一种利用柳枝稷幼穗进行无性繁殖的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用柳枝稷幼穗进行无性繁殖的方法，在柳枝稷第4个节完全露出时，取柳枝稷幼穗作为诱导外植体；将外植体消毒后，在两端各切下0.5cm，并纵向将外植体切为两半，切面向下接种到诱导培养基上；30～40天后获得穗芽，对获得的穗芽进行继代培养，进一步扩大穗芽的数量；将继代后的穗芽从芽块分离成单个个体种植到培养基质中，约7天后即可生根，发育成为新的植株，此时可将幼苗连同培养基质栽植于温室或大田。本发明中的无性繁殖方法，以柳枝稷幼穗为外植体，通过诱导及继代培养，能够获得大量基因型完全一致的后代。
【专利说明】一种利用柳枝稷幼穗进行无性繁殖的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于柳枝稷组织培养【技术领域】，涉及一种柳枝稷无性繁殖的方法。
【背景技术】
[0002]柳枝稷(英文名Switchgrass,拉丁名Panicum virgatum Linn)为禾本科黍属多年生草本植物，原生于北美地区，具有栽培简单、抗逆性强、生物学产量高等特点。20世纪80年代，柳枝稷被确定为模式生物能源植物，并于20世纪90年代被我国科研工作者引入国内。在化石燃料日益紧缺的今天，人们对柳枝稷的研究愈加重视，近几年来，国际上公开发表的关于柳枝稷的科研论文每年都超过300篇。
[0003]柳枝稷为异花授粉植物，具有很强的自花不亲和性，因此，有性繁殖获得的后代个体基因型多数存在差异。与有性繁殖方式相比，无性繁殖是由植物营养器官直接发育成新个体的过程，整个过程不涉及染色体的分离和重组，所产生的后代与亲本具有完全一致的基因型，在柳枝稷优良基因型保持及生物技术研究过程中具有重要的意义。
【发明内容】
[0004]本发明解决的问题在于提供一种直接将柳枝稷幼穗诱导成穗芽的方法，该方法涉及植物器官逆向发育过程，为柳枝稷无性繁殖提供一条新的途径。
[0005]本发明是通过以下技术方案来实现:
[0006]一种利用柳枝稷幼穗进行无性繁殖的方法，包括以下操作:
[0007]1)待柳枝稷生长发育至第4个节完全露出、幼穗已形成时，从靠近地面处将柳枝稷分蘖剪下，从下向上剥去柳枝稷分蘖上的叶片至节间长度小于Icm时停止，距该节间上端茎节上下各1.2~1.5cm切下，获得包含幼穗的外植体；
[0008]2)将外植体消毒并用无菌水漂洗；
[0009]3)无菌环境下，将外植体两端各切去0.2~0.5cm,将外植体纵向切为两半，切口向下接种到诱导培养基上；接种后置于恒温光照培养箱中，培养30~40天至穗芽形成；
[0010]所述的诱导培养基是以MS为基础培养基，并添加6-BA、琼脂粉和蔗糖；
[0011]4)将形成的穗芽沿基部2~3mm处切除，并再次接种到诱导培养基上，待新生芽生长至1.2~1.5cm，重复继代培养3~4次，获得扩繁后的穗芽；
[0012]5)在不损害生长点的情况下，将穗芽从基部自芽块上拆分下来，将穗芽单独直接扦插到培养基质中，培养7天后，待单独的穗芽生根并发育成独立的幼苗，将幼苗连同培养基质栽植于温室或大田。
[0013]所述的外植体中包含有2cm左右长度的幼穗，具有正常花原基组织。
[0014]所述的外植体的消毒处理为:先用体积分数为70%的酒精消毒I~2min，然后用体积分数5~8%的次氯酸钠溶液消毒2~3min ；
[0015]消毒完成后并用灭菌水漂洗3次。
[0016]所述的诱导培养基的成分为:MS基础培养基4.43g/L，3mmol/L的6_BA、7.5g/L的琼脂粉和30g/L的蔗糖。
[0017]所述在恒温光照培养箱进行培养时，其培养温度为20~25°C、每天光照20h、黑夜4h0
[0018]所述，在进行继代培养时，采用上次培养的新生芽进行接种，接种时新生芽的长度为 1.0cm。
[0019]以体积比计，所述的培养基质的组份为栽培土:腐叶土:河沙=I:3:1，栽植前一天在基质中加水，直到吸水饱和。
[0020]所述的幼苗为相同基因型的幼苗。
[0021]本发明提出的利用柳枝稷幼穗进行无性繁殖的方法，是一种以柳枝稷幼穗为外植体进行无性繁殖的方法，其基于高的可操作性和重复性的植物组织培养技术为基础，再通过涉及植物器官发育调控的柳枝稷幼穗诱导穗芽培养，可以将正常条件下发育成花的花原基组织最终诱导成穗芽，以体外培养的方式最终诱导成穗芽(即由幼穗诱导形成的再生芽)，从而获得基因型完全一致的后代。本发明所提出的柳枝稷幼穗诱导穗芽的过程，将正常条件下发育成花的花原基组织最终诱导成穗芽，通过该方法这种植物器官逆向发育现象可能为植物器官发育研究提供一条新的思路。
[0022]本发明提供的利用柳枝稷幼穗进行无性繁殖的方法，以柳枝稷幼穗为材料，通过组织培养技术，最终可获得较大规模的穗芽，并取得良好的繁殖效果；与已有的柳枝稷无性繁殖方法相比，本发明拓宽了柳枝稷无性繁殖材料范围，为快速获得大量基因型一致后代提供了新的方法。
[0023]本发明提供的利用柳枝稷幼穗进行无性繁殖的方法，利用柳枝稷幼穗进行无性繁殖的方法诱导再生效率高，每个单独的幼穗一次培养可以诱导出穗芽30个左右，经继代培养可诱导100个以上。对于分蘖数目本身较多的柳枝稷来讲，单株增殖效率可以达到几千倍。
[0024]本方法提供的利用柳枝稷幼穗进行无性繁殖的方法所使用的外植体材料为柳枝稷幼穗，这在之前是未报道过的，拓宽了柳枝稷无性繁殖外植体材料的选择范围。
[0025]本方法提供的柳枝稷幼穗诱导穗芽方法与已有的柳枝稷组织培养途径获得再生芽方法相比，首次诱导所得基数更大，可以有效减少继代次数，从而使再生芽诱导成本进一步降低。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为柳枝稷幼穗诱导前的形态；
[0027]图2为由柳枝稷幼穗诱导的穗芽；
[0028]图3为栽植前的柳枝稷穗芽。
【具体实施方式】
[0029]下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
[0030]本发明提供的利用柳枝稷幼穗进行无性繁殖的方法，通过对柳枝稷幼穗进行体外诱导进行无性繁殖，繁殖效果良好，具有材料新颖，增殖效率高，成本低等特点。下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
[0031]参见图1~图3，一种利用柳枝稷幼穗进行无性繁殖的方法，包括以下操作:
[0032]I)选择适宜生长期的诱导外植体材料
[0033]a.柳枝稷生长发育至第4个节完全露出时取材为宜，此时幼穗已有2cm左右。
[0034]b.从靠近地面处将柳枝稷分蘖剪下，保证所需材料部位无损害。
[0035]c.从下向上剥去柳枝稷分蘖上的叶片，在靠近顶端幼穗时，节间越来越短，当发现节间长度小于Icm时停止，距该节间上端茎节上下各1.2~1.5cm切下，即为诱导外植体(内已含2cm左右长度的幼穗，具有正常花原基组织)。
[0036]2)外植体消毒
[0037]a.将外植体置于灭菌空培养皿中，加入体积分数为70%的酒精消毒Imin.
[0038]b.用体积分数为8%的次氯酸钠溶液(有效氯0.5% )消毒3min，期间轻轻摇动.
[0039]c.用灭菌水漂洗3次。
[0040]3)接种及诱导
[0041]a.用无菌镊子和手术刀将两端各切去0.5cm左右,然后将外植体纵向切为两半，切口向下接种到诱导培养基上。
[0042]b.诱导培养基成分为MS基础培养基(Murashige and Skoog Basal Medium,美国Sigma公司生产)4.43g/L添加3mmol/L的6-BA (6-苄基腺嘌呤)、7.5g/L的琼脂粉、30g/L的蔗糖。
[0043]c.接种后将培养皿置于恒温光照培养箱中，培养条件为温度25°C、每天光照20h、黑夜4h。30~40天后，穗芽逐渐形成。
[0044]4)继代扩大培养
[0045]a.将诱导出已生长至0.5~1.5cm的穗芽沿基部2~3mm切除。
[0046]b.将处理后的穗芽再次接种到诱导培养基上。
[0047]c.待新生芽生长至1.2~1.5cm，重复切除培养3~4次，获得大量的穗芽。
[0048]5)栽植
[0049]a.准备培养基质，以体积比计，具体成分为栽培土 2份，腐叶土 6份，河沙2份。
[0050]b.将穗芽块分离成单独的穗芽，直接扦插到预先准备好的培养基质中。7天左右每一个单独的穗芽均已生根，并将生长发育成一棵独立的幼苗。将幼苗连同培养基质栽植于温室或大田。
[0051]藉此，可以大规模培养获得具有相同基因型的柳枝稷幼苗。
[0052]实施例:
[0053]柳枝稷栽培品种Alamo利用幼穗无性繁殖的方法，包括以下操作:
[0054]I)选择适宜生长期的诱导外植体材料
[0055]a.在温室里选择第4个节完全露出的Alamo分蘖，从靠近地面处剪下。
[0056]b.从下向上剥去柳枝稷分蘖上的叶片，在靠近顶端幼穗时，节间越来越短，当发现节间长度小于Icm时停止，距该节间上端茎节上下各1.5cm切下，即为外植体(内已含2cm左右长度的幼穗，具有正常花原基组织)。
[0057]2)外植体消毒
[0058]a.将外植体置于灭菌空培养皿中，加入体积分数为70%的酒精消毒Imin.
[0059]b.用8%的次氯酸钠消毒3min，期间轻轻摇动.
[0060]c.用灭菌水漂洗3次。
[0061]3)接种及诱导
[0062]a.用无菌镊子和手术刀将两端各切去0.5cm左右，然后在中心位置将外植体纵向切为两半，切口向下接种到诱导培养基上。
[0063]b.诱导培养基成分为MS基础培养基(Murashige and Skoog Basal Medium,美国Sigma公司生产)4.43g/L添加3mmol/L的6_BA、7.5g/L的琼脂粉、30g/L的鹿糖。
[0064]c.接种后将培养皿置于恒温光照培养箱中，培养条件为温度25°C，每天光照20h、黑夜4h。30~40天后，穗芽逐渐形成。
[0065]4)继代扩大培养
[0066]a.将诱导出已生长至0.5~1.5cm的穗芽沿基部2~3mm切除。
[0067]b.将处理后的穗芽再次接种到诱导培养基上。
[0068]c.重复切除培养3~4次，获得大量的穗芽。
[0069]5)栽植
[0070]a.准备培养基质，具体成分为栽培土 2份，腐叶土 6份，河沙2份。
[0071]b.将穗芽块分离成单独的穗芽，直接扦插到预先准备好的培养基质中。7天左右每一个单独的穗芽均已生根，并将生长发育成一棵棵独立的幼苗。将每棵幼苗连同培养基质栽植于温室或大田。
【权利要求】
1.一种利用柳枝稷幼穗进行无性繁殖的方法，其特征在于，包括以下操作: 1)待柳枝稷生长发育至第4个节完全露出、幼穗已形成时，从靠近地面处将柳枝稷分蘖剪下，从下向上剥去柳枝稷分蘖上的叶片至节间长度小于Icm时停止，距该节间上端茎节上下各1.2~1.5cm切下，获得包含幼穗的外植体； 2)将外植体消毒并用无菌水漂洗； 3)无菌环境下，将外植体两端各切去0.2~0.5cm,将外植体纵向切为两半,切口向下接种到诱导培养基上；接种后置于恒温光照培养箱中，培养30~40天至穗芽形成； 所述的诱导培养基是以MS为基础培养基，并添加6-BA、琼脂粉和蔗糖； 4)将形成的穗芽沿基部2~3_处切除，并再次接种到诱导培养基上，待新生芽生长至1.2~1.5cm，重复继代培养3~4次，获得扩繁后的穗芽； 5)在不损害生长点的情况下，将穗芽从基部自芽块上拆分下来，将穗芽单独直接扦插到培养基质中，培养7天后，待单独的穗芽生根并发育成独立的幼苗，将幼苗连同培养基质栽植于温室或大田。
2.如权利要求1所述的利用柳枝稷幼穗进行无性繁殖的方法，其特征在于，所述的外植体中包含有2cm左右长度的幼穗，具有正常花原基组织。
3.如权利要求1所述的利用柳枝稷幼穗进行无性繁殖的方法，其特征在于，所述的外植体的消毒处理为:先 用体积分数为70%的酒精消毒I~2min，然后用体积分数5~8%的次氯酸钠溶液消毒2~3min ； 消毒完成后并用灭菌水漂洗3次。
4.如权利要求1所述的利用柳枝稷幼穗进行无性繁殖的方法，其特征在于，所述的诱导培养基的成分为:MS基础培养基4.43g/L，3mmol/L的6_BA、7.5g/L的琼脂粉和30g/L的蔗糖。
5.如权利要求1所述的利用柳枝稷幼穗进行无性繁殖的方法，其特征在于，所述在恒温光照培养箱进行培养时，其培养温度为20~25°C、每天光照20h、黑夜4h。
6.如权利要求1所述的利用柳枝稷幼穗进行无性繁殖的方法，其特征在于，在进行继代培养时，采用上次培养的新生芽进行接种，接种时新生芽的长度为1.0cm0
7.如权利要求1所述的利用柳枝稷幼穗进行无性繁殖的方法，其特征在于，以体积比计，所述的培养基质的组份为栽培土:腐叶土:河沙=I:3:1，栽植如一天在基质中加水，直到吸水饱和。
8.如权利要求1所述的利用柳枝稷幼穗进行无性繁殖的方法，其特征在于，所述的幼苗为相同基因型的幼苗。
【文档编号】A01H4/00GK104067934SQ201410249960
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年6月6日 优先权日:2014年6月6日
【发明者】奚亚军, 王勇锋, 李毛 申请人:西北农林科技大学