细柱五加的离体快速繁殖方法
【专利摘要】本发明提供一种细柱五加快速繁殖方法，进行规模化生产和繁殖以满足市场需要细柱五加组织培养步骤包括：A.外殖体消毒，B.无菌苗获得，C.腋芽生长培养，D.丛生芽诱导，E.生根培养，F?炼苗与移栽。采用植物组织培养的方法繁殖细柱五加，不仅不受外界条件的影响，四季皆可进行，节约苗木占地，降低生产成本，而且可以保存母体的全部优良性状，遗传性状稳定。这种方法可在短时间内形成大量的优良试管苗，进行规模化、工厂化生产，为观赏园艺、制药等产业提供大量的原材料。
【专利说明】【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明涉及细柱五加快速繁殖方法，属于植物的人工繁殖和栽培方法【技术领域】。 细柱五加的离体快速繁殖方法 【背景技术】
[0002] 五加始载于本草学著作《神农本草经》，称之为"五加皮"，列为上品。"气味辛，温。 主心腹疝气腹痛，益气疗甓，小儿不能行，疽疮阴蚀。"此后在《名医别录》、《东华真人煮石 经》等历代医药著作中均有五加的记载和描述。但是由于古代文献对五加原植物的描述不 甚详细，而且五加属植物形态较为相似，经前人考证，五加皮来源于五加科（Araliaceae) 五加属（Acanthopanax Miq.)植物。
[0003] 经中国药典确定细柱五加 （Acanthopanax gracilistylus W. W. Smith)的干燥根 皮是中国药典中"五加皮"的唯一正品来源。五加皮为一味名贵滋补强壮药，具祛风湿，补 肝肾，强筋骨的特异功效，目前国内外均未见大面积人工种植报道，市场供应主要以采集野 生资源为主，由于自然繁殖困难和采挖根皮的严重破坏，五加皮在国内中医药市场上已脱 销几十年之久，即使在细柱五加的主产地华东、华中等地药材市场，五加皮也严重供不应求 长期脱销。
[0004] 由于细柱五加种子萌发率低，在生产应用中都是通过扦插育苗进行繁殖的。但是， 长期的扦插繁殖是导致植物活力的减弱和带病毒的重要原因，并严重影响五加对逆境的抵 抗能力及质量，且制约了五加的育种进程。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种细柱五加快速繁殖方法，进行规模化生产以及以细柱 五加组培为基础的其他学科的研究工作的需要。
[0006] 本发明的技术方案如下，该种细柱五加快速繁殖方法的主要特点是：
[0007] A外殖体消毒：选取腋芽饱满且尚未萌发的嫩枝，摘去叶片，然后将枝条剪为约 2cm的小段，每段带一对腋芽，采用多方式消毒漂洗后，用无菌水冲洗4?6遍，最后用无菌 滤纸吸干表面水分；
[0008] B腋芽诱导：将消毒好的细柱五加茎段切成1. 0-1. 5cm的带芽节段，接种到以下培 养基中：WPM基本培养基，蔗糖20?40g/L，植物生长激素0. 2?2. Omg/L，适当pH值下进 行光照培养；
[〇〇〇9] C腋芽培养：将腋芽萌发后培养20天左右的无菌苗茎尖用剪刀剪下，接种到以下 培养基中：WPM基本培养基，蔗糖20?40g/L，植物生长激素0. 2?2. Omg/L，适当pH值下 进行光照培养；
[0010] D丛生芽诱导：将生长至8cm左右的芽苗切下，分成带有一对腋芽的小段：WPM基 本培养基，植物生长激素0. 5?1. Omg/L，进行光照培养30?40天；
[0011] E生根培养：选取健壮的试管苗，经过修剪后，在含植物生长激素400?500mg/L 浸泡10-15min后接种到如下培养基中：1/2WPM或WPM基本培养基，蔗糖20?40g/L，进行 光照培养50?60天。
[0012] F炼苗移栽：将组培瓶盖打开，并添加一定量蒸馏水进行有菌条件驯化一段时间； 用镊子将组培苗从瓶中取出，移栽到已经灭菌的栽培基质中，进行遮阴驯化3周，期间不定 期的喷施1/2WPM营养液。
[0013] 所述的细柱五加快速繁殖方法的延伸技术方案包括：步骤A中的多方式消毒漂洗 为：用0. 1 %的安利洗涤液在摇床上震荡洗涤15?20min，流水冲洗30?60min后，再在超 净工作台上用75%的酒精漂洗30s，无菌水清洗4遍后，用含0. 1 %升汞灭菌50?60min。
[0014] 所述的细柱五加快速繁殖方法的延伸技术方案包括：步骤B、C、D、E中细柱五 加快速繁殖所述的培养基中涉及的植物生长激素，包括6-卞基腺嘌呤出-BA)、吲哚丁酸 (IBA)、萘乙酸（NAA)、赤霉素（GA 3)、反玉米素（ZT)、3-吲哚乙酸（IAA)、多效唑其中一种或 几种。
[0015] 所述的细柱五加快速繁殖方法的延伸技术方案包括：步骤B、C、D、E中细柱五加快 速繁殖所述的培养条件为：光照周期10?16h/d，光照强度1000?3000LUX，培养温度22? 26。。。
[0016] 所述的细柱五加快速繁殖方法的延伸技术方案包括：步骤B、C中所涉及到的pH值 范围为5. 7?7. 0。
[0017] 所述的细柱五加快速繁殖方法的延伸技术方案包括：步骤F中添加蒸馏水5? l〇ml，进行有菌驯化2-3天。
[0018] 所述的细柱五加快速繁殖方法的延伸技术方案包括：步骤B、C中所涉及到的植物 生长激素包括吲哚丁酸（IBA) 1. 0?2. 0mg/L，6-卞基腺嘌呤（6-BA)0. 5?5. Omg/L，萘乙酸 (ΝΑΑ)0· 1 ?0· 2mg/L。
[0019] 所述的细柱五加快速繁殖方法的延伸技术方案包括：步骤D中所涉及到的植物生 长激素包括反玉米素（ΖΤ)0. 5?1. Omg/L，吲哚丁酸（IBA)O. 1?0. 5mg/L。
[0020] 所述的细柱五加快速繁殖方法的延伸技术方案包括：步骤E中所涉及到的植物生 长激素包括萘乙酸（ΝΑΑ)0· 1?0· 2mg/L，多效唑5. 0?10. Omg/L。
[0021] 采用植物组织培养的方法繁殖细柱五加，不仅可以摆脱外界条件的影响，四季都 能进行生产，而且可以节约育苗占地，降低生产成本。植物组织培养技术是利用细胞的全能 性，采取植物体上的细胞团块组织，通过人为条件的控制，使这些组织形成千百万植株，并 且保存了母体的全部优良性状，且遗传性状稳定。这种方法保留了细柱五加的植株活性，可 在短期内形成大量优良试管苗，缩短生长周期，适宜规模化、工厂化生产。
[0022] 以下便结合实施例并附图，对本发明的【具体实施方式】作进一步的详述。 【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1是取材用的细柱五加植株图；
[0024] 图2是诱导2-3周后萌发的腋芽图（培养条件：WPM+IBA2. 0mg/L+6-BA0. 5mg/ L+NAAO. 2mg/L+ 食用糖 30g/L，16h/d 光照培养）；
[0025] 图3是在最佳生长培养基中培养腋芽苗图（培养条件:WPM+IBA2. Omg/ L+6-BA0. 5mg/L+NAA0. 2mg/L+ 食用糖 30g/L，16h/d 光照培养）；
[0026] 图4是丛生芽诱导图（培养条件：WPM+ZTlmg/L+IBAO. 5mg/L+食用糖30g/L，16h/ d光照培养）；
[0027] 图5是组培苗在步骤E中处理后的生根情况图（培养条件：1/2WPM+NAA0. 2mg/L+ 多效唑10. 0mg/L+食用糖15g/L，16h/d光照培养）；
[0028] 图6是经炼苗驯化的移栽组培苗图。 【具体实施方式】
[0029] 下面结合细柱五加快速繁殖的实例说明本发明的【具体实施方式】。
[0030] 实施例1腋芽的诱导和培养
[0031] 1、取细柱五加的幼嫩茎段，用0. 1 %的安利洗涤液在摇床上震荡洗涤15?20min， 流水冲洗60min后，再在超净工作台上用75%的酒精漂洗30s，无菌水清洗4遍后，用含 0. 1% HgCl2消毒50?60min (在升萊中加入几滴吐温80)，无菌水冲洗4?6次，最后用无 菌滤纸吸干种子表面水分。
[0032] 2、将消毒好的细柱五加茎段直接接种到腋芽诱导培养基中：WPM基本培养基中添 力口，蔗糖（食用糖）30g/L，适当pH值；培养温度25°C，光照强度3000LUX，光照时间16h，进 行光照培养。
[0033] 3、将腋芽萌发后培养20天无菌苗茎尖用剪刀剪下，接种到本发明的腋芽生长 培养基中，具体配方为在WPM基本培养基中添加植物激素 IBA2. Omg/L、BAO. 5mg/L和 NAAO. 2mg/L，鹿糖30g/L，进行光照培养。
[0034] 实施例2丛生芽的诱导和试管苗的生根、移栽
[0035] 1、培养30天后，待芽苗生长至6_8cm，将芽苗重新接种到本发明的丛生芽诱导培 养基中，进行增殖培养。丛生芽诱导培养基是以WPM培养基为基本培养基，并添加植物生长 激素 ZTlmg/L和IBAO. 5mg/L，蔗糖（食用糖）30g/L，进行增殖培养。培养30天以上，诱导 率达到98%，大部分芽苗可诱导出丛生芽数达到3?5条。
[0036] 2、选取生长健壮的试管苗，将其浸泡在已经灭过菌的含NAAO. 2mg/L和多效唑 10. Omg/L的溶液中lOmin，然后接种到1/2WPM基本培养基上，蔗糖（食用糖）15g/L，进行生 根诱导。培养40天后，生根率达86 %，平均根数目达18. 5根。
[0037] 3、将细柱五加组培苗生根培养1. 5?2个月后开始进行炼苗移栽，首先将组培瓶 移入光照培养箱，进行变温变光驯化5?7天，再将组培瓶盖打开，并添加10ml蒸馏水，进 行有菌条件驯化2?3天。然后将组培苗移栽到已经灭菌的栽培基质（泥潭：珍珠岩： 园土=1 : 1 : 5)中，放置无加温加光的温室中，进行遮阴驯化3周，期间不定期的喷施 1/2硏^营养液，移栽后成活率达78%。
[0038] 实施例3腋芽的诱导和培养培养基的选择
[0039] 将消毒好的茎段接种于6种培养基上，每瓶接种1?2株，培养基组成见表1。每 隔l〇d继代并统计外植体生长情况。培养条件为温度25°C，光照强度3000LUX，光照时间 16h。
[0040] 表1腋芽的诱导和培养培养基组成
[0041]
【权利要求】
1. 细柱五加的离体快速繁殖方法，其特征在于： A外殖体消毒：选取腋芽饱满且尚未萌发的嫩枝，摘去叶片，然后将枝条剪为约2cm的 小段，每段带一对腋芽，采用多方式消毒漂洗后，用无菌水冲洗4?6遍，最后用无菌滤纸吸 干表面水分； B腋芽诱导：将消毒好的细柱五加茎段切成1. 0-1. 5cm的带芽节段，接种到以下培养基 中：WPM基本培养基，蔗糖20?40g/L，植物生长激素0. 2?2. Omg/L，适当pH值下进行光 照培养； C腋芽培养：将腋芽萌发后培养20天左右的无菌苗茎尖用剪刀剪下，接种到以下培养 基中：WPM基本培养基，蔗糖20?40g/L，植物生长激素0. 2?2. Omg/L，适当pH值下进行 光照培养； D丛生芽诱导：将生长至8cm左右的芽苗切下，分成带有一对腋芽的小段：WPM基本培 养基，植物生长激素0. 5?1. Omg/L，进行光照培养30?40天； E生根培养：选取健壮的试管苗，经过修剪后，在含植物生长激素400?500mg/L浸泡 10-15min后接种到如下培养基中：1/2WPM或WPM基本培养基，蔗糖20?40g/L，进行光照 培养50?60天。 F炼苗移栽：将组培瓶盖打开，并添加一定量蒸馏水进行有菌条件驯化一段时间；用镊 子将组培苗从瓶中取出，移栽到已经灭菌的栽培基质中，进行遮阴驯化3周，期间不定期的 喷施1/2WPM营养液。
2. 根据权利要求1所述细柱五加的快速繁殖方法，其特征在于步骤A中的多方式消毒 漂洗为：用〇. 1 %的安利洗涤液在摇床上震荡洗涤15?20min，流水冲洗30?60min后， 再在超净工作台上用75%的酒精漂洗30s，无菌水清洗4遍后，用含0. 1%升汞灭菌50? 60min〇
3. 根据权利要求1所述的细柱五加的快速繁殖方法，其特征在于步骤B、C、D、E中细柱 五加快速繁殖所述的培养基中涉及的植物生长激素，包括6-卞基腺嘌呤出-BA)、吲哚丁酸 (IBA)、萘乙酸（NAA)、赤霉素（GA 3)、反玉米素（ZT)、3-吲哚乙酸（IAA)、多效唑其中一种或 几种。
4. 如权利要求1所述细柱五加的快速繁殖方法，其特征在于步骤B、C、D、Ε中细柱五 加快速繁殖所述的培养条件为：光照周期10?16h/d，光照强度1000?3000Lu X，培养温度 22 ?26。。。
5. 根据权利要求1所述的细柱五加的快速繁殖方法，其特征在于步骤B、C中所涉及到 的pH值范围为5. 7?7.0。
6. 根据权利要求1所述的细柱五加的快速繁殖方法，其特征在于步骤F中添加蒸馏水 5?10ml，进行有菌驯化2-3天。
7. 根据权利要求3所述的细柱五加的快速繁殖方法，其特征在于步骤B、C中所涉及到 的植物生长激素包括吲哚丁酸（IBA) 1. 0?2. Omg/L，6-卞基腺嘌呤（6-BA) 0. 1?0. 5mg/L， 蔡乙酸（ΝΑΑ)0· 1 ?0· 2mg/L ;
8. 根据权利要求3所述的细柱五加的快速繁殖方法，其特征在于步骤D中所涉及到的 植物生长激素包括反玉米素（ΖΤ)0. 5?1. Omg/L，吲哚丁酸（IBA)O. 1?0. 5mg/L。
9. 根据权利要求3所述的细柱五加的快速繁殖方法，其特征在于步骤E中所涉及到的
【文档编号】A01H4/00GK104082147SQ201410341385
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月16日 优先权日:2014年7月16日
【发明者】郑生智, 韦敏, 吕晔 申请人:江苏省中国科学院植物研究所