一种快大型乌肤鸡品系的培育方法
【专利摘要】本发明公开了一种快大型乌肤鸡品系的培育方法，属于分子育种【技术领域】。本发明采用分子辅助选择的方法鉴定鸡乌肤位点基因型，可以快速判定出该位点的基因型，克服了传统常规育种中测交繁琐、世代间隔长等缺点。采用本发明的方法生产基因型为FmFm的乌肤鸡品系，不仅避免了测交选育的繁琐，缩短了世代间隔，加快了育种进程，降低了培育成本；而且该品系乌肤性状均一，屠体更加美观；肉质细嫩，营养价值高。此外，该品系用作父本与快大型白羽肉鸡杂交配套，可生产出高生长性能的乌肤鸡。
【专利说明】一种快大型乌肤鸡品系的培育方法
【技术领域】
[0001]本发明具体涉及一种快大型乌肤鸡品系的培育方法，属于分子育种【技术领域】。
【背景技术】
[0002]乌骨鸡是闻名中外的药用家禽，1874年被国际上承认为标准品种，它具有特殊的药用、营养及观赏价值。而国外的快大型白羽肉鸡长速快。为了提高其生长性能，育种工作者在育种实践中往往要导入快大型肉鸡的血缘，这会使得乌肤性状发生分离。乌鸡的药用价值主要在于其黑色素的作用，乌肤性状是消费者对黑色素表达最直接的判定。为了能够在提供生长性能的同时又保持乌肤的性状，乌肤位点基因型的判定就显得非常重要。传统育种中常常采用测交的方法，依据杂交后代鸡的表型性状留种。即通过测交、繁殖扩群来淘汰隐性乌鸡群体里的乌肤杂合子个体。但是测交过程较为繁琐，周期长，且会受到扩群的大小的影响。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种快大型乌肤鸡品系的培育方法。
[0004]为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是:
[0005]一种快大型乌肤鸡品系的培育方法，包括以下步骤:
[0006](I)利用乌肤鸡品种作为父本与快大型白羽肉鸡品种作为母本进行杂交，生产出Fl代鸡，选留Fl代乌肤鸡；
[0007](2) Fl代自交得到F2代，选留F2代乌肤鸡；
[0008](3)利用荧光定量PCR测定F2代乌肤鸡EDN3基因的相对拷贝数，确定F2代乌肤鸡个体的基因型，选留乌肤位点为FmFm基因型的个体，淘汰乌肤位点为Fmfm基因型的个体，得到乌肤位点为FmFm基因型的公母鸡；
[0009](4)对得到的FmFm基因型个体进行横交和扩繁，按照家系选择和个体选择方法，提高生长速度，同时提纯和固定乌肤性状，经过4个世代以上的选育后，得到乌肤位点为FmFm基因型的快大型乌肤鸡品系。
[0010]所述步骤(1)中的乌肤鸡品种为丝羽乌骨鸡、江山乌骨鸡、金湖乌凤鸡、余干乌骨鸡、郧阳乌骨鸡、雪峰乌骨鸡、四川山地乌骨鸡、乌蒙乌骨鸡、腾冲雪鸡、略阳鸡(黑河乌鸡)、他留乌骨鸡、无量山乌骨鸡、盐津乌骨鸡等。
[0011]所述步骤(1)中的快大型白羽肉鸡品种为罗斯308、科宝、艾维茵、哈巴德、艾拔益加(AA)、海波罗、迪闻等。
[0012]所述步骤(3)中利用荧光定量PCR测定F2代乌肤鸡EDN3基因的相对拷贝数，确定F2代乌肤鸡个体基因型的方法，包括以下步骤:以包含EDN3基因的待测鸡全血基因组DNA为模板，以引物对P为引物进行荧光定量PCR扩增，扩增片段的DNA序列如SEQ ID N0.3所示；
[0013]所述的引物对P为:[0014]上游引物P-F:5’-CTTGACirTTGGGAITTACCT-3’(如 SEQ ID N0.1 所示)，
[0015]下游引物P-R:5’ -ACTGGTGCAGTAnTTCTGTT-3，(如 SEQ ID N0.2 所示)。
[0016] 该扩增序列的全长为134bp，位于鸡乌肤位点EDN3基因上，能够检测鸡乌肤基因位点EDN3基因是否存在拷贝数变异。
[0017]所述的荧光定量PCR扩增反应体系为:荧光定量PCR2X缓冲液10 ii L，ddH207 ii L，P-F0.5u L, P-R0.5u L, DNA 模板 2u L0
[0018]所述的荧光定量PCR2X缓冲液的成分为:5U/ u L Taq DNA Polymerase,10XBuffer,25mM MgCl2, 2mM dNTPs, SYBR Green I。
[0019]所述的荧光定量PCR扩增反应程序为:95°C预变性2min;40个循环:95°C变性30s，57。。退火 30s，72。。延伸 30s ;72°C 延伸 IOmin ;20°C保存。
[0020]具体的，所述步骤(3)中利用荧光定量PCR测定F2代乌肤鸡EDN3基因拷贝数，确定F2代乌肤鸡基因型的方法，还包括以下步骤:利用标准曲线求得待测鸡EDN3基因的相对拷贝数，根据其拷贝数鉴定鸡乌肤位点的基因型。
[0021]所述的标准曲线的制作方法为:以白肤鸡全血基因组DNA作为荧光定量标准品，浓度分别为80，40，20，10，5，2.5ng/uL,以引物对P为引物进行荧光定量PCR扩增，以上述六个标准品的Ct值为纵坐标，以浓度的对数值为横坐标，建立标准曲线，求得标准曲线方程。
[0022]所述的利用标准曲线求得待测鸡EDN3基因的相对拷贝数的方法为:荧光定量PCR扩增前，先将待测鸡的DNA稀释到同一浓度IOng/ u L，再将待测鸡的Ct值代入标准曲线方程中，求出其对应的对数浓度，再转化为浓度，即为该待测鸡EDN3基因的相对拷贝数。
[0023]所述的根据拷贝数鉴定鸡乌肤位点的基因型的方法为:当待测鸡EDN3基因的相对拷贝数为2时，该个体为乌肤纯合子(FmFm);当待测鸡EDN3基因的相对拷贝数为1.5时，该个体为乌肤杂合子(Fmfm);当待测鸡EDN3基因的相对拷贝数为1，该个体为非乌肤纯合子(fmfm)。
[0024]优选的，将步骤(4)得到的乌肤位点为FmFm基因型的快大型乌肤鸡作为父本与快大型白羽肉鸡品种杂交配套，生产出更高生长性能的乌肤鸡。
[0025]本发明的有益效果:
[0026]采用本发明的方法生产基因型为FmFm的乌肤鸡品系，不仅避免了测交选育的繁琐，缩短了世代间隔，加快了育种进程，降低了培育成本；而且该品系乌肤性状均一，屠体更加美观；肉质细嫩，营养价值高。此外，该品系用作父本与快大型白羽肉鸡杂交配套，可生产出高生长性能的乌肤鸡。
[0027]本发明采用分子辅助选择的方法鉴定鸡乌肤位点基因型，可以快速判定出该位点的基因型，缩短育种时间，提高育种效率，克服了传统常规育种中测交繁琐、世代间隔长等缺点。
【具体实施方式】
[0028]下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0029]实施例1
[0030]本实施例中快大型乌肤鸡品系的培育方法，包括以下步骤:[0031](I)利用丝羽乌骨鸡纯系公鸡作为父本与罗斯308母鸡作为母本进行杂交，生产出Fl代鸡，选留Fl代乌肤鸡；
[0032](2) Fl代自交得到F2代，选留F2代乌肤鸡；
[0033](3)利用荧光定量PCR测定F2代乌肤鸡EDN3基因的相对拷贝数，确定F2代乌肤鸡个体的基因型，具体包括以下步骤:
[0034]①样品的采集
[0035]对F2代选留的乌肤鸡翅静脉采血，加1/3抗凝剂，用蛋白酶K法提取血液DNA ；
[0036]②DNA样品浓度调整
[0037]将待测样品的DNA利用微量分光光度仪进行浓度测定，根据所测浓度，将每一个待测样品DNA浓度加TE稀释至IOng/μ L，稀释后用微量紫外分光光度计测定，4°C冰箱保存备用;
[0038]③标准品的制备
[0039]随机取一个白羽肉鸡的DNA样本，测定浓度后，将其稀释至80ng/ μ L，作为标准品母液，将母液倍比稀释为80，40，20，10,5,2.5ng/μ L，作为制作标准曲线的6个标准品；
[0040]④引物设计
[0041]基因型鉴定所用到的引物对P的序列如下:
[0042]上游引物P-F:5 ’ -CTTGACTTTTGGGATTTACCT-3 ’，
[0043]下游引物P-R: 5 ’ -ACTGGTGCAGTATTTTCTGTT-3 ’ ；
[0044]⑤qPCR 扩增
[0045]以引物对P为扩增引物，建立20yL体系:荧光定量PCR2X缓冲液(包括5U/μ L Taq DNA Polymerase, 10 XBuffer, 25mM MgCl2, 2mM dNTPs, SYBR Green I) 10 μ L,ddH207 μ L, P-F0.5 μ L, P-R0.5 μ L，DNA 模板 2 μ L ;反应程序为:95°C预变性 2min ;95°C变性 30s，57°C退火 30s，72。。延伸 30s, 40 个循环；72°C延伸 IOmin ;20°C保存；
[0046]⑥qPCR扩增数据处理和基因型结果的判定
[0047]以80、40、20、10、5、2.5ng/ μ L的6个标准品的Ct值为纵坐标，以浓度的对数为横坐标，建立标准曲线，求出标准曲线的方程y=_0.285x+7.665，R2=0.9986和该反应的扩增效率 92.72% ；
[0048]将待测个体的Ct值带入方程，求出其对应的对数浓度，再转化为浓度，即为该待测个体EDN3基因的相对拷贝数；
[0049]将白肤个体的EDN3基因的相对拷贝数设为1，当待测个体的相对拷贝数为2时，该位点的基因型为FmFm ;当待测个体的相对拷贝数为1.5时，该位点的基因型为Fmfm (由于待测样本DNA浓度标定和荧光定量PCR试验都会存在一定的试验误差，将此误差控制在20%之内即可，不影响对乌肤位点的判型)；
[0050](4)根据基因型判定结果，选留乌肤位点为FmFm基因型的个体，淘汰乌肤位点为Fmfm基因型的个体；
[0051](5)对得到的FmFm基因型个体进行横交和扩繁，按照家系选择和个体选择方法，提高生长速度，同时提纯和固定乌肤性状，经过4个世代以上的选育后，得到乌肤位点为FmFm基因型的快大型乌肤鸡品系；
[0052](6)将得到的乌肤位点为FmFm基因型的快大型乌肤鸡作为父本与快大型白羽肉鸡品种杂交配套，生产出更高生长性能的乌肤鸡。
【权利要求】
1.一种快大型乌肤鸡品系的培育方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)利用乌肤鸡品种作为父本与快大型白羽肉鸡品种作为母本进行杂交，生产出Fl代鸡； (2)Fl代自交得到F2代，选留F2代乌肤鸡； (3)利用荧光定量PCR测定F2代乌肤鸡EDN3基因的相对拷贝数，确定F2代乌肤鸡个体的基因型，选留乌肤位点为FmFm基因型的个体，淘汰乌肤位点为Fmfm基因型的个体； (4)对得到的FmFm基因型个体进行横交和扩繁，按照家系选择和个体选择方法，提高生长速度，同时提纯和固定乌肤性状，经过4个世代以上的选育后，得到乌肤位点为FmFm基因型的快大型乌肤鸡品系。
2.根据权利要求1所述的快大型乌肤鸡品系的培育方法，其特征在于:所述步骤(1)中的乌肤鸡品种为丝羽乌骨鸡、江山乌骨鸡、金湖乌凤鸡、余干乌骨鸡、郧阳乌骨鸡、雪峰乌骨鸡、四川山地乌骨鸡、乌蒙乌骨鸡、腾冲雪鸡、略阳鸡、他留乌骨鸡、无量山乌骨鸡或盐津乌骨鸡。
3.根据权利要求1所述的快大型乌肤鸡品系的培育方法，其特征在于:所述步骤(1)中的快大型白羽肉鸡品种为罗斯308、科宝、艾维茵、哈巴德、艾拔益加、海波罗或迪高。
4.根据权利要求1所述的快大型乌肤鸡品系的培育方法，其特征在于:所述步骤(3)中利用荧光定量PCR测定F2代乌肤鸡EDN3基因的相对拷贝数，确定F2代乌肤鸡基因型的方法，包括以下步骤:以包含EDN3基因的待测鸡全血基因组DNA为模板，以引物对P为引物进行荧光定量PCR扩增，扩增片段的DNA序列如SEQ ID N0.3所示； 所述的引物对P为:
上游引物 P-F:5’ -CTTGACirTTGGGAITTACCT-3’，
下游引物 P-R:5’ -ACTGGTGCAGTAITITCTGTT-3’。
5.根据权利要求4所述的快大型乌肤鸡品系的培育方法，其特征在于:所述的荧光定量PCR扩增反应体系为:荧光定量PCR2X缓冲液10 u L，ddH207 u L，P_F0.5 u L，P_R0.5 u L,DNA 模板 2 u L。
6.根据权利要求4所述的快大型乌肤鸡品系的培育方法，其特征在于:所述的荧光定量PCR扩增反应程序为:95°C预变性2min ；40个循环:95°C变性30s，57°C退火30s，72°C延伸 30s ;72°C延伸 IOmin ;20°C保存。
7.根据权利要求4所述的快大型乌肤鸡品系的培育方法，其特征在于:所述步骤(3)中利用荧光定量PCR测定F2代乌肤鸡EDN3基因的相对拷贝数，确定F2代乌肤鸡个体基因型的方法，还包括以下步骤:利用标准曲线求得待测鸡EDN3基因的相对拷贝数，根据其相对拷贝数鉴定鸡乌肤位点的基因型。
8.根据权利要求7所述的快大型乌肤鸡品系的培育方法，其特征在于:所述的利用标准曲线求得待测鸡EDN3基因的相对拷贝数的方法为:荧光定量PCR扩增前，先将待测鸡的DNA稀释到同一浓度IOng/ u L，再将待测鸡的Ct值代入标准曲线方程中，求出其对应的对数浓度，再转化为浓度，即为该待测鸡EDN3基因的相对拷贝数。
9.根据权利要求7所述的快大型乌肤鸡品系的培育方法，其特征在于:所述的根据其相对拷贝数鉴定鸡乌肤位点的基因型的方法为:当待测鸡EDN3基因的相对拷贝数为2时，该个体为乌肤纯合子；当待测鸡EDN3基因的相对拷贝数为1.5时，该个体为乌肤杂合子。
10.根据权利要求1所述的快大型乌肤鸡品系的培育方法，其特征在于:将步骤(4)得到的乌肤位点为FmFm基因型的快大型乌肤鸡作为父本与快大型白羽肉鸡品种杂交配套，生产出更高生长性能的乌肤·鸡。
【文档编号】A01K67/02GK103563846SQ201310509011
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年10月24日 优先权日:2013年10月24日
【发明者】康相涛, 杨朋坤, 韩瑞丽, 田亚东, 李转见, 王丹丹, 孙桂荣, 蒋瑞瑞, 吕世杰, 王彦彬, 刘小军, 李国喜, 闫峰宾, 黄艳群, 许殿明, 李孝法, 索智勇, 张瑞勤 申请人:河南农业大学