一株拮抗植物病原细菌的抗生素溶杆菌oh13的分离鉴定的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种对植物病原细菌具有较强拮抗作用的生防细菌。一株拮抗植物病原细菌的菌株OH13，其特征在于：所述菌株为抗生素溶杆菌(Lysobacter?antibioticus)OH13，属于黄单胞科(Xanthomonadaceae)、溶杆菌属(Lysobacter)，CGMCC?NO：7561。菌落形态：在不同培养基上呈现不同形态，在LB上生长缓慢，菌落始终为黄色，表面湿润，边缘整齐；在10％TSA上，初期呈现粉红色，后变为橙红色，表面平坦，边缘整齐；在TSA上为黄色菌落，表面湿润，边缘整齐；在NA培养基上生长早期为黄色，后逐渐变为橙红色，最后变为黑褐色，表面湿润隆起，边缘整齐。生理特征：革兰氏阴性，杆状，无鞭毛；最适生长温度：28℃。本菌株对植物病原细菌具有明显的拮抗作用。
【专利说明】一株拮抗植物病原细菌的抗生素溶杆菌0H13的分离鉴定
(—)【技术领域】
[0001]本发明属于微生物领域，具体涉及一株对植物病原细菌具有拮抗活性的细菌的分
离鉴定。
(二)【背景技术】
[0002]病虫害是制约农业生产的重要因素，每年因病虫害造成的经济损失巨大。世界谷物生产统计表明，每年因病害、虫害和草害造成的损失分别约为10^^14%和11%。作物细菌病害是影响我国农业产量、质量和效益的主要障碍之一。近年来，随着气候、环境、产业结构和生产方式等的变化，我国作物细菌病害发生更为严重和复杂，总体上呈现多发、重发和突发态势，其基本特征是区域性、间歇性爆发。
[0003]为了保障作物稳产高产，长期以来人们一直主要采用化学防治来控制农业病虫草害。化学防治具有防效好、速度快，作用谱广、成本低等优点，但化学农药长期、过量和不当施用引起的"3R"问题(残留、再猖獗、抗性)早已引起人们的极大关注，尤其是食品质量安全问题和生态安全问题成为整个社会关注的焦点。
[0004]因此，许多国家已将对生态安全、与环境相容性强的生物农药作为今后农药发展和病虫害防治的重要发展方向。欧美等发达国家十分重视生物农药的研制与应用，目前世界上生物农药使用量最多的国家美国、加拿大和墨西哥的生物农药使用量占世界总量的44%,欧洲生物农药使用量占全世界的20%，亚洲占13%，大洋洲占11 %，拉美洲和加勒比湾占9%，非洲占3%。目前， 生物防治及生物农药已被列入我国21世纪优先发展的领域。国内生物农药的年产量12万吨，预计未来10年内生物农药占农药的市场份额将由现在的5%增加到30%。生物农药产业作为现代农业的朝阳产业，发展潜力巨大。
[0005]微生物农药和农用抗生素是两类重要的生物农药，前者主要以微生物的活体为有效成份，后者以微生物的次生代谢产物为有效成份。据报道，我国用于植物病害生物防治的生防真菌主要包括木霉(Trichoderma spp.)、粘帚霉(Gliocladium spp.)、盾壳霉(Coniothyrium spp.)、拟青霉(Paecilomyces spp.)和键刀菌(Fusarium spp.)等。生防细菌主要包括芽孢杆菌(Bacillus spp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)和土壤杆菌(Agrobacterium spp.)等。目前我国处于有效登记状态的生物农药有效成分超过90种,其中微生物杀菌剂有枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡质芽孢杆菌、荧光假单胞菌和木霉等产品；农用抗生素主要包括井岗霉素、公主岭霉素、农抗120、春雷霉素、多氧霉素、灭痕素、农用链霉素、中生霉素、武夷圃素和申嚷霉素等。
[0006]溶杆菌(Lysobacter spp.)属于黄单胞科、溶杆菌属。截止2012年底，国际上已鉴定的溶杆菌属细菌有26个种,其中产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)、产抗生素溶杆菌(Lysobacter antibioticus)和胶状溶杆菌(Lysobacter gummosus)这三个种具有高效抗菌活性和植物病害生防潜力，是一类新型植物病害生防细菌。这类细菌对植物病原真菌、卵菌、革兰氏阴性细菌(G_)、阳性细菌(G+)和线虫都有显著的拮抗作用，其作用机理为:(I)产生小分子抗菌次生代谢物质；(2)分泌产生大量胞外酶，包括几丁质酶、β-1，3-葡聚糖、蛋白酶和纤维素酶；(3)诱导植物产生抗病性；(4)较好的定殖能力。
[0007]综上所述，分离鉴定具有重要生防潜力的新型溶杆菌菌株，获得其合成的广谱高效的抗菌活性物质，可为新型、高效和广谱生物农药(农用抗生素)研发和获得具有农药活性的先导化合物提供技术支撑。
(三)
【发明内容】
[0008]本发明利用稀释涂布的方法，将水稻细菌性条斑病菌作为靶标菌，从水稻根际土壤筛选到一株具有拮抗细菌活性的菌株0H13，经16S rDNA.biolog等方法鉴定为抗生素溶杆菌(Lysobacter antibioticus)。该菌对多种植物病原细菌具有明显的拮抗作用。
[0009]本发明提供的拮抗细菌0H13，已于2013年05月06日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC N0.7561，分类命名为抗生素溶杆菌Lysobacterantibioticus。
(四)【专利附图】
【附图说明】
[0010]图10H13在不同培养基上的菌落形态
[0011]图 20H13、Lysobacter antibioticus ATCC29479>Lysobacter antibioticusl3_l的电镜观察图片
[0012]图30H13对病原细菌拮抗效果图
[0013]图40H13 的 16S rDNA PCR 电泳图
[0014]图50H13的系统发育树
(五)【具体实施方式】
[0015]以下通过具体实施对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。
[0016]I材料和方法
[0017]1.1试验菌株、培养基
[0018]试验菌株:水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.0ryzicola)、水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.0ryzae)、马铃薯环腐病菌(Clavibactermichiganense)、瓜类细菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli)、梨火疫病菌(Erwinia amylovora)、黄瓜细菌性角斑病菌(Pseudomonas syringae pv./achrymans)、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)。
[0019]培养基:
[0020]NA培养基:牛肉浸膏3g,蛋白胨5g, Yeast extractlg,鹿糖10g,蒸懼水1L,ρΗ7.2,固体培养基分装后另加琼脂1.5g/100mL。
[0021]10% TSA:胰蛋白胨大豆肉汤培养基(Tryptic-Soytone-Broth-Medium) 3g,蒸懼水1L，分装后另加琼脂1.88g/100mL。
[0022]TSA:胰蛋白胨大豆肉汤培养基(Tryptic-Soytone-Broth-Medium) 30g,蒸懼水1L，分装后另加琼脂1.88g/100mL。
[0023]LB:TryptonelOg, NaCl 10g, Yeast Extract5g/L,加入水溶解，最后定容至 1L,调节pH = 7.0-7.2，分装后，LB固体培养基另加琼脂粉1.5g/100mL。
[0024]1.2 土壤细菌的稀释及分离
[0025]取水稻根表1mm 土层土样10份,将采集的土样经2mm 土壤筛，称取IOg于装有90mL无菌水的三角瓶中，摇床振荡30min后10倍梯度稀释5次。吸取稀释液100 μ I于NA平板上涂布，每个稀释度重复涂布于3块平板，28°C培养2天。稀释度以每个平板上菌落数100-300个为宜，挑取不同类型的菌落于NA平板进行纯化，纯化3次后_70°C保存。
[0026] 1.3拮抗细菌对病原细菌拮抗活性的测定
[0027]挑取单菌落在NA液体培养基中培养24_48h，获得OD = 1.0的细菌菌液。取50 μ I病原菌菌液，稀释100倍后铺于NA平板上，将多余菌液吸出，吹干待用。吸取3μ I拮抗细菌菌液(OD= 1.0)滴于铺有病原菌的平板上。28°C培养2-5d，观察并拍照。
[0028]1.4拮抗细菌菌株的鉴定
[0029]1.4.1菌落形态观察与电镜观察
[0030]菌落形态:取OHl3菌液3 μ I分别点于10% TSA、TSA、NA、LB培养基中央，28°C培养2-4d，观察形态。在NA培养基上，菌落由黄色变为橙红色，最后变成棕褐色，菌体表面圆润有光泽，表面突出；在LB上生长缓慢，菌落始终为黄色；在10% TSA上，初期呈现粉红色，后变为橙红色，表面平坦，边缘呈扩散状；在TSA上为黄色菌落，表面湿润。
[0031]电镜观察:
[0032](I)将 0H13、Lysobacter antibioticus ATCC29479、Lysobacterantibioticusl3-l划线于NA培养基(菌龄不能过大)，在菌落生长新鲜处，用少量灭菌水，冲洗菌落，并轻轻晃动培养皿，使灭菌水在新鲜菌落周围反复冲洗，配制成菌悬液。
[0033](3)在石蜡板上滴加I~2滴新鲜的PTA负染液。
[0034](4)取新的铜网片吸附菌悬液，置于干净的滤纸上晾干。
[0035](5)待铜网片上的菌悬液七八成干时，将铜网片吸附菌悬液的一面接触负染液，漂浮染色15s (时间过长则染色颜色深)。
[0036](6)从负染液中取出铜网片，用滤纸吸干多余的负染液，日光灯下烤45s，使其干燥。
[0037](7)将制作好的样品，放置于透射电镜日立H-650中，在80千伏下观察细胞形态。
[0038](8)将 0H13 形态与 Lysobacter antibioticus ATCC29479、Lysobacterantibioticusl3_l 进行比较。
[0039]0H13与Lysobacter antibioticus ATCC29479>Lysobacter antibioticusl3_l一致，均呈现杆状，无鞭毛。
[0040]1.4.216S rDNA 鉴定
[0041]利用T1ANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒提取0H13的DNA，作为16S rDNA扩增的模板。应用Primer5.0软件设计引物，上游引物16S-F:AGAGTTTGATCATGGCTCAG,下游引物16S-R:ACGGTTACCTTGTTACGACTT,引物序列由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，扩增条带约 1500bp。PCR 反应体系(25 μ I): 10 X buf f er2.5 μ L ；Mg2+ (25mM) 2 μ L ；dNTP(l.25mM) 2 μ L ;正向引物(20pmol/μ L) 0.5 μ L ;反向引物(20pmol/μ L) 0.5 μ tL ；Trans-Taq 聚合酶 0.3μ L ；gDNA (lOng/μ L) 0.5 μ L ;ddH2016.7 μ L。PCR 反应条件:95。预变性 5min，94° 变性 30s、55。退火 30s、72。延伸 lmin30s、30 个循环，72° 后延伸 8min。PCR反应产物经1%琼脂糖凝聚电泳检测，与DL2000marker比较，片段大小正确，为目的片段，见图4。
[0042]含有目的片段的PCR产物利用AXYGEN PCR clean up试剂盒进行纯化回收，将纯化产物送往英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，所得序列长度为1414bp。
[0043]将所得序列与GenBank核酸数据库进行同源性比对分析，结果显示，菌株OHl3与Lysobacter antibioticus的序列相似性高达99%,从中挑选部分相似性高的菌株以及其它一些溶杆菌与黄单胞菌株进行系统发育分析，用MEGA软件中的邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树，见图 5,由图可知 0H13 与 Lysobacter antibioticus遗传距离最近，与产酶溶杆菌Lysobacter enzomgenes和胶状溶杆菌Lysobacter gummosus遗传距离较远，根据同源性比对和系统发育分析结果表明，0H13为抗生素溶杆菌。
[0044]1.4.3Biolog 检测
[0045]为进一步验证检测结果，将菌株0H13、Lysobacter antibioticus ATCC29479、Lysobacter antibioticusl3_l在TSA培养基上划线培养12h,获取单菌落,用无菌棉签在单菌落表面滚动，粘取菌体，然后插入接种液中用力将菌体打散，制成菌悬液。调整浊度为90%，再用8孔移液器将菌悬液分别加入鉴定板的各孔中，每孔各100 μ L，共96孔。盖上鉴定板盖，置于28°C培养，72h后取出鉴定板，置于读数仪上读取结果。自动检索数据库，比较鉴定结果。[0046]因biolog数据库中无溶杆菌,所以不能鉴定出具体种名，但将0H13与Lysobacterantibioticus ATCC29479、Lysobacter antibioticusl3_l 比较后发现，OHl3 与这两株菌的碳源利用情况较一致，仅对几种碳源利用能力不同。0H13与Lysobacter antibioticusATCC29479相比，不能利用糊精、亚碲酸钾，对L-组氨酸利用率低，可利用D-半乳糖、氨曲南，可在I % NaCl中生长；与Lysobacter antibioticusl3_l相比，不能利用糊精,对D-果糖、L-组氨酸利用率低，不能利用溴琥珀酸、亚碲酸钾的有机碳源。因此，可进一步确定菌株 0H13 为抗生素溶杆菌(Lysobacter antibioticus)。
[0047]0H1316S rDNA序列，长度为 1414bp:
[0048]
【权利要求】
1.一株具有拮抗植物病原细菌作用的生防细菌，其特征在于该细菌是抗生素溶杆菌，保藏登记号为:CGMCC NO:7561，命名为 Lysobacter antibioticus 0H13。
2.权利要求1所述的细菌的应用，其特征在于对水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonasoryzae pv.0ryzicola)、7_K稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.0ryzae)等革兰氏阴性细菌以及马铃薯环腐病菌(Clavibacter michiganense)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)等革 兰氏阳性细菌具有较强的拮抗作用。
【文档编号】A01P1/00GK103667136SQ201310661809
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月10日 优先权日:2013年12月10日
【发明者】刘凤权, 钱国良, 赵杨扬 申请人:南京农业大学