血袋渐冻保存装置制造方法
【专利摘要】本实用新型涉及一种血袋渐冻保存装置，所述血袋渐冻保存装置包括：一主体外壳、一层以上的血袋置入空间及二个以上的铁氟龙渐冻袋；所述主体外壳设有一能供开启、密闭的上盖；所述血袋置入空间容置有欲冻存的血袋；所述铁氟龙渐冻袋与欲冻存的血袋接触，且所述铁氟龙渐冻袋中填充有渐冻剂。本实用新型所提供的血袋渐冻保存装置，于该渐冻装置组装完成时，欲进行冷冻的血袋与该渐冻袋以层叠方式，排列置于该血袋渐冻保存装置的主体内部，且该铁氟龙渐冻袋与血袋直接接触，协助血袋在冷冻过程中达到所希望的缓慢降温的效果。
【专利说明】血袋渐冻保存装置
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及一种血袋冻存装置，特别涉及一种血袋渐冻保存装置。
【背景技术】
[0002]以冷冻方式保存细胞时，必须经过一段缓慢降温的过程，避免快速降温或不稳定降温导致冷冻过程中细胞内水分因结晶状凝结而产生细胞死亡。成功冷冻细胞需要两个基本条件，一是添加低温保护剂，二是以最佳降温速率降温。常用的低温保护剂为二甲基亚砜(DMSO)jDMSO为一种极小的分子，可以通过细胞膜进入细胞内，以减缓细胞内水分形成冰晶的大小与速率，保护细胞在冷冻储存和解冻过程中不受破坏，增加细胞存活率。但DMSO浓度高时亦具有细胞毒性，故冻存时需控制在10% (wt)以下，合并最佳降温速率以达到细胞的最佳冷冻保存。
[0003]一般市售的细胞渐冻保存盒(Cryo box)为能达到最佳的降温速率，会在内盒置物层与外壳中间填充100%异丙醇(isopropyl alcohol)作为渐冻剂,可以每分钟下降1°C的温度来稳定降温，最低可达到_80°C，并可长时间维持低温。异丙醇在冷冻细胞的过程中可以辅助实现缓慢降温，利用该物质可以使降温速率达到近似于-1°c /分钟，在冷冻仪中也可获得平滑降温曲线的作用。但是，异丙醇具有高度挥发性，并且容易吸收空气中的水分，所以经过长时间的使用后，其浓度会逐渐下降而影响其控温性能。因此，科罗耐(Kelowna)国际科技有限公司所出品的冻管渐冻盒，不需添加异丙醇来达到渐冻效果，且由于可快速回温，故能够缩短再次使用的时间。但是目前为止，已知的市售渐冻盒(如Nalgene出品的Mr.Frosty)仅供冻管冻存，并无可供血袋冻存的血袋渐冻盒等相关产品的公开使用。
[0004]美国细胞治疗认证协会(FACT)规范指出，脐带血须储存于抗冻血袋中保存，因为抗冻血袋的密闭性高，能降低污染机会。目前一般业界所采用的保存方法是，将收集得到的脐带血装入例如Pall公司(美国)生产的冷冻袋(cryo preserved bag)内。Pall冷冻袋是一种新式的血袋，包括二个具有分隔的部分，其中一部分容量是20毫升，另一部分则为5毫升。后者可在干细胞移植前用于自我扩增，然后与前者一同移植给病人，或者用于治疗受损的组织器官。为了防止交叉污染，在冷冻袋外面会另加一层袋子后装入一个铝合金盒，然后将此金属盒放入可控速率降温仪(computerised temperature-reducing system)进行程序冷冻，降温速率为_1°C /分钟。当温度降到_80°C时，脐带血将被转入液氮箱内，在气态内(保持< _190°C低温)长期保存(超过一年)。但可控速率降温仪费用昂贵，除使干细胞储存及移植成本大增外，每分钟下降1°C是冻管中小量冻存细胞时的标准值，对于血袋中大量储存细胞时虽可作为一参考值，但最佳降温速率因细胞数量而有微调整，因此细胞于血袋中解冻后存活率低于冻管中解冻后存活率，目前世界各国法规规定血袋解冻后细胞存活率如达70%以上为临床使用的放行标准之一。
实用新型内容
[0005]有鉴于此，本实用新型的目的在于提供一种血袋渐冻保存装置。[0006]为达到上述目的，本实用新型提供一种血袋渐冻保存装置，包括:
[0007]—主体外壳，其设有一能供开启、密闭的上盖，并于所述血袋渐冻保存装置组装完成后呈现密封；
[0008]一层以上的血袋置入空间，所述血袋置入空间容置有欲冻存的血袋；以及
[0009]二个以上的铁氟龙渐冻袋，所述铁氟龙渐冻袋与欲冻存的血袋接触，且所述铁氟龙渐冻袋中填充有能使降温速率达到_1°C /分钟的渐冻剂。
[0010]作为上述一种血袋渐冻保存装置的优选方案，其中所述渐冻剂为异丙醇。渐冻袋大小以配合该主体内缘的长宽为原则，其中所填充的渐冻剂重量(g)/渐冻袋面积(Cm2)比例较佳为0.7?0.9，此考虑到所使用的渐冻袋的较佳承载量。
[0011]作为上述一种血袋渐冻保存装置的优选方案，其中所述血袋置入空间与所述铁氟龙渐冻袋以交互堆栈方式，由下至上排列于所述血袋渐冻保存装置的主体内部。
[0012]作为上述一种血袋渐冻保存装置的优选方案，其中所述血袋置入空间的上、下层皆与所述铁氟龙渐冻袋连接，且置入的血袋的上、下面都能分别接触到所述铁氟龙渐冻袋。
[0013]作为上述一种血袋渐冻保存装置的优选方案，其中所述主体外壳的上盖以压合的方式与所述血袋渐冻保存装置的主体密合，以避免内容物污染及方便运送与堆栈。
[0014]作为上述一种血袋渐冻保存装置的优选方案，其中所述上盖的内面周缘设有与所述主体外壳的开口周缘密合的环状沟槽。
[0015]作为上述一种血袋渐冻保存装置的优选方案，其中所述主体外壳的上盖以扣合的方式与所述血袋渐冻保存装置的主体密合，以避免内容物污染及方便运送与堆栈。
[0016]作为上述一种血袋渐冻保存装置的优选方案，其中所述主体外壳与上盖分别设有一组以上的相互扣合的外扣式装置。
[0017]作为上述一种血袋渐冻保存装置的优选方案，其中所述主体外壳及上盖由耐冻塑料、纸类或金属制成。
[0018]作为上述一种血袋渐冻保存装置的优选方案，其中所述主体外壳及上盖由PP塑料(聚丙纟布)制成。
[0019]作为上述一种血袋渐冻保存装置的优选方案，其中所述血袋置入空间为一可单独拆卸的金属盒，或是一由可架设于该主体外壳内壁的突点上的隔板所构成的空间，所述血袋置入空间须具备能使置入的血袋的上、下外表面，能够与该铁氟龙渐冻袋接触的高度。
[0020]作为上述一种血袋渐冻保存装置的优选方案，其中所述渐冻袋大小以配合该主体外壳内缘的长宽为原则，其中所填充的渐冻剂重量(g)/渐冻袋面积(cm2)比例为
0.7?0.9，此考虑到所使用的渐冻袋的较佳承载量。
[0021]本实用新型所称的”血袋”，广泛定义为其中包含有细胞培养物的冷冻袋。用于本文，所述的细胞培养物可为于活体外经大量培养的细胞培养物，包含(但不限于)干细胞培养物，或是采收自活体的脐带血。
[0022]本实用新型提供的血袋渐冻保存装置，于该渐冻装置组装完成时，欲进行冷冻的血袋与该渐冻袋以层叠方式，排列置于该血袋渐冻保存装置的主体内部，且该铁氟龙渐冻袋与血袋直接接触，协助血袋在冷冻过程中达到所希望的缓慢降温的效果；其具有渐冻功能，且成本低廉；而细胞培养物置于此血袋渐冻保存装置中，可提升大量细胞储存于血袋解冻后的细胞存活率。【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为根据本实用新型的一血袋渐冻保存装置实施例主体的透视图；
[0024]图2为本实用新型的一以三明治法完成组装的血袋渐冻保存装置实施例的剖视图；
[0025]图3为细胞冷冻过程的标准理想降温曲线(数据来源:Transfus Med Rev.1997Jul; 11(3):224-33)；
[0026]图4A为以本实用新型的以三明治方式排列组装的血袋渐冻保存装置在冻存法过程中，于包括2层尚未置入血袋的空铁夹的不同取样点所测到的降温曲线；
[0027]图4B为以本实用新型的以三明治方式排列组装的血袋渐冻保存装置在冻存法过程中，于包括2层已放置入血袋的渐冻盒(CryoBag)的不同取样点所测到的降温曲线；
[0028]图5为其它方式排列组装的血袋渐冻保存装置在冻存法过程中，于包括2层已置入血袋的渐冻盒(CryoBag)的不同取样点所测到的降温曲线；
[0029]图6为经过本实用新型中的血袋渐冻保存方法冻存之间叶干细胞(mesenchymalstem cells, MSCs)，于解冻后测得的细胞存活率图。
[0030]【主要组件符号说明】[0031]1-血袋渐冻保存装置；10-主体外壳；12-上盖；
[0032]20-血袋置入空间；
[0033]30-渐冻袋；
[0034]40-冷冻保存袋。
【具体实施方式】
[0035]本实用新型的其它特色及优点将于下列实施例中被进一步举例与说明，而该实施例仅作为辅助说明，并非用于限制本实用新型的范围。
[0036]首先参照图1及图2，详细描述作为本实用新型的一血袋渐冻保存装置I的结构及组装方式的实施例。如图1所示，本实用新型的血袋渐冻保存装置1，包括有一主体外壳10、一层以上的血袋置入空间20及二个以上的铁氟龙(Teflon)渐冻袋30，该主体外壳设置有一可供开启、密闭的上盖12，该每一层血袋置入空间20可供置入二个以上的血袋，该铁氟龙(Teflon)渐冻袋30内填充有渐冻剂，且于组装时分别装设于每一层血袋置入空间20的上、下部，并与血袋直接接触。
[0037]为达到最佳的冷冻保存效果，所述主体外壳10所构成的内部容量以可供容纳至多2层血袋及3个渐冻袋30为原则，亦即以本实用新型的单一血袋渐冻保存装置I而言，较佳承载上限为4个血袋，单层血袋置入空间20中置入至多2个血袋，而该渐冻袋30的大小以恰好能配合该主体内缘的长、宽为较佳。铁氟龙渐冻袋30内部充填有渐冻剂(已知较佳的渐冻剂为100%异丙醇(isopropyl alcohol)),其中所填充的渐冻剂量与该渐冻袋30面积的比例为，重量(g)/渐冻袋面积(cm2) = 0.7、.9。举例来说，以一袋子内缘长宽为21cm X 13.5 cm的渐冻袋30而言，其中较佳可充填200克的100%异丙醇。
[0038]本实用新型血袋渐冻保存装置I的组装方式实例:将该渐冻袋30于-30°C冰箱中预冷2.5小时以上。将收集得到的单一血袋置入铁夹中(此一组合以下简称为为冷冻保存袋40)，先暂存于4°C冰箱中，于所有冷冻保存袋40制备完成后，即进行本实用新型血袋渐冻保存装置I的组装。组装方式较佳地以三明治法进行交互层叠排列(如第2图所示)，其中将本实用新型的渐冻袋30分层堆栈在血袋40的上面及下面，而使冷冻保存袋40排列于上、下两个渐冻袋30之间，如此冷冻保存袋40的上、下两面皆可直接接触到渐冻袋30。于渐冻袋30间可横向平放单层冷冻保存袋40，单层最多2个冷冻保存袋40，并确认冷冻保存袋40皆平均受力于渐冻袋30上，完成渐冻袋30与冷冻保存袋的相互堆栈后，即可盖上该本体外壳10的上盖12。该上盖12与渐冻装置本体10可以压合或扣合的方式紧密闭阖。于组装完成后，将渐冻保存装置10置于_80°C冰箱中达6小时以上，较佳为6-10小时，使其逐渐降温至_80°C，方可移入液态氮桶中保存。
[0039]细胞冷冻须经过缓慢降温的过程，使细胞内的水分形成玻璃化凝固，非快速凝结成不规则状结晶而伤害细胞。降温至结晶形成(Pre-freeze)的最佳速率为每分钟温度下降1°C (-TC /分钟)。其标准理想降温曲线(STD)如图3 (摘录自Transfus Med Rev.1997 Jul; 11 (3):224-33)所示。
[0040]因此，进一步测试本实用新型以三明治层叠方式(以下简称三明治冻存法)，及其它排列方式所组装的渐冻装置，于降温过程中得到的降温曲线，以了解本实用新型血袋渐冻保存装置I的 细胞冷冻效果。于三明治冻存法过程中，该2层尚未置入血袋的空铁夹所测到的降温曲线一致，其降温速率接近每分钟下降1°C的STD (如图4A所示)。以本实用新型三明治法组装的血袋渐冻保存装置1，在整个冻存过程中该2层血袋放热时间短，放热温差(AT)小(1.6^2.6°C )，降温速率虽略慢于STD，但对大量细胞置于血袋保存效果佳，显示该2层冷冻保存袋40降温状况相似，降温缓慢，放热温差小(参见图4B所示)。而以两层血袋直接堆栈，再于该二层冷冻保存袋40的上、下层放置渐冻袋的冻存法(如图5)，由其降温曲线可发现，该2个冷冻保存袋40的液体结晶的放热时间长且放热温差(AT)大，表示本实用新型中以三明治冻存法的渐冻效果优于以血袋直接堆栈的冻存法。
[0041]细胞存活率(%)的比较。将细胞利用其它冻存方法如血袋直接堆栈冻存法及三明治冻存法，分别于_80°C下进行细胞渐冻，再置于液态氮保存，取出解冻后，于细胞冻存液中计数细胞。结果显示，以三明治法冻存后解冻的MSCs (mesenchymal stem cells),有较佳的细胞存活率(90.89%)，相较于血袋直接堆栈冻存法具有显著差异(图6)。而就细胞形态的观察结果而言，将MSCs于解冻后进行贴盘培养3天，发现该等细胞于恢复后，仍然具有其贴覆生长的特性。
[0042]利用本实用新型渐冻方法进行渐冻的MSCs，于冻存后解冻，再进行细胞表面抗原鉴定，及活体外分化能力分析。以带有荧光的特定抗体对细胞进行染色后，通过流式细胞仪，来侦测细胞是否有表现MSC特定标记(markers)。
[0043]表1.[0044]
【权利要求】
1.一种血袋渐冻保存装置，其特征在于，包括: 一主体外壳，其设有一能供开启、密闭的上盖，并于所述血袋渐冻保存装置组装完成后呈现密封； 一层以上的血袋置入空间，所述血袋置入空间容置有欲冻存的血袋；以及 二个以上的铁氟龙渐冻袋，所述铁氟龙渐冻袋与欲冻存的血袋接触，且所述铁氟龙渐冻袋中填充有能使降温速率达到-1°C /分钟的渐冻剂。
2.根据权利要求1所述的血袋渐冻保存装置，其特征在于，所述渐冻剂为异丙醇。
3.根据权利要求1所述的血袋渐冻保存装置，其特征在于，所述血袋置入空间与所述铁氟龙渐冻袋以交互堆栈方式，由下至上排列于所述血袋渐冻保存装置的主体内部。
4.根据权利要求3所述的血袋渐冻保存装置，其特征在于，所述血袋置入空间的上、下层皆与所述铁氟龙渐冻袋连接，且置入的血袋的上、下面都能分别接触到所述铁氟龙渐冻袋。
5.根据权利要求1所述的血袋渐冻保存装置，其特征在于，所述主体外壳的上盖以压合的方式与所述血袋渐冻保存装置的主体密合。
6.根据权利要求5所述的血袋渐冻保存装置，其特征在于，所述上盖的内面周缘设有与所述主体外壳的开口周缘密合的环状沟槽。
7.根据权利要求1所述的血袋渐冻保存装置，其特征在于，所述主体外壳的上盖以扣合的方式与所述血袋渐冻保存装置的主体密合。
8.根据权利要求7所述的血袋渐冻保存装置，其特征在于，所述主体外壳与上盖分别设有一组以上的相互扣合的外扣式装置。
【文档编号】A01N1/02GK203492656SQ201320456299
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年7月29日 优先权日:2013年7月29日
【发明者】程正仪, 吴昱珊, 梁莹, 王玮琦, 何慧君 申请人:仲恩生医科技股份有限公司