少女石竹的组织培养方法
【专利摘要】一种少女石竹的组织培养方法，采用少女石竹嫩枝的茎尖作为外植体，灭菌处理后，在培养温度25±1℃，光照强度2500Lx，除白天自然光照外，夜间补光4小时／天的培养条件下，依次接种到由MS、0.01mg／L6-BA、0.05mg/L?NAA组成的初代诱导培养基，由MS、0.01mg／L6-BA、0.05mg/L?NAA组成的继代培养基，由1／2MS、0.05mg／L?IBA组成的生根培养基上进行培育，该培养方法可以短时间内获得室内大规模繁殖的少女石竹培苗，生产率高，具有潜在的生态效益和社会效益。
【专利说明】少女石竹的组织培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物生物【技术领域】，具体而言，涉及一种少女石竹的组织培养方法，该培养方法特别适用于少女石竹，远优于该培养基对于其他石竹的组织培养方法，包括石竹外植体的选择，茎尖组织培养中继代培养基及培养代数的选择，组织培养过程中培养条件的选择等内容。
【背景技术】
[0002]石竹是多年生作一、二年生栽培的草花，因其花色丰富，花期长，栽培管理粗放，是重要的观赏花卉。全球约有600余种，广布于北温带，主要分布于欧亚大陆，尤其是地中海地区，少数产北美和北非。据《中国植物志》记载，我国石竹属有17个种、I个亚种、9个变种，多分布于北方草原和山区草地，大多生于干燥向阳处，有些种生于林缘或林下、荒漠及半荒漠。内蒙古水资源严重缺乏，景观绿化要多用阳光少用水，应全面推广抗旱绿化植物，而生长在内蒙古干旱、半干旱地区的石竹，有顽强的生命力，可以在野外顺利越冬，在雨水少、无浇灌的情况下也能正常生长，其根系庞大，可防止水土流失并能抗有害气体和病虫害，有重要的卫生环保功能，可作为园林的重要组成部分，也可用于高速公路、高架公路等路基、路坡等多种场所的绿化美化。但由于来自人类活动或自然变迁两方面的威胁，使其种群数量存在着自然退化问题并且组培扩繁种中出现玻璃花现象导致工厂化育苗数量受限。解决的办法就是改良现有对石竹的组织培养方法，这是快速繁殖、脱毒复壮和降低玻璃花的有效方法。在实验室条件下，降低其玻璃花是一项需实践去摸索和探讨的新课题，在制定技术方案时可以参考的资料不多，都必须通过试验来逐一解决，关键要解决外植体取材部位、时期；各培养时期培养基的选择；培养条件以及成苗后快繁技术等。本发明以开发利用，降低成本为目标，以形成工厂化、产业化生产为目的，制定相应的工作计划和实施办法。
[0003]组织培养在离体培养条件下，不同植物以及同种植物不同部位的组织细胞对营养要求不同，只有满足了它们各自的特殊要求，才能更好地生长发育。掌握培养基的配制及筛选方法是取得组培成功的关键环节之一。
[0004]植物组织培养是很重要的生物技术手段。植物的细胞、茎段、叶片等均可以培养。取植物的细胞、器官和组织，置入适当培养基的容器中，在一定的培养条件下，可分化形成完整植株。作为生物技术有力手段的组织培养，日益受到重视，在农林作物的脱毒快繁、突变诱发、细胞工程和基因工程等方面都发挥着重要作用。
[0005]在石竹科植物的组织培养中，常选择茎段、叶片、花瓣和茎尖等作为外植体来获得再生植株。茎段也是石竹科植物快速繁殖中的常用材料之一，由于其具有取材方便、数量多等优点而被广泛采用。Watad等研究了以茎段作外植体，采用凝胶培养基培养、液体摇动培养以及液体培养基上漂浮界面膜辅助培养等3种不同培养方式对香石竹再生频率的影响，结果表明，第三种培养方式的再生频率比另外两种方式可提高两至三倍，这在植物快繁过程中可大大节约成本。Godo等对剪秋罗茎段培养进行了研究，外植体在I / 2MS+0.2mg /L BA和I / 2MS培养基上的再生频率分别为30%和70%。在MS+10mg/L BA培养基上每个茎段节点平均可以生成8个可利用芽，而且芽的遗传稳定性相当稳定。
[0006]石竹科植物的叶片培养可通过直接或间接再生途径获得再生植株。了等向培养基中加入生长素？~V对中国石竹叶片的愈伤组织进行再分化研究。结果发现，最适愈伤组织分化培养基为13+84(2.0,5.01118 / 1) +^^(0.5,1.0^/1)0无论单独或组合使用8八，嫩八，2，4-0，愈伤组织都不能再分化产生芽。此外，他们还对中国石竹的第1片叶子(从顶部开始)和第2片叶子的愈伤组织诱导情况做了比较，研究表明第1片叶子和第2片叶子基部诱导出的愈伤组织具有再生能力，而第2片叶子其余部分诱导的愈伤组织不具有再生能力。1^111:151等研究报道:中国石竹叶片外植体在3呢/ I 8^+0.5^/1购V和3^/I 8^+1^/1嫩八的13基本培养墓上培养，都会直接产生不定芽；而在0.508/1 8^+1^/12, 4-0的13培养基上虽也可以产生不定芽，但伴随有愈伤组织的产生，产生的不定芽要在含8八和嫩八的培养基上才能生长。？犯'64等以香石竹、中国石竹和美国石竹的叶片为外植体，采用13+1呢/ 12，4-0液体培养基诱导出了体细胞胚，体细胞胚在13+108 / I以3固体培养基上发育成幼苗，首次建立了石竹科植物直接体细胞胚诱导再生体系。
[0007]似匕如等以香石竹花瓣、叶片和茎段为外植体诱导不定芽。结果只有花瓣具有较高的再生频率，适宜的培养基为13+1.1-2.2^/1 8八和13+0.9^/1嫩八。等以香石竹花瓣为外植体研究了两种培养方式对石竹芽再生频率的影响。结果表明，石竹花瓣在液体培养基比固体培养基上的再生率高(前者可达100%，而后者只有50% )；花瓣的各部位都会形成再生芽，每个外植体最多可产生7个不定芽。01821110^等也由香石竹花瓣诱导出再生芽，诱导率达84.4%，而转基因香石竹花瓣的再生芽诱导率高达90.4%。[0008]茎尖是石竹科植物组织培养中常用的一个取材部位，除用于快速繁殖外，还用于脱毒培养、种质资源保存等。从20世纪90年代初开始，国内外报道了这方面的研究成果。香石竹由于生产中采用的扦插繁殖导致品质严重下降，因此，它的茎尖培养具有重要的生产实践意义。^11等研究了不同生长素、细胞分裂素和赤霉素组合对瞿麦茎尖快繁的影响，结果表明:茎尖分生组织在13+5.0呢凡8^+1.0^ / I 培养基中比在含其他几种生长调节剂组合的培养基中产生的丛生芽多。0=3皿1等报道了 102的剂量和处理时间对香石竹茎尖离体繁殖效率的影响很大。他们的研究表明，102的浓度为1 一51118 /匕处理时间为
3-10(1，对香石竹茎尖进行离体繁殖时，效率可达100 %。
[0009]迄今为止，国内外组织培养成功的石竹科品种很多，但多见于报道的是用于香石竹的生产和栽培，对少女石竹组织培养研究较少。总结近20年来的文献数据，少女石竹科品种组织培养多数是茎段、叶片比较成功，有关少女石竹茎尖培养的更是屈指可数。少女石竹的人工繁殖仍主要采用播种法及扦插法，繁殖数量有限、时间长且极易导致不定芽玻璃花、病害感染和品质退化。目前可用于解缩短育苗时间、工厂化生产、幼苗玻璃化问题、更新复壮的组织培养法繁殖研究较少，因此深入开展少女石竹组织培养研究已成为科研工作者亟待进行的工作之一。用我国丰富的野生资源进行品种创新，应用多样化的育种手段，在重视常规杂交育种的基础上，结合现代生物技术手段进行新品种选育，同时以脱毒组培种苗作为生产性原种来进行种球的工厂化开发，是少女石竹组织培养的发展方向。组织培养法繁殖取材方便，不受自然条件的限制，可以不断进行大量繁殖，是少女石竹快速繁殖、减少玻璃化、脱毒复壮以及新品种培育的最有效方法，可以在短期内获得大量小苗，解决了少女石竹玻璃化、缩短育苗时间、栽培中种源较少的问题，为少女石竹今后的研究以及规模化、产业化开发利用提供了理论依据。
[0010]茎尖组织培养的完整过程一般分为制定培养方案、外植体选择与处理、接种、初代培养、继代增殖扩繁培养、壮苗与生根培养、试管苗的驯化移栽等几个技术环节，前已提到掌握培养基的配制及筛选方法是取得组培成功的关键环节。本发明筛选出用于少女石竹组织培养中不同时期的最佳培养基，调整对不同时期培养基中激素的配比，按照不同配方配制的培养基满足了少女石竹各个时期的营养需要和生长发育，同时解决了少女石竹幼苗大量玻璃化现象和育苗周期长的问题。
[0011]前已提到国内外诸多学者对石竹的组织培养也进行了研究，目前已应用于香石竹石竹生产中，但多见于报道的是栽培品种用于鲜切花生产的，培养基和方法并不适用于少女石竹，本发明系统地研究了少女石竹的外植体的选择、最佳培养条件、不同阶段的最佳培养基及增殖培养代数。
[0012]本发明操作简便，成本低廉，具有良好的应用前景。本发明系统地研究了少女石竹的组培中不同阶段的最佳培养基，最适的培养条件及培养方式，解决了少女石竹玻璃化、缩短育苗时间、栽培中种源较少的问题的难题，为实现抗旱景观绿化新理念增添了品种并具有较强的实用性，为实现石竹的工厂化生产奠定了可靠的基础。
【发明内容】
[0013]本发明的实施方案中，包含一种少女石竹的组织培养方法，其特征在于它由以下步骤组成:
[0014]步骤1:外植体取自少女石竹嫩枝的茎尖；
[0015]步骤2:将外植体接种于初代诱导培养基MS+6-BA0.01mg/L+NAA0.05mg / L上，诱导分化出丛生芽；
[0016]步骤3:将初代诱导的丛生芽在继代培养基MS+6-BA0.01mg / L+NAA0.05mg/L上培养3代，然后将其丛生芽在改良的MS培养基上培养2代，最后将上述的丛生芽在继代培养基上培养I代后，将其转移到生根培养基I / 2MS+IBA0.05mg / L上培养；
[0017]步骤4:将上述诱导生根后的少女石竹生根苗进行移栽。
[0018]各步骤的培养条件为:培养温度25土TC，光照强度2500LX，除白天自然光照外，夜间补光4小时/天。
[0019]其中，改良的MS培养基是改变MS培养基中部分无机盐和离子浓度的离子平衡溶液，用于少女石竹继代增殖培养的基本培养基，其具体组成为:
[0020]大量元素:KN031900mg/L；NH4N03413mg/L ；CaCl2.2H20440mg/L ；MgS04.7H20370mg/L ；KH2P04310mg / L
[0021]微量元素:K10.83mg/ L ；H3B036.2mg / L ；MnS04.4H2022.3mg / L ；ZnSO4.7H208.6mg / L ；Na2Mo04.2H200.25mg / L ；CuSO4.5H200.25mg / L ；CoCl2.6H200.025mg / L
[0022]铁盐=FeSO4.7H2027.8mg / L ；Na2-EDTA.2H2037.3mg / L
[0023]有机物质:肌醇lOOmg/L ;烟酸0.5mg/L ;盐酸批卩多醇(维生素Β6)0.5mg/L ;盐酸硫胺素(维生素BI) 0.lmg/L ;甘氨酸2.0mg / L
[0024]6-BA1.0mg/L ；NAA0.5mg/L。[0025]在本发明实施方案中，少女石竹的组织培养步骤1中少女石竹外植体的灭菌处理过程为:在超净台上放入无菌容器中，在每升滴加2-3滴“ 1冊611”的75%的酒精中浸泡10秒，再用0.15%的升汞溶液处理5分钟，无菌水洗2次，最后无菌滤纸上吸干水分。
[0026]在本发明实施方案中，少女石竹的组织培养步骤2接种过程中，少女石竹嫩枝茎尖叶原基切口插入培养基。
[0027]本发明还经过比较试验，筛选出少女石竹组培各个阶段最佳培养基:
[0028]￡1.初代诱导培养基:13+6-8六0.011118 / [+^^0.051^ / [是少女石竹最佳的初代诱导培养基，不但诱导率高，而且每个外植体新增芽数多，分化率最高，其分化率可达200%。
[0029]I继代增殖培养基:13+6-840.01呢/1+嫩八0.05^ / 1,高浓度的6-8八对少女石竹增殖有抑制作用，浓度过高，可抑制芽的生长，随着6-8八浓度的增高，当6-8八浓度超过
0.21118丨[时，丛生矮化明显，易产生玻璃化苗。
[0030]0.生根培养基:1 / 213+18八0.05呢/匕低盐浓度对少女石竹的生根有利。
[0031]少女石竹无论在初代培养还是在继代培养中，在13+6-840.01^/1+^0.05^ /I培养中，对丛生芽的生长都有促进作用，相比其他组合更为理想，丛生芽数量多，幼苗较大，移植出苗率效果最佳。
[0032]本发明具体实施方案中还包括少女石竹生根后的炼苗移栽阶段，结果表明，蛭石+羊粪+磷酸二铵作为栽培基质效果最佳，非常适合小苗根系的生长。
【具体实施方式】
[0033]实施例1.少女石竹外植体的选`取和操作方法对不定芽诱导的影响
`[0034]实验用的少女石竹采于自内蒙古和信园蒙草抗旱绿化股份有限公司抗旱植物研究院实验基地的试验苗圃，根据试验进展、不同时期取样并随时取样补充。采少女石竹幼嫩枝条上长约0.5-1.0(^的茎尖，经流水冲洗后，用70%的酒精浸泡1086(3，然后用0.1%的升汞消毒5111111，无菌水冲洗2次，每次5111111，接种于改良的初代培养基(13)上，建立试管苗无性繁殖系。选取继代10(1左右的丛生芽，丛生芽剪去基部；取丛生芽的茎尖，长约
0.5-1.0(3111，作为再生的外植体。
[0035]其中，改良的初代13培养基是改变13培养基中部分无机盐和离子浓度的离子平衡溶液，用于少女石竹初代培养的基本培养基，其具体组成为:
[0036]大量元素:謂03950呢71；順4勵3825呢/1 ；03012 ?2！！20220呢丨 I ；%804 ?7^0185^/
I；腿2？0485呢丨I
[0037]微量元^:1(10.831118/1438036.21118 丨 I ；111804 ? 4^022.3111^/1 ；211804 # 7！！208.6111? 丨 I ；^821004 # 21^00.；011804 # 5！！200.25?& 丨 I ；00012.6400.025呢/1
[0038]铁盐:？6804.74027.8呢丨 I ；恥2-20！'八.2112037.3呢/1
[0039]有机物质:肌醇100呢/ I ；烟酸0.5呢/ I ；盐酸吡卩多醇(维生素86)0.5^/1 ；盐酸硫胺素(维生素81)0.1^/1 ；甘氨酸2.0^/1
[0040]6-8八2.5呢/ I ；嫩八1.0呢/ I ；活性炭1^/1 ；水解络蛋白0.5^/1 ；抗生素50^/匕[0041]实施例2.少女石竹组织培养各个阶段最佳培养基的筛选
[0042]1、筛选效果的统计计算公式
[0043]成活率=(有生活力的外植体数/接种的外植体总数)X 100%
[0044]初代芽诱导率=(出芽的外植体数/接种的外植体总数)X 100%
[0045]继代增殖倍数=(诱导出的丛生芽数/接入单株芽的总数)X 100%
[0046]生根率=(分化根的外植体数/接种的外植体总数)X 100%
[0047]2、石竹组织培养各个阶段最佳培养基的筛选
[0048]以MS为基本培养基，用3.5g / L的卡拉胶作固化剂，3%的食用白糖代替蔗糖作为碳源，以自来水代替蒸馏水，分别添加不同配比的细胞分裂素和生长素进行培养基的筛选。
[0049]2.1、诱导分化培养基的选择
[0050]将6-BA 的浓度设 0.01mg / L、0.05mg / L、0.1mg/L、0.2mg / L、0.5mg/L 五个浓度梯度，NAA的浓度设0.01mg / L、0.05mg/L、0.1mg / L、0.2mg/L四个浓度梯度,进行不同组配，接种时每瓶接2-3个少女石竹茎尖(茎尖长约0.5-lcm)，观察茎尖在不同培养基上不定芽的发生情况。
[0051]从表1可见，7种激素组合均可诱导少女石竹分化丛生芽，但各个组合的分化率不同，I号MS+6-BA0.01mg/L+NAA0.05mg / L是少女石竹茎尖培养基是最佳的诱导培养基，不但诱导率高，而且每个外植体新增芽数多，分化率最高，其分化率可达200 %。
[0052]表1激素浓度及其组合对少女石竹茎尖丛生芽诱导的影响
[0053]
【权利要求】
1.一种少女石竹的组织培养方法，其特征在于它由以下步骤组成: 步骤1:采少女石竹幼嫩枝条上长约0.5-1.00111的茎尖，灭菌处理后接种于改良的13培养基，选取继代10(1左右的丛生芽，丛生芽剪去基部；取丛生芽的茎尖，长约0.5-1.0挪，作为再生的外植体； 步骤2:将外植体接种于初代诱导培养基13+6-840.01^/1+^0.05呢/1上，诱导分化出丛生芽； 步骤3:将初代诱导的丛生芽在继代培养基13 + 6-840.01^/1 +嫩八0.05^/1上培养3代，然后将其丛生芽在改良的13培养基上培养2代，最后将上述的丛生芽在继代培养基上培养一代后，将其转移到生根培养基1/213 + 18^0.05^/1上培养； 步骤4:将上述诱导生根后的少女石竹生根苗进行移栽。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，各步骤的培养条件为:培养温度25±1.0，光照强度2500匕，除白天自然光照外，夜间补光4小时/天。
3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤1的外植体的灭菌处理过程为:在超净台上放入无菌容器中，在每升滴加2-3滴“ 1冊611”的75%的酒精中浸泡10秒，再用0.15%的升汞溶液处理5分钟，无菌水洗2次，最后无菌滤纸上吸干水分。
4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤1接种过程中，少女石竹嫩枝茎尖叶原基切口插入培养基。
5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤3移栽后栽培的基质由蛭石、羊粪、磷酸二铵组成。
【文档编号】A01H4/00GK103828716SQ201310714887
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2013年12月13日 优先权日:2013年12月13日
【发明者】马怀林, 王召明, 高秀梅, 田志来 申请人:内蒙古和信园蒙草抗旱绿化股份有限公司