一种利用柽柳组织培养系统生产多种次生产物的方法
【专利摘要】本发明属于生物工程领域，具体涉及一种利用柽柳组织培养系统生产多种次生产物的方法。以内蒙柽柳嫩枝为外植体，分别进行不同激素组合（两水平NAA和四个水平6-BA）及五种类型培养基（MS、1/2MS、NT、B5和WPM）处理，经不同处理的柽柳丛生苗组织中总酚含量可达136.84～353.58mg/g（干重），总三萜含量可达17.65～63.13mg/g（干重），总黄酮含量可达11.10～18.92mg/g（干重）。在附加激素为6-BA?1.0mg/L+NAA?0.05mg/L的不同类型培养基条件下，柽柳组培苗一个生长周期（30d）内的总酚产量（生长干重mg×含量mg/g）以1/2MS最高，可达60.76mg；总三萜产量以MS培养基最高，可达9.13mg；总黄酮产量以1/2MS和MS培养基较高，分别为3.25mg和2.50mg。该申请发明为通过生物发酵方法进行柽柳药用成分的规模化生产奠定了基础。
【专利说明】一种利用柽柳组织培养系统生产多种次生产物的方法
所属【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程领域，具体涉及一种利用柽柳组织培养系统生产多种次生产物的方法。
【背景技术】
[0002]柽柳是我国的传统中药材，历代本草多有记载，药理实验证明具有抑菌、止咳、解热等作用，临床主要用于透疹，治疗慢性气管炎、类风湿性关节炎，外用治疗皮肤搔痒等，最近的研究表明，柽柳嫩枝叶中含丰富的萜类、黄酮和酚类物质，其中多种物质具有较强的抗肿瘤活性。柽柳的次生代谢产物对于开发新型药物制剂，具有广阔前景。
[0003]目前，对柽柳的研究主要包括:柽柳植株药用成分及药理活性，柽柳抗旱、抗盐碱生理及分子机制，如干旱胁迫下膜保护酶类(S0D、P0D等)的活性以及膜脂过氧化产物丙二醛(MDA)的含量等的变化，体内各种可溶性物质如脯氨酸、可溶性糖、N、K的变化，以及内源激素ABA、IAA, GA等的变化规律等；柽柳抗逆功能基因挖掘、克隆与功能验证。
[0004]以细胞全能性为基础建立起来的植物组织培养技术为植物药生产提供了一条新途径，由于利用组织或细胞培养法生产植物天然活性物质具有不依赖和消耗自然植物资源的特点，因而被视为是从根本上解决植物天然活性物质生产可持续发展问题的一种新型生物技术。目前利用细胞工程手段已实现紫杉醇、白桦三萜、人参皂苷、紫草宁、喜树碱多种植物天然产物的合成或生产。关于柽柳组织培养及快繁的研究已有一些报道，但主要集中在组织快繁方面，而很少有关于柽柳组织培养合成次生产物的研究报道。如乔梦吉研究短穗柽柳最适组培芽启动及增殖培养基为MS+6-BA 0.5mg/L十NAA 0.05mg/L,生根培养基为1/2MS。韩琳娜研究表明，利用柽柳的嫩芽作为外植体，最佳分化诱导培养基为MS+1.0mg/L BA+0.01mg/L NAA ;生根培养基为M S+0.05mg/L NAA。李先芳研究结果表明，采用MS培养基进行柽柳生根培养时，NAA的适宜添加浓度为0.05mg/L ;不定芽诱导最适合激素为BA
2.0mg/L ;丛生芽增殖最适培养基为MS+BA 0.05mg/L+NAA 0.01mg/L。上述柽柳组织培养不同培养基筛选的结果不尽相同，主要与其柽柳产地及品种特性有关。本发明专利以柽柳嫩芽为外植体，通过不同激素和培养基类型的筛选，明确不同处理对柽柳组织生长及次生产物合成的影响，以期为利用细胞工程规模生产柽柳药用成分技术体系的建立及规模化生产奠定基础。
【发明内容】
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[0005]以柽柳嫩芽为外植体，通过不同激素和培养基类型的筛选，明确不同处理对柽柳组织生长及次生产物合成的影响，以期为利用细胞工程规模生产柽柳药用成分技术体系的建立及规模化生产奠定基础。
[0006]技术方案是:所用实验材料为内蒙古红皮柽柳(Tamarix chinensis Lour.),将柽柳Icm嫩芽为外植体，进行无菌消毒处理，接种于固体培养基MS中培养。将继代两次后的MS培养基中的柽柳组培苗进行不同培养基和不同激素组合处理。以MS为基本培养基进行不同激素组合处理，NAA为2个水平:0.01和0.05mg/L,6-BA为4个水平:0、0.25,0.5和1.0mg/L。不同培养基类型处理为MS、1/2MS、NT、B5和WPM五种类型，附加激素均为6-BA
1.0mg/L+NAA 0.05mg/L ;不同处理均接种在100ml三角瓶中，内装50ml固体培养基，接种量为柽柳组培苗0.30g,每个处理重复接种10瓶。培养周期为30d，培养期间进行拍照和记录生长状态。培养30d后收获材料，进行鲜重测定，烘干至恒重后测定干重，同时进行次生产物总黄酮、总酚和总三萜物质含量检测和分析。
[0007]本专利具有一下特点:
[0008]I)生产环境不受地域、季节、水质、病虫害、气候等自然环境的影响。
[0009]2)生产周期短，生产过程不产生大量废渣废水，安全无污染，具有生态效益。 [0010]3)利用培养基及生长激素处理的方法处理促进柽柳丛生芽生长及总酚、总三萜、黄酮的高效积累，丛
[0011]生芽次生产物合成稳定，组织增殖快，有利于实现柽柳天然植物资源及其药用成分的开发利用。
【具体实施方式】
[0012]I)植物材料来源
[0013]柽柳外植体来自15年生内蒙古红皮柽柳(Tamarix chinensis Lour.),取直径为
l-2cm枝条于花盆中扦插，待嫩芽长至Icm左右，进行无菌消毒，转移至MS基本培养基中培养。
[0014]2)从生芽的诱导培养及培养体系建立
[0015]将继代两次后的MS培养基中的柽柳组培苗进行不同培养基和不同激素组合处理。以MS为基本培养基进行不同激素组合处理，NAA(l-naphthlcetic acid)为2个水平:
0.01 和 0.05mg/L，6-BA(6-benzyIadenine)为 4 个水平:0、0.25,0.5 和 1.0mg/L。不同培养基类型处理为|^、1/21^、见\85和1?11五种类型，附加激素均为6-BA 1.0mg/L+NAA 0.05mg/L ;不同处理均接种在100ml三角瓶中，内装50ml固体培养基，接种量为柽柳组培苗0.30g，每个处理重复接种10瓶。培养周期为30d，培养期间进行拍照和记录生长状态。培养30d后收获材料，进行鲜重测定，烘干至恒重后测定干重，同时进行次生产物总黄酮、总酚和总三萜物质含量检测和分析。
[0016]固体培养基:鹿糖20g ? L'琼脂粉5.3g ? L' pH值为6.0~6.5。培养基均以121 °C高压蒸汽灭菌20min，培养温度为24~26°C，光照强度为20001x，光照时间16h.cf1,湿度为40%~50%。
[0017]3)总三萜的提取及含量测定
[0018]精密称取0.05g丛生芽干样，加入2ml95%乙醇并浸泡24h。70°C水浴Ih后再超声40min，取IOOii L上清液于IOml离心管中并置于70°C水浴蒸干。加入200 y L 5%香草醛-冰乙酸和800 ii L高氯酸，70°C水浴15min，冰上迅速冷却。乙酸乙酯定容至5ml后测定其在551nm的吸光值(对照组为200 u L5%香草醛-冰乙酸+800微升高氯酸+4ml乙酸乙酯)。
[0019]总三萜的标准曲线以齐墩果酸为标准品进行绘制，其回归方程为y=43.044x-0.6438，相关系数R2=0.997，齐墩果酸在4~32mg/L含量范围内具有良好的线性关系。
[0020]4)总酚物质的提取及含量测定
[0021]标准溶液的配制:精密称取标准品25.0m g没食子酸，置于100m L容量瓶中，蒸馏水溶解并定容至刻度，摇匀，即得0.25mg/mL的没食子酸标准溶液，低温保存备用。
[0022]酒石酸亚铁溶液的配制:称取0.5g硫酸亚铁及2.5g酒石酸钾钠置于500mL容量瓶中，蒸馏水溶解并定容至刻度，摇匀，低温保存备用。
[0023]磷酸缓冲液的配制:将0.0667mol/L磷酸氢二钠溶液与0.0667m o 1/L磷酸二氢钾溶液按84:16的比例混合，调节pH7.5备用。
[0024]标准曲线的绘制:精密吸取没食了酸标准溶液1.0,2.0,3.0,4.0,5.0ml，分别置于25m L的容量瓶中，加蒸馏水至体积为5.0mI，再加入酒石酸亚铁溶液5.0ml，用pH=7.5的磷酸盐缓冲溶液定容至25ml，混匀，静置15m in，随行空白，在540rnn处测定吸光度值(A)。以没食子酸标准溶液的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线得线性回归方程:A=15.2850+0.0061 (r=0.99985)，结果表明，没食子酸浓度在0.01~0.05mg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系。
[0025]样品溶液的制备和含量测定:准确称取干燥的柽柳芽粉末0.2g，加入一定量的石油醚超声提取2次，每次30min过滤，滤渣挥发干燥去除残余石油醚后，加7ml60%乙醇，超声提取45min。精密吸取上述样品溶液3.0ml，按上述标准品测定方法测定吸光度，并根据回归方程计算柽柳总多酚的含量。
[0026]5)黄酮的提取及含量测定
·[0027]A、对照品溶液的配置:精确称取芦丁对照品IOmg置于IOml的容量瓶中，加入4ml的50%乙醇溶解,定容制成对照品。
[0028]B、检测波长的选择:取500ul的芦丁对照品置于250ml容量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液1ml，摇匀静置6min，再加入10%硝酸铝溶液1ml，摇匀静置6min，加10%氢氧化钠10ml，并用50%乙醇定容至刻度，摇匀静置15min，置石英比色皿中在波长400-600nm之间测定吸光值，最后确定最大波长为550nm。
[0029]C、供试品溶液的制备:将干燥好的柽柳芽用研钵磨成粉末，精确称取0.200g样品于50ml的三角瓶中，加入20ml 50%乙醇,密封好后超声提取90min,过滤并定容至25ml备用。
[0030]D、标准曲线的绘制:精确吸取标准品 250ul、400ul、500ul、600ul、750ul、1000ul、Oul，分别置于25ml容量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液1ml，摇匀静置6min，再加入10%硝酸铝溶液1ml，摇匀静置6min，加10%氢氧化钠10ml，并用50%乙醇定容至刻度，摇匀静置15min，加lml5%亚硝酸钠溶液摇匀，加入Iml 10%硝酸铝溶液和IOml 10%氢氧化钠做空白对照，于550nm下检测吸光值。标准曲线为:y=0.0875x+0.0002，检测含量范围4~40mg/L含量范围内具有良好的线性关系。
[0031]E、样品检测:取4ml “C”所得的供试品溶液，按照“B”所述方法加入药品，检测550nm下的吸光值。根据“D”得到的标准曲线方程计算柽柳丛生苗中黄酮的含量。
[0032]6)次生产物分析显示，各处理下柽柳丛生苗组织中总酚含量均较高，可达136.84~353.58mg/g,其次为总三萜，含量可达17.65~63.13mg/g,总黄酮含量相对较低，为11.10~18.92mg/g。相同激素水平(6-BA 1.0mg/L+NAA 0.05mg/L)不同培养基类型分析结果表明，柽柳丛生芽总酚产量以1/2MS最高，其次为MS和WPM培养基，分别可达60.76mg、32.32mg和32.50mg ；MS培养基最有利于总三萜产量积累，总三萜产量可达9.13mg ;总黄酮产量以1/2MS和MS培养基较高，分别为3.25mg和2.50mg。
[0033]8)该申请明确了柽柳丛生芽最佳生长培养基及次生产物生产培养基，该研究为通过悬浮培养或大规模发酵培养的方式进行柽柳药用成分的规模化生产提供了种质材料，也为在细胞工程水平调控柽柳药 用成分积累及遗传改良奠定了基础。
【权利要求】
1.一种利用柽柳组织培养系统生产多种次生产物的方法，其特征在于包括以下步骤:以内蒙红皮柽柳嫩枝为外植体，分别进行八种激素组合(两水平NAA和四个水平6-BA)及五种类型培养基(MS、1/2MS、NT、B5和WPM)处理，各处理下柽柳丛生苗组织中总酚含量均较高，可达136.84~353.58mg/g，其次为总三萜含量，可达17.65~63.13mg/g，总黄酮含量相对较低，为11.10~18.92mg/g。在附加激素为6-BA 1.0mg/L+NAA 0.05mg/L的不同类型培养基条件下，柽柳组培苗一个生长周期(30d)内的总酚产量(生长干重mgX含量mg/g)以1/2MS最高，可达60.76mg ;总三萜产量以MS培养基最高，可达9.13mg ;总黄酮产量以1/2MS和MS培养基较高，分别为3.25mg和2.50mg。
【文档编号】A01H4/00GK103583362SQ201310553697
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月11日 优先权日:2013年11月11日
【发明者】尹静, 梁甜, 肖佳雷, 詹亚光, 王思瑶, 李明阳, 邵占媛, 巩媛, 姜立超 申请人:东北林业大学, 尹静, 詹亚光