‘南通小方柿’DkGA2ox1 基因及其表达载体和应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，涉及‘南通小方柿’DkGA2ox1基因及其表达载体和应用。本发明首次从‘南通小方柿’克隆得到了一个新的DkGA2ox1基因，将其导入烟草，DkGA2ox1在烟草中过量表达；DkGA2ox1转基因烟草具有较强的矮化能力，可使植株矮化至野生型植株的41.54％。
【专利说明】'南通小方柿' DkGA2ox1基因及其表达载体和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及'南通小方柿' DkGA2oxl基因及其表达载体和应 用。
【背景技术】
[0002] 矮化植株株型紧凑，冠幅小，抗倒伏，且生产管理方便，丰产性能好。通过基因工程 的手段利用矮化性状可以显著提高小麦和水稻等作物的产量，从而引发了上世纪响誉全球 的"绿色革命",从而使矮化育种成为植物育种的发展趋势。赤霉素（gibberellin，GA)是一 类四环二萜羧酸，作为五大植物激素之一，影响着高等植物生长发育的各个阶段，如种子萌 发、茎的伸长、花的诱导分化和性别决定、果实坐果等。早在1926年被日本植物病理学家发 现，目前已发现赤霉素类物质 136 种（http://www. plant - hormones, info/gibberellins. htm)。其中，只有GAi、GA3、GA4、GA5、GA7等少数赤霉素具有生物活性，其余为合成前体或降解 产物。赤霉素2-氧化酶（GA2i3 -羟化酶，GA2ox)是植物体内赤霉素代谢过程中的关键酶， 是由多基因编码的双加氧酶，作用于有生物活性的GAi和GA 4，使其在C - 2位羟基化转变成 无活性的GA8和GA34，令植物体内GAs的活性降低而使植物节间缩短，产生矮化性状。其矮 化功能已在拟南芥、烟草、小麦、茄科植物、百喜草、水稻、杨树、李树、长寿花和矮牵牛中得 到验证。果树的矮化栽培更具有早果、质优、更新快、效益高的优点。柿（Diospyros kaki) 最早栽培于我国，已有2000多年历史，我国亦是其原产地之一。但我国柿品种多为高大乔 木，不便于管理栽培。'南通小方柿'（Diospyros kaki Linn. cv.Nantongxiaofangshi)是 1982年在江苏省进行果树资源普查时于南通市发现的珍稀矮生型柿树品种。干性弱，无明 显中心干，树姿开张，表现出明显的矮生性状；成年树高仅3. 5 - 4米，为同等条件下生长的 乔化品种的60%。但有关该品种矮生特性的分子层面的研究却尚未开展，是否与GA相关也 还不了解。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一个新的'南通小方柿' DkGA2oxl基因。
[0004] 本发明的又一目的是提供含有该基因的重组表达载体。
[0005] 本发明的又一目的是提供该基因的应用。
[0006] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：
[0007] '南通小方柿' DkGA2oxl基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 含有所述的DkGA2oxl基因的重组表达载体。
[0009] 所述的重组表达载体优选将所述的DkGA2oxl基因插入到表达载体pYH4215的 BamHI和SacI酶切位点之间所得。
[0010] 含有所述的DkGA2oxl基因的宿主。
[0011] 所述的宿主优选农杆菌。
[0012] 所述的DkGA2oxl基因在创制矮化新种质和/或植物品种改良中的应用。
[0013] 所述的含有DkGA2oxl基因的重组表达载体在创制矮化新种质和/或植物品种改 良中的应用。
[0014] 有益效果：
[0015] 由于现有技术中尚未有柿科DkGA2oxl同源基因的报道，本发明通过同源克隆的 方法，根据Genbank中其他物种中已知同源序列的保守区设计引物，经多次试验筛选引物 及利用梯度PCR的方法对退火温度的进行不断优化得到了 DkGA2oxl的中间片段。本发 明首次从'南通小方柿'克隆得到了一个新的DkGA2oxl基因，通过blast将DkGA2oxl核 苷酸序列与NCBI上登录的其它物种进行序列比对，DkGA2oxl与毛白杨（JX102472. 1)、 夹竹桃（AY594292. 1)、烟草（AB125232. 1)、矮牵牛（⑶059939. 1)、苹果（FJ57152L 1)、 梨（JF441168. 1)、葡萄（KC898179. 1) -致性分别为 77%、76%、76%、76%、76%、75%、 74%。南通小方柿' DkGA2oxl氨基酸序列的同源性分析和比对结果表明，本研究所获得的 DkGA2oxl与其他物种已知基因之间同源性较低，说明两基因在不同物种间保守性不高，在 进化过程中所发生的变异程度也不同。
[0016] 本发明还构建了 DkGA2oxl的重组表达载体，将其导入烟草，DkGA2oxl在烟草 中过量表达；DkGA2oxl转基因烟草具有较强的矮化能力，可使植株矮化至野生型植株的 41. 54%。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1转DkGA2oxl基因烟草PCR检测
[0018] 其中Μ表示marker，CK表示非转基因对照植株，P表示阳性对照（质粒），1 - 21 表示DkGA2oxl转基因烟草株系。
[0019] 图2转DkGA2oxl基因烟草RT - PCR检测
[0020] 其中Μ表示marker，CK表示非转基因对照植株，P表示阳性对照（质粒），1 - 10 表示DkGA2oxl转基因烟草株系。
[0021] 图3移栽80天的转基因烟草株系的表型观察。
[0022] 其中，WT :非转基因烟草株系；1 - 1，1 - 3 :转DkGA2oxl基因烟草株系（下同）。
[0023] 图4转基因烟草株系的株高变化情况。
[0024] 图5外源喷施GA3可恢复转基因烟草表型
[0025] 其中，A :喷施6^前；B :喷施6^后
[0026] 图6转基因植株叶片GA1+3含量。
[0027] 图7转基因和对照株系不同叶位上叶片的叶绿素含量。
[0028] 其中横坐标4,10,16分别代表植株由下往上第4,10,16叶位叶片。
[0029] 图8过量表达DkGA2oxl基因诱导烟早NtGA20ox、NtGA3ox和基因的表达。
[0030] 图9 pYH4215质粒图谱。
【具体实施方式】
[0031] 实施例1
[0032] 取'南通小方柿'叶片，参考蔡斌华等改进的CTAB法提取RNA。根 据GenBank中公布的GA2ox基因 cDNA序列保守区域设计一对简并引物。 GA2ox-F ：5, - AAYGGYGATRTBGGHTGGRTYGAATA - (SEQ ID NO. 2) ；GA2ox-R ： 5' -TGCYTYACRCTYTTAAAYCTYCCATTWGTCA-3'（SEQ ID NO.3);其中，Y:代表 C 或 T;R 代表 A或G ;B代表C、T或G ;H代表A、T或C ;W代表A或T。
[0033] 中间片段的获得
[0034] 总 RNA 中 DNA 的消化：（TaKaRa code:D2270A)。反转录参照 PrimeScript? RT reagent Kit (Perfect Real Time) (TaKaRa code:RR037A)。PCR 扩增体系：100ng/yL cDNAl μ L，10XPCR Buffer2. 5μ L，MgCl2(25mM) 1. 5μ L，dNTP(2. 5πιΜ)2μ L，上下游引物 (GA2ox-F/GA2ox-R)各 1 μ L，0. 15 μ L rTaq 酶，用水补足至 25 μ L。PCR 程序为：94°C 4min ; 94°〇3〇8,531：3〇8,721：4〇8,35个循环；721：延伸1〇1^11。产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳分 析。回收目的片段并连接到PMD19-T载体上转化DH5 α感受态细胞随机筛选白色菌落进行 测序。
[0035] 3'末端的获得
[0036] 反转录时将PrimeScript? RT reagent Kit中Ramdom6替换为接头引物 R11466 :5' -G CAGGACTGCAGCTGACTGACTACT30VN- 3'，其中 V 代表 A 或 G 或 C，N 代 表：A、T、C或G(SEQ I D勵.4)，反转录反应的温度从371：调至421：，反转录酶的失活 反应的温度从85°C调至95°C)。PCR程序及体系亦同于中间片段的获得。以通用引物 R16326:5' -GGTGGTAGAGCTCGCAGGACT GCAGCTGACTG-3'（SEQ ID N0.5)和特异外侧引 物 GA2oxl3 ' GSP-1 :5' - AGTTGCTGGCTGATGGGTTG - 3'（SEQ ID NO. 6)进行第一轮扩 增，反应体系及程序如下：PCR扩增体系：100ng/yL cDNAlyL，10XPCR Buffer2. 5yL， 1%(：12(251111)1.5 4 1^，（1阶13(2.51111)2 4 1^，上下游引物各14 1^，0.15 4 1^1^&9酶，用水补足至 25 4 1^。？0?程序为：941：4111丨11;941：3〇8,611：3〇8,721：4〇8,35个循环 ；721：延伸1〇111丨11。将 第一轮PCR产物稀释10倍后做模板，以内侧引物R16324 :5' - AGAGCTCGCAGGACTGCAGCAGCT GACTGACTAC - 3,（SEQ ID NO. 7)与G A2oxl3，GSP-2 :5' - TCTGCGGCTCAACCACTACC - 3,（SEQ ID NO. 8)进行第二轮扩增，体系同上。
[0037] 5'末端的获得
[0038] cDNA 的获得参照 SMARTer? RACE cDNA amplification kit (Clontech， Cat. Nos. 634923&634924)。利用 UPM 和特异的外侧引物 GA2oxl5 ' GSP-1 : 5' -AGAAGGAACTTTCGTCGGGTGGG-3'（SEQ ID NO. 9)进行降落 PCR 的第一轮扩增，反应体 系及程序如下：l〇XEx Taq bufTer2.5yL，MgCl2(25mM)1.5yL，100ng/yL cDNAl.OyL， GSP-10. 5 μ L，UPM2. 0 μ L，dNTP (2. 5mM) 0· 5 μ L，Ex TaqO. 2 μ L，ddH2017. 8 μ L，终体积 25. OyL。反应条件为：94°C 5min;94°C 30s，70°C 降落到 68°C 30s (每循环降低 0. 5°C )， 721：2111丨11，5个循环；941：3〇8,681：3〇8,721：，9〇8，共30个循环；721：1〇111丨11。将第一轮？0? 产物稀释10倍后做模板，以内 3'（SEQ ID N0. 10)与NUP进行第二轮扩增，体系同上。产物用1 %琼脂糖凝胶电泳分析，切 胶回收目的片段进行T/A克隆后测序。
[0039] 利用DNAMAN对5'端、3'端及中间片段正确克隆的序列进行拼接，得到基因的全 长序列，如SEQ ID NO. 1所示。用BLAST进行相似性检索，发现DkGA2oxl核苷酸序列与毛 白杨（JX102472. 1)、夹竹桃（AY594292. 1)、烟草（AB125232. 1)、矮牵牛（⑶059939. 1)苹 果（FJ571521. 1)、梨（JF441168. 1)、葡萄（KC898179. 1)的一致性分别为 77%、76%、76%、 76%、76%、75%、74% ;属于GA2-氧化酶家族。
[0040] 实施例2
[0041] 根据载体和DkGA2oxl基因的酶切位点，设计含有BamHI和SacI基因特异引物， DkGA2oxlB-F:5'-CGGGATCCATGGTGGTTTTATC-3'（SEQ ID N0.11) ;DkGA2oxlS-R:5'-CGAGC TCTCACGAGGCGGCAAC-3'（SEQ ID NO. 12);以'南通小方柿'全长 cDNA 为模板，进行 PCR 扩 增，PCR 反应体系为：100ng/y L cDNAl μ L，10XPCR Buffer2. 5μ L，MgCl2(25mM) 1. 5μ L， dNTP(2. 5mM)2yL，上下游引物各lyL，0. 15yL rTaq酶，用水补足至25yL。PCR程序为： 94°〇411^11;941：3〇8,621：4〇8,721：7〇8,35个循环；721：延伸1〇1^11。产物在1%琼脂糖凝 胶电泳分析。回收目的片段并连接到PMD19-T载体上转化DH5a感受态细胞随机筛选白色 菌落进行测序。
[0042] 将原始的PYH4215载体及经测序验证正确后的pMD19-T载体中DkGA2oxl基因利 用BamHI和SacI进行双酶切。割胶回收载体和基因片段，连接5h后转化大肠杆菌。菌液 PCR鉴定阳性克隆，随机挑取3个单克隆送样测序，以确保产物的准确性及特异性。提取质 粒，PCR和酶切鉴定。将大肠杆菌质粒用冻融法转入农杆菌EHA105感受态细胞，菌液PCR鉴 定阳性克隆。
[0043] 实施例3
[0044] 冻融法将重组质粒转化农杆菌EHA105,调取单菌落于50ml含Km50mg · L-1的YEB 液体培养基中，28°C，200rpm摇床培养至0D600值约0. 5时，5000rpm离心lOmin，倒去上清。 菌体用50ml MS不含激素，不调pH的液体培养基重新悬浮，摇床培养lh ;取30d苗岭生根 健壮烟草祖培苗，从顶部剪取第4和5片完全展开叶，将烟草叶片剪成l-2cm2的叶块放入 上述培养基中，不断轻摇浸泡3min ;用镊子取出叶片，放在无菌滤纸上吸去多余菌液，接种 于共培养培养基（MS+BA1. Omg ?P+NAAO. 2mg ·?ΛρΗ5. 8)中，28°C暗培养2-3d ;结束后，将 烟草叶片转入筛选培养基（MS+6-BA1. Omg · L i+NAAO. 2mg · L i+hygSOmg · L i+cbZOOmg · L S pH5. 8)中，直接置于25°C下光照培养，光暗周期16h/8h，光强为40-50μηιο1 ·πΓ2 .s4,每两 周继代培养一次，直至愈伤组织分化出抗性植株。待抗性芽长至3-5cm时，剪下接入生根培 养基（1/2MS+IBA0. 2mg · L i+hygSOmg · L i+CbZOOmg · L S ρΗ5· 8)中诱导生根。一个月后打 开瓶盖，进行自然光照，温度控制在20-25°C，炼苗1周。再将转基因苗移栽至育苗杯中，保 持环境湿润，待可健壮生长后置于室外自然条件下培养。
[0045] 实施例4转基因烟草株系的检测
[0046] 在超净工作台上剪取转基因烟草及未侵染的野生型烟草叶片，浸入10μ 1⑶S染 液中，放置37°C培养箱中过夜后，使用70%乙醇脱色观察染色结果。对染色结果为蓝色的 植株提取基因组DNA和总RNA，进行PCR和RT-PCR的检测。
[0047] 4. 1基因组DNA和总RNA的提取
[0048] 基因组DNA和总RNA的提取参考蔡斌华等（2008)和张计育等（2010)的方法，并 稍作修改，具体方法如下：取幼苗叶片约〇. 3g于液氮中迅速研磨成粉末，加入含有900 μ L CTAB裂解液的2mL离心管中，65°C水浴30min(每10min轻轻颠倒混匀一次），加入等体积 的氯仿：异戊醇（24 :1)，轻轻上下颠倒混勻；4°C，12000rpm离心15min，取上清，加入等体 积氯仿：异戊醇（24 :1)，轻轻上下颠倒混匀；4°C，12000rpm离心15min，取上清，重复抽提 一次；转移上清至新的1. 5mL离心管中，加入两倍体积的-20°C预冷的无水乙醇和1/10的 3M的NaAc (ρΗ5· 2)(提取DNA)或者加入等体积的10M LiCl (提取总RNA)，- 20°C静置直至 絮状沉淀出现，4°C，12000rpm离心15min ;70%乙醇洗涤沉淀1 - 2次，超净工作台上干燥， 溶于50 μ L DEPC处理过的ddH20中。取1 μ L的总核酸，用1 %的琼脂糖凝胶电泳进行检 测。4. 2PCR检测
[0049] 取上述提取的总核酸20 μ L进行基因组中RNA的消化，具体参照佟照国等（2008) 的方法。将消化后的基因组DNA溶解于20 μ L的ddH20中，取1 μ L的核酸，用1 %的琼脂糖 凝胶电泳进行检测。DNA在Bio - photometer上检测浓度，体系为1 μ L DNA样加入49 μ L ddH20, DNA浓度、0D280/0D260直接从仪器上读取。
[0050] PCR检测模板：转基因植株DNA、阳性质粒样品、非转基因对照植株DNA ;PCR引物参 照表 1 ;扩增反应体系：l〇〇ng/y L cDNAl μ L，10XPCR Buffer2. 5μ L，MgCl2(25mM) 1. 5μ L， dNTP(2·5mM)2μL，引物DkGA2oxlB-F(SEQIDN0·ll)和DkGA2oxlS-R(SEQIDN0·12)各 lyL，0.15yL rTaq 酶，用水补足至 25yL。PCR 程序为：94°C4min;94°C30s，62°C40s， 72°C 70s，35个循环；72°C延伸lOmin。产物在1%琼脂糖凝胶电泳分析，结果见图1。
[0051] 4.3RT-PCR 检测
[0052] 将提取的总RNA在Bio - photometer上检测浓度，体系为1 μ L RNA样加入49 μ L ddH20, RNA 浓度、0D280/0D260、0D260/0D230 直接从仪器上读取；取 1 μ L 的总 RNA，用 1% 的琼脂糖凝胶电泳进行检测，剩余的总RNA进行DNA消化后反转录成cDNA，具体方法参考说 明书（TaKaRa DRR047A)进行，合成后的cDNA于-20°C保存备用。
[0053] RT - PCR检测模板：转基因植株cDNA、阳性质粒样品、非转基因对照植株cDNA ;其 余同PCR检测，结果见图2。
[0054] 实施例5转基因烟草矮化性状分析
[0055] 5. 1转基因烟草植株形态指标的测定
[0056] 转基因植株在茎和叶的形态上发生了显著变化（图3)，移栽后80d野生型烟草对 照株系已到达盛花期，而转基因株系1 - 1刚进入现蕾期，但花序数量明显减低。1 - 3则还 未有花期的迹象，表现出花期延迟的现象。且植株明显矮小，叶型紧凑。为了更精确的量化 这些现象，对移栽80天的对照和转基因烟草株系进行株高、节间、茎粗、叶片长度（从叶基 部到叶尖）和叶片宽度（叶片最宽距离）的测量，计算叶片长宽比。表1结果显示2个转 基因株系株高均与对照有极显著差异，1 - 1、1 - 3的株高为对照的63. 52%和41. 54%。另 夕卜，转基因株系节间距离缩短，为野生型烟草的86. 78%和39. 67% ;茎粗增粗，比野生型烟 草增长11. 91 %和57. 40% ;叶片长度缩短，为野生型烟草的76. 74%和52. 94% ;叶片宽度 增大，比野生型烟草增长25. 00%?21. 83% ;以上指标均到达极显著差异水平。
[0057] 野生型烟草和转基因株系的生长趋势大体相同，在移栽后20d之前长势区别不 大。但在移栽后60d -80d野生型烟草快速增长的期间，转基因株系的株高并没有大幅度的 提高，而继续保持和缓的生长趋势（图4)。
[0058] 于移栽后30d对转基因烟草植株及对照喷施100mg/L的GA3。每周两次，连续喷 施。30天后观察表型发现，通过施用外源GA3处理，转基因植株节间迅速伸长，能够正常开 花，可恢复正常表型如图5。
[0059] 表1转DkGA2oxl基因植株形态指标的测定
[0060] WT DkGA2oxl 1-1 1-3 株高（cm) 82 33土2.59 50.3±2.69** 33.73±1.33** 节间（cm) 4.03±0.12 3.5±0.1 ** 1.6±0.1** ^?i(mm) 9.23±0.15 10.33±0.15** 14.53±0.47** 叶片长度（cm) 24.B7±1.59 18.70丄0.55** 12.9丄0.66** 叶片宽度（cm) 8 4±0.26 10.5±0.1** 10.23±0.15** 叶片长宽比 2.9±0.10 1.78 + 0.04** 1.26 + 0.Q3**
[0061] WT :非转基因烟草株系；1 - 1，1 - 3 :转DkGA2oxl基因烟草株系；
[0062] WT:non - transgenic tobacco plant ; 1 - 1，1 - 3:transgenic tobacco plants of DkGA2oxl ；
[0063] 注：表中**表示经邓肯氏多重极差测验，达到1%显著水平〃
[0064] Note :Meanswith*aresignificantlydifferent (P<0. 01)
[0065] 5· 2· 1赤霉素含量的测定
[0066] 在花期取转基因与野生型烟草植株完全展开的功能叶（上数第四片展开叶），用 酶联免疫吸附测定法（ELISA)测定含量，结果表明：转基因株系的GA含量均低于对照（图 6);转基因株系1 _1、1 -3叶片GA含量为对照65. 33%和45. 02%;说明该基因在烟草中的 过量表达，有效的抑制了植株内源赤霉素的合成，从而使转基因植株的株高明显变矮。
[0067] 5. 2. 2光合效率测定
[0068] 于花期晴天的上午（10:00 - 12:00)，使用LI - 6400XT型便携式光合测定仪测定 转基因烟草与野生型烟草的光合速率情况，测定部位为烟草植株由下而上第12片叶，避开 主叶脉，每株系挑选长势均匀的3株，同一叶片重复测3次，记录净光合速率、气孔导度和蒸 腾速率，结果见表2。结果表明：转基因株系净同化效率比对照上升了 11. 26%和30. 67%。 蒸腾速率与气孔导度呈正相关，转基因株系蒸腾速率仅为对照的83. 08 %和64. 18%，气孔 导度为对照的86. 05 %和69. 77%。
[0069] 表2转DkGA2oxl基因烟草光合速率指标的测定
[0070] 株系净同化速率（μιηοΙ.ην2^1) 蒸腾速率（mmol rrT2.s_1) 气孔导度（γπιτιοΙ·ιτΓ2_5_1) WT 6.7510.59 4.55±0.63 0.43+0.0B 1-1 7.51±0.68** 3.78±0.93** 0.37±0.08** 1-3 8.82±1.42** 2 92±0.85** 0.30±0.03* +
[0071] 注：WT :非转基因烟草株系；1 - 1，1 - 3 :转DkGA2oxl基因烟草株系；
[0072] WT:non - transgenic tobacco plant ; 1 - 1，1 - 3: transgenic tobacco plants of DkGA2oxl ；
[0073] 注：表中**表示经邓肯氏多重极差测验，达到1%显著水平〃
[0074] Note :Meanswith*aresignificantlydifferent (P<0. 01)
[0075] 5· 2· 3叶绿素含量的测定
[0076] 移栽后第8周取烟草植株上部、中部和下部的叶片为材料测定叶绿素的含量。叶 位计数是由下往上，下部、中部和上部分别是第4,10,16叶位叶片。如图7所示，各转基因 株系和野生型对照株系的变化趋势基本相同：从嫩叶到老叶，叶绿素含量呈现下降趋势，中 部和上部的叶绿素含量差别不大。转基因株系的叶绿素含量均高于野生型对照株系，矮化 更为显著的转基因株系1 - 3的叶绿素含量比矮化程度相对较轻的1 - 1株系的叶绿素含量 高。中部叶片中叶绿素增加的幅度最大，比野生型增加了 29. 03%。以上表明，DkGA2oxl基 因在烟草中的表达提高了叶片叶绿素的含量，使得叶片颜色加深。
[0077] 5. 3转基因烟草GA2ox相关基因的表达分析
[0078] 根据NCBI数据库网站上登录的烟草GA20ox、GA3ox序列，利 用Beacon Designed. 0设计基因特异引物，烟草GA20ox基因特异性引物 为 NtGA20ox-F:5，-TGCTTTCTTTCTTTGTCCAA-3' （SEQ ID N0.13)，NtGA20ox-R: 5'-CTCTGTAATGCTTCTGTGTAA-3'（SEQ ID N0.14) ;GA3ox 基因特异性引物为 NtGA3ox-F: 5, -AAGACTGATGTGGCTCAT-3， （SEQ ID Ν0·15)， NtGA3ox-R:5, -TGTTAATATGGTAGAA TCCGTATGT-3'（SEQ ID NO. 16)。本实验以烟草Tubulin基因为内参基因，其特异 性引物为NttubAl-F:5'-CTTATGTTCCGTGGTGATG-3'（SEQIDN0·17)，NttubAl-R : 5'-TTGGTGGCTGATAGTTGA-3'（SEQ ID N0. 18)。通过荧光定量RT-PCR技术研究转基因烟草 株系中GA20ox、GA3ox基因的表达特性。qRT -PCR反应体系为cDNAl μ L，上下游引物分别为 0· 2pmol · L - 1SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa) 10 μ L，ddH208. 6 μ L。反应条件为 95°C 4min ; 95°C 20s，60°C 20s，72°C 40s，40个循环。试验设置3次重复。数据分析采用7300system 软件和的方法。结果表明：在转基因烟草株系中，NtGA20〇X和NtGA3ox基因的表达得 到了不同程度的加强。其中NtGA3ox基因的表达量的上升幅度相对较大（图8)。
[0079] 本发明首次从'南通小方柿'克隆得到了一个新的DkGA2oxl基因，并构建了 DkGA2oxl表达载体，通过农杆菌介导法转化野生烟草。从表型上看DkGA2oxl转基因植株表 现出矮化性状：叶片长度变小、宽度变大，叶片长宽比减小，叶色加深，茎粗增大，节间减小； 花期延迟，且花序数量明显降低，说明烟草中过表达DkGA2oxl对生殖器官的生长发育具有 一定影响；外源施用GA 3后可恢复表型。这表明，DkGA2oxl的过度表达降低了烟草中生物活 性GA的水平，矮化表型是由生物活性GA不足引起的。在拟南芥AtGA2ox7和AtGA2ox8的 过表达和水稻中0sGA2ox6, 0sGA2ox5 - 0X植株也表现出类似的矮化性状。
[0080] 我们对编码GA生物合成途径基因的酶的基因进行了表达分析。与WT相比，转 DkGA2oxl烟草中GA生物合成基因 NtGA20ox和NtGA3ox都得到了不同程度的上调。这可能 是由于过表达DkGA2oxl降低了烟草中内源GA的含量，赤霉素的反馈调节机制使得其他赤 霉素相关的基因的表达量也上升以维持植物体内赤霉素的动态平衡。其中NtGA3ox表达量 的增幅较大可能是因为它是编码生物活性GA合成过程中最后的关键酶。GA20 〇X和GA3ox 的上调已经在GA缺陷和GA不敏感突变体中被报道。由此，可以推测转基因矮化表型的差 异可能是由以下两个原因造成，其一，转基因烟草株系中的基因插入位点和拷贝数存在差 异，或者是转基因嵌合体所致；其二，转基因株系可能受到程度不一的农杆菌或者其它的外 界环境影响。
[0081] 转基因株系在所测定的3个光合作用参数上与野生型烟草对照存在明显差异：其 净同化速率上升，并且气孔导度和蒸腾速率都有减小。叶绿素在植物光合作用中扮演光能 吸收与传递的作用。在有效的范围内，随叶绿素含量的增加，光合速率也随之增加，从而导 致生物产量的提高。也许是由于转基因烟草体内GAs含量的降低影响了叶绿素的代谢过 程，从而使得叶绿素含量增大令光合速率随之提高。同时叶片细胞结构也发生了改变，叶片 变厚，气孔导度低导致蒸腾速率降低，以避免水分的无效损耗，提高叶片的储水能力。
【权利要求】
1. '南通小方柿' DkGA2oxl基因，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 含有权利要求1所述的DkGA2oxl基因的重组表达载体。
3. 根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于所述的重组表达载体是将所述的 DkGA2oxl基因插入到表达载体pYH4215的BamHI和SacI酶切位点之间所得。
4. 含有权利要求1所述的DkGA2oxl基因的宿主菌。
5. 根据权利要求4所述的宿主菌，其特征在于所述的宿主菌为农杆菌。
6. 权利要求1所述的DkGA2oxl基因在创制矮化新种质和/或植物品种改良中的应用。
7. 权利要求2所述的含有DkGA2oxl基因的重组表达载体在创制矮化新种质和/或植 物品种改良中的应用。
【文档编号】A01H5/00GK104152468SQ201410243418
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年6月3日 优先权日:2014年6月3日
【发明者】渠慎春, 屠煦童, 蒋振莹, 蔡斌华, 张仕杰, 陈小云, 李宁宁, 章镇 申请人:南京农业大学