一种真菌α-淀粉酶基因工程菌及其构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种真菌a -淀粉酶基因工程菌及其构建方法，属于基因工程技术领 域。
【背景技术】
[0002] 真菌a -淀粉酶是由曲霉属微生物发酵产生的一种a -淀粉酶。又名真菌淀粉酶， 可以迅速水解胶凝淀粉、直链淀粉和支链淀粉水溶液内部的a -1，4葡萄糖苷键，产生可溶 性糊精及少数麦芽糖和葡萄糖。长时间反应会产生大量麦芽糖和少量葡萄糖的糖浆。因 此，真菌a -淀粉酶广泛地应用于淀粉糖浆、低聚糖、麦芽糖、啤酒、烘焙食品、面制品等的 生产，具有十分广阔的市场前景。目前，真菌a-淀粉酶高产菌株都是经米曲霉诱变获得， 经固态发酵或深层培养、提取等工序精制而成。存在着生产工艺复杂、产量低等不足。导致 其价格昂贵，市场售价一般在200~350元/公斤。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是提供一株适合于液态发酵的食品级真菌a -淀粉 酶工程菌，所采取的技术方案如下：
[0004] 本发明的目的之一在于提供一种适合液态发酵的真菌a -淀粉酶基因工程菌，该 基因工程菌是利用黑曲霉a -淀粉酶基因amyA置换出发菌株的糖化酶基因glaA获得的基 因工程菌。
[0005] 优选地，所述出发菌株，是黑曲霉黑曲霉CICC2462或米曲霉。
[0006] 更优选地，所述黑曲霉，是利用黑曲霉的a-淀粉酶基因amyA置换黑曲霉 CICC2462的糖化酶基因glaA，再利用潮霉素进行筛选得到黑曲霉同源重组转化子，再利用 PCR检测后获得的基因工程菌。
[0007] 所述基因工程菌用于发酵生产真菌a -淀粉酶。
[0008] 本发明的另一目的在于提供一种所述基因工程菌的构建方法，该方法是扩增黑曲 霉a -淀粉酶基因后构建质粒载体，再酶切质粒载体和Ti质粒后构建同源重组表达载体， 通过农杆菌介导将同源重组表达载体转化到黑曲霉中获得黑曲霉同源重组转化子，再利用 潮霉素进行筛选，经过PCR检测后获得真菌a _淀粉酶基因工程菌。
[0009] 所述方法的步骤如下：
[0010] 1)以黑曲霉CICC2462基因组DNA为模板，设计并合成引物后扩增黑曲霉a-淀粉 酶基因amyA，再将扩增产物与克隆载体pMD18-T连接后，获得质粒载体pMD-amyA ;
[0011] 2)对步骤1)所得的质粒载体pMD-amyA进行双酶切后回收目的片段，再与同样经 过双酶切的载体PSZHG的目的片段进行连接获得黑曲霉同源重组表达载体pSZHG-amyA ;
[0012] 3)将步骤2)所得的黑曲霉同源重组表达载体pSZHG-amyA通过农杆菌转化到黑曲 霉中获得黑曲霉同源重组转化子；
[0013] 4)利用潮霉素对步骤3)所得的黑曲霉同源重组转化子进行筛选，并利用PCR进行 检测后获得真菌a-淀粉酶基因工程菌。
[0014] 步骤1)所述引物，核苷酸序列表如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示。
[0015] 步骤2)所述利用PCR，所用引物的序列如SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示。
[0016] 所述方法的具体步骤如下：
[0017] 1)以黑曲霉CICC2462基因组DNA为模板，设计并合成引物扩增黑曲霉a-淀粉酶 基因amyA，再将扩增产物与克隆载体pMD18-T连接后，获得质粒载体pMD-amyA ;
[0018] 所述引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示；
[0019] 2)利用ApaI、HindIII酶对步骤1)所得的质粒载体pMD-amyA进行双酶切后回收 目的片段，再与同样经过双酶切的载体PSZHG的目的片段进行连接，获得黑曲霉同源重组 表达载体pSZHG-amyA ;
[0020] 3)采用冻融法将步骤2)所得的黑曲霉同源重组表达载体pSZHG-amyA转化入农杆 菌AGLI中，将转化后的农杆菌AGLI接种到YEB培养基上培养后，利用核苷酸序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的引物进行PCR扩增，检测黑曲霉同源重组表达载体pSZHG-amyA， 转入成功即获得黑曲霉同源重组转化子；
[0021] 4)利用潮霉素对步骤3)所得的黑曲霉同源重组转化子进行筛选，获得糖化酶基 因位点整合的不含有筛选标记基因HPH的转化子，再利用同源重组引物对转化子进行PCR 检测，能扩增出1701bp目的条带的即为同源重组转化子，再将含有同源重组转化子的菌株 在含有200mg/L的潮霉素B的PDA液体培养基中连续传代培养，28°C下培养3-4d后，获得 纯合同源重组菌株，即真菌a-淀粉酶基因工程菌；
[0022] 所述同源重组引物的序列如SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示。
[0023] 所述方法用于构建真菌a -淀粉酶基因工程菌。
[0024] 本发明还提供了一种适合于液态发酵的食品级真菌a _淀粉酶工程菌的具体构 建方法：构建黑曲霉a -淀粉酶基因amyA表达载体pSZHG-amyA (图1)，采用农杆菌介导法 将上述表达载体转化黑曲霉，通过潮霉素筛选和PCR鉴定，获得在糖化酶基因位点整合的 不含有筛选标记基因HPH的转化子；通过荧光定量PCR、SDS-PAGE和蛋白活性检测等方法测 定amyA基因的表达量，获得安全高效表达黑曲霉a -淀粉酶的工程菌。
[0025] 本发明获得的有益效果如下：
[0026] 本发明所提供的基因工程菌在液态发酵条件下，高产高纯度真菌a _淀粉酶，发 酵液中真菌a -淀粉酶活性达到15368U/mL，真菌a -淀粉酶含量占分泌蛋白总量的90% 以上，发酵液中糖化酶，蛋白酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、纤维素酶等活性极低。
【附图说明】
[0027] 图1为黑曲霉a -淀粉酶基因amyA表达载体的质粒图谱。
[0028] 图2为amyA基因的PCR扩增电泳图；
[0029] (M，分子量标记DL2000 ; 1，amyA扩增结果）。
[0030] 图3为pSZHG-amyA载体的构建示意图。
[0031] 图4为pSZHG-amyA导入农杆菌的PCR电泳图；
[0032](M，DL4500 ; 1，水阴性对照；2,质粒 pSZHG-amyA 阳性对照；3-10, pSZHG-amyA 的农 杆菌转化子）。
[0033] 图5为pSZHG-amyA黑曲霉转化子的PCR电泳图；
[0034] (M，DL15000 ;1，水阴性对照；2,出发菌株对照；3,质粒pSZHG-amyA阳性对照； 4-13, pSZHG-amyA 转化子）。
[0035] 图6为同源重组转化子的PCR电泳图；
[0036](M，DL4500;1，水阴性对照；2，出发菌株对照；3，质粒pSZHG-amyA对照；4-6， pSZHG-amyA同源重组转化子）
[0037] 图7为纯合的同源重组菌株的PCR电泳图；
[0038](M，DL4500;1，水阴性对照；2,出发菌株对照；3,质粒pSZHG-amyA对照；4， pSZHG-amyA非纯合同源重组转化子；5-8, pSZHG-amyA纯合同源重组转化子）。
[0039] 图8为工程菌分泌蛋白的SDS-PAGE分析；
[0040] (M为蛋白Marker ;1为出发菌株对照；2-5为工程菌）。
【具体实施方式】
[0041] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0042] 以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规 材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
[0043] 实施例1 :黑曲霉a -淀粉酶基因amyA表达载体pSZHG-amyA的构建
[0044]1.黑曲霉a-淀粉酶基因amyA的扩增
[0045] 以黑曲霉CICC2462基因组DNA为模板，用a -淀粉酶基因amyA引物（amyA-sense: 5'ApaI GGGCCCATGGTCGCGTGGTGGTCTCTAT 3'；amyA-antisense:5'HindIII AAGCTT CACGAGCTACTACAGATCTTGC 3' ；上海生工合成）扩增amyA基因，得到约2054bp的amyA基因 片段（图2)。将基因片段与克隆载体pMD18-T连接，转化大肠杆菌，提取质粒pMD-amyA，送 交测序，结果表明正确。
[0046] 2.黑曲霉a -淀粉酶基因amyA表达载体pSZHG - amyA的构建
[0047] 用Apal、Hindlll双酶切质粒pMD18_amyA，回收约2000bp的目的片段，用相同的 酶消化载体pSZHG(Ti质粒黑曲霉基因