高寡孢节丛孢（Arthrobotrys oligospora)捕食器官数量的方 法，经文献检索，未发现与本
【发明内容】
相同文献的公开报道。
【发明内容】
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[0005] 本发明的目的在于提供一种提高寡孢节丛孢（Arthrobotrys oligospora)捕食器 官数量的方法。
[0006] 研宄发现：硝酸盐作为土壤中最大量的无机氮源，能被植物、真菌、细菌、古菌利 用。除了作为营养物质，硝酸盐还是一种重要的信号分子。本发明将硝酸钠加入捕食线虫 真菌寡孢节丛孢的孢子悬液中，不仅能够显著提高捕食器官的产生数量，而且硝酸钠的这 种功能能够促进寡孢节丛孢的杀线虫效率。
[0007] 本发明的利用硝酸钠提高寡孢节丛孢（Arthrobotrys oligospora)捕食器官数量 的方法的实施步骤如下：
[0008] a.制备实验用线虫
[0009]在灭菌的燕麦水培养基上接种秀_隐杆线虫（Caenorhabditis elegans)，28°C培 养7-8天，用贝曼漏斗法过滤线虫，将收集的线虫2000rpm离心2min，弃上清，用无菌去离子 水重悬，重复三次，最后将线虫稀释至15条/ul ;
[0010] b.制备孢子
[0011] 在250ml三角瓶中装入50ml CMA固体培养基，121°C灭菌20分钟，待培养基冷却 后接种寡孢节丛孢菌块，28°C培养15天，产生大量的孢子，将孢子用无菌水洗下，用六层无 菌擦镜纸过滤收集；
[0012] c.捕食器官诱导
[0013] 将硝酸钠加入寡孢节丛孢孢子悬液中至终浓度20mM，取150 y 1均匀涂布在CMA培 养基上，28°C培养3-4天，待菌丝长满平板，在平板上加入96-100条线虫，分别于12h和24h 在显微镜下观察计数捕器数量和线虫死亡率；同时，用未加硝酸钠的CMA培养基作为对照， 每个实验三个重复，线虫死亡率按下式计算：
[0014] 线虫死亡率=死亡线虫/添加线虫X 100%
[0015] 本发明使用的培养基为常规的培养基。
[0016] 本发明的有益效果在于：在寡孢节丛孢孢子悬液中加入NaN03后，寡孢节丛孢产生 大量捕食器官，杀线虫能力显著提高，在加入线虫12h时，线虫死亡率达到了 85. 88% ;在加 入线虫24h时，添加硝酸钠的比不添加的平板上产生的捕食器官数量多了 5倍以上，线虫死 亡率达到了 99. 80%。
【附图说明】：
[0017] 附图显示加入NaN03(B)和不加NaN03(A)时，寡孢节丛孢产生捕食器官数量的差 异。
【具体实施方式】：
[0018] 下面结合附图对本发明作进一步的详述。
[0019] 本实施例使用的培养基为常规的培养基。
[0020] 本发明的提高寡孢节丛孢（Arthrobotrys oligospora)捕食器官数量的方法的实 施步骤如下：
[0021] 1、制备实验用线虫
[0022] 在灭菌的燕麦水培养基上接种秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans)，28°C培 养7天或8天。用贝曼漏斗法过滤线虫，将收集的线虫2000rpm离心2min，弃上清，用无菌 去离子水重悬，重复三次。最后将线虫稀释至15条/ul。
[0023] 2、制备孢子
[0024] 在250ml三角瓶中装入50ml CMA固体培养基，121°C灭菌20分钟，待培养基冷却 后接种寡孢节丛孢菌块，28°C培养15天，产生大量的孢子。将孢子用无菌水洗下，用六层无 菌擦镜纸过滤收集。
[0025] 3、捕食器官诱导
[0026] 将硝酸钠加入寡孢节丛孢孢子悬液中至终浓度20mM，取150 y 1均匀涂布在CMA培 养基上，28°C培养3天或4天，待菌丝长满平板，在平板上加入96条或100条线虫，分别于 12h和24h在显微镜下观察计数捕器数量和线虫死亡率。同时，用未加硝酸钠的CMA培养基 作为对照。每个实验三个重复。线虫死亡率按下式计算：
[0027] 线虫死亡率=死亡线虫/添加线虫X 100%
[0028] 4、实验结果
[0029] 表1 :寡孢节丛孢杀线虫效果
[0030]
【主权项】
1. 一种提高寡孢节丛孢（Arthrobotrys oligospora)捕食器官数量的方法，其特征在 于方法的步骤如下： a. 制备实验用线虫 在灭菌的燕麦水培养基上接种秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans)，28°C培养 7-8天，用贝曼漏斗法过滤线虫，将收集的线虫2000rpm离心2min，弃上清，用无菌去离子水 重悬，重复三次，最后将线虫稀释至15条M ; b. 制备孢子 在250ml三角瓶中装入50ml CMA固体培养基，121 °C灭菌20分钟，待培养基冷却后接 种寡孢节丛孢菌块，28°C培养15天，产生大量的孢子，将孢子用无菌水洗下，用六层无菌擦 镜纸过滤收集； c. 捕食器官诱导 将硝酸钠加入寡孢节丛孢孢子悬液中至终浓度20mM，取150 μ 1均匀涂布在CMA培养基 上，28°C培养3-4天，待菌丝长满平板，在平板上加入96-100条线虫，分别于12h和24h在 显微镜下观察计数捕器数量和线虫死亡率；同时，用未加硝酸钠的CMA培养基作为对照，每 个实验三个重复，线虫死亡率按下式计算： 线虫死亡率=死亡线虫/添加线虫X 100%。
【专利摘要】本发明涉及一种提高捕食线虫真菌寡孢节丛孢产生捕食器官的方法，属于应用微生物学领域。本发明通过在寡孢节丛孢孢子悬液中加入硝酸钠，寡孢节丛孢孢子悬液中至终浓度20mM，以此来提高寡孢节丛孢捕食器官数量和杀线虫能力。本发明的有益效果在于：在寡孢节丛孢孢子悬液中加入NaNO3后，寡孢节丛孢产生大量捕食器官，杀线虫能力显著提高，在加入线虫12h时，线虫死亡率达到了85.88％；在加入线虫24h时，添加硝酸钠的比不添加的平板上产生的捕食器官数量多了5倍以上，线虫死亡率达到了99.80％。
【IPC分类】A01P5-00, C12R1-645, C12N3-00, C12N1-14
【公开号】CN104651241
【申请号】CN201510129251
【发明人】梁连铭, 刘志恒, 张克勤
【申请人】云南大学
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年3月24日