一种高效的玉米愈伤组织幼苗再生培养方法
【专利摘要】一种高效的玉米愈伤组织幼苗再生培养方法，本发明提供了一种生根效率高、生根质量好、炼苗效果好、移栽成活率高的玉米转基因组培方法：1.将分化培养基上组培苗分成单株，转生根壮苗培养基。2.组培苗长出3条主根时，开盖炼苗在培养基表面覆盖一层炼苗剂。3.炼苗7天，移栽到炼苗基质中，此基质是由园土和营养土按比例混合而成。4.先在育苗杯里装入2/3的基质，把苗子放进育苗杯，再用基质把苗子的根部埋上。5.栽入育苗杯的苗子要用带孔的塑料杯罩遮盖7天。6.摘掉杯罩后，再在温室里培养10天，搬到温室外炼苗3天移栽大田。7.栽入大田后用地膜覆盖地表，用遮阳网遮挡7天。8.有些苗子在培养瓶里生长时，会产生卷心现象，在炼苗时把卷心苗的心剥开提高成活率。
【专利说明】一种局效的玉米愈伤组织幼苗再生培养方法
[0001]本发明提供了一种玉米转基因高效组培方法，解决了目前组培过程中，组培苗生根率低、生根质量差，炼苗长霉菌死亡，移栽成活率低等制约玉米转基因规模化的问题。本发明提供了一种生根效率高、生根质量好的培养基配方；提供了炼苗剂，解决了炼苗期间培养基疯长霉菌导致组培苗死亡的问题；提供了合理的炼苗基质配方，即解决了园土板结的问题，又避免了营养土烧苗现象，还可以为苗子提供一定的营养基质，而且这种混合基质疏松透气、保水保湿，利于苗子的成活和生长；提供了高效的移栽方法等。此组培方法，大大提高了转基因玉米组培苗的成活率，促进了玉米转基因的科学研究，为玉米转基因育种奠定基础。
【技术领域】
[0002]本发明涉及一种生根效率高、生根质量好、炼苗效果好、移栽成活率高的玉米转基因组培方法。
【背景技术】
[0003]转基因技术的快速发展为农业生产带来巨大利益，该技术实现了定向育种，提高了育种效率。从80年代后期科学家开始进行玉米转基因研究，至今已经取得一些重要成果。国外已经有部分商业化种植的玉米转基因品种，例如高赖氨酸转基因玉米，抗玉米螟转基因玉米，抗除草剂转基因玉米等。因此，转基因育种已经成为现代分子育种的一种重要手段。转基因育种的一般过程可分为:分子构建、组培再生、大田育种三个阶段。组培再生阶段是指将含有目的基因的载体转化农杆菌，进而侵染愈伤组织，经抗性筛选后得到抗性愈伤组织，再经分化培养 获得再生苗，炼苗移栽，最后栽入大田的过程。栽入大田的再生苗越多，获得的阳性苗越多，后期的大田育种才会更有效。因此，在转基因育种过程中，组培再生是一个极其重要而且不可或缺的环节。目前，应用最广泛的玉米转基因受体材料是以玉米幼胚诱导培养获得的胚性愈伤组织，以此为基础的组培技术存在一些缺陷:1.目前运用的生根壮苗培养基生根效果不好，很多再生苗经生根壮苗培养基培养50天后，依旧没根，导致死亡；2.试管苗在移栽过程中，先前由于缺乏十分有效的促控手段，死亡损失较严重，致使转基因植株的获得很少，甚至一株没有，使得转基因育种很艰难。3.现有的炼苗方法，在培养瓶里培养基表面加入一层灭过菌的蒸馏水，即使加入很厚的一层水，也无法避免疯长霉菌，导致苗子死亡，而且，厚厚的水层导使苗子进行无氧呼吸，也加速了苗子的死亡。4.栽苗子的土也存在一些问题:营养土比例过高，容易烧苗导致苗子死亡；营养土比例过低，土壤板结，苗子也不易成活。5.刚栽入花盆的苗子严重失水萎焉，导致死亡；6.在花盆里长势很好的苗子，栽入大田后死亡率很高等。
【发明内容】
[0004]本发明提供了一种生根效率高、生根质量好、炼苗效果好、移栽成活率高的玉米转基因组培方法。[0005]实现本发明目的的转基因玉米组培方法，包括如下步骤。
[0006]1.将在培养瓶分化培养基上长至3cm-4cm的玉米组培苗分成单株，并将根部的愈伤组织剥离干净，移至生根壮苗培养基壮苗生根，所述生根壮苗培养基的成分为改良MS培养基，所用激素为生根粉ABT和矮壮素烯效唑，浓度分别为lmg/L和0.25mg/L，所用抗生素为噻孢霉素(Cephalothin),浓度为200 mg/L。
[0007]2.组培苗至少长出3条主根,每条主根长15cm左右,主根上长出毛细根时,开盖炼苗，在培养基表面覆盖一层l_2mm的炼苗剂，以免培养基长霉菌，导致苗子死亡。炼苗共7天，前3天带盖炼苗，给苗子一个渐变的适应外界环境的过程，以免苗子萎焉，后4天把盖子取掉炼苗，使苗子彻底适应外界环境。
[0008]3.炼苗7天后，苗子会变得浓绿健壮，移栽到炼苗基质中，此基质是由园土和营养土按照8:2的比例混合而成。园土比例过高，容易板结，不透气，不吸水，不利于苗子的成活和生长；营养土比例过高，会有烧苗现象，导致苗子死亡；按照园土与营养土 8:2的比例混合比较合适，即解决了园土板结的问题，又避免了营养土烧苗现象，还可以为苗子提供一定的营养基质，而且这种混合基质疏松透气、保水保湿，利于苗子的成活和生长。炼苗基质不需要灭菌，防止高温破坏基质中的营养成分，栽上苗子后用步骤2中的炼苗剂原液，用自来水稀释成工作浓度为400mg/L的水溶液，把基质浇透即可。
[0009]4.先在育苗杯里装入2/3的炼苗基质，用镊子把苗子从培养基中轻轻拔出，切忌不要用水洗根，减少对根部的伤害，如根部沾有大块培养基，可以用镊子轻轻夹掉。然后将苗子放进育苗杯中部，尽量让根系散开，再用基质把苗子的根部埋上，轻轻按压即可。
[0010]5.栽入育苗杯的苗子要用带孔的塑料杯罩遮盖7天左右，待苗子长出新叶，便可取掉。杯罩可以保水保湿，防止刚栽入花盆的苗子萎焉。栽入花盆的苗子要给予充足的光照，有利于苗子的成活。
[0011]6.摘掉杯罩后，再在温室里培养10天左右，待苗子长到约20cm高时，搬到温室外炼苗3天，便可移栽到大田。
[0012]7.栽入大田后，用地膜覆盖地表，用遮阳网遮挡7天，防止阳光暴晒死亡。待苗子恢复浓绿健壮，便可撤掉遮阳网。
[0013]8.有些试管苗在培养瓶里生长时，由于空间不足或缺水等问题，会产生卷心现象。在炼苗或栽入育苗杯时，把卷心苗的心剥开，依然会成活。如果不剥开的话，这些苗子就会死亡。获得的每一颗转基因苗子都很珍贵，所以要尽量使每一颗成活。
[0014]所述步骤I中的生根壮苗培养基，其特征在于此培养基为改良的MS培养基，改良的MS培养基配方如下表所示:
【权利要求】
1.一种高效的玉米愈伤组织幼苗再生培养方法，包括生根效率高的生根壮苗培养基、有效的炼苗方法、良好的炼苗基质和成活率高的移栽技术，本发明中有效的炼苗方法主要在于应用了自创的炼苗剂，配方如下:100片每瓶的制霉菌素片，用研钵将其磨成粉末状装在瓶子里备用；用前将粉末状制霉菌素用无菌蒸馏水溶解，配备成40mg/ml的炼苗剂原液，放置2小时以上，使其溶解；炼苗时，每升无菌蒸馏水中加入IOml的40mg/ml制霉菌素原液，就配成了炼苗剂，加在培养基表面，用来炼苗。
2.如权利要求1所述的良好的炼苗基质特征在于，由园土和营养土按照8:2的比例混合而成，炼苗基质不需要灭菌，防止高温破坏基质中的营养成分，栽上苗子后用步骤2中的炼苗剂原液，用自来水稀释成工作浓度为400mg/L的水溶液，把基质浇透即可。
3.如权利要求1所述的成活率高的移栽技术中，为防止刚栽入育苗杯的苗子失水萎焉死亡，给苗子罩上带孔的塑料杯罩，此塑料杯罩由一次性奶茶杯做成，在杯底打上3个孔，用来通气。
4.如权利要求1所述的有效的炼苗方法中，有些试管苗在培养瓶里生长时，由于空间不足或缺水等问题，会产生卷心现象，在炼苗或栽入育苗杯时，把卷心苗的心剥开，会显著提高成活率。
【文档编号】A01H4/00GK103988779SQ201410216468
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年5月22日 优先权日:2014年5月22日
【发明者】潘光堂, 刘敏, 沈亚欧, 李婉蓉, 张志明, 林海建, 彭焕伟, 葛飞, 吴花拉 申请人:四川农业大学