一种提高南方生态型枣树苗木耐盐性的组织培养快繁方法
【专利摘要】本发明属于枣属植物的苗木无性繁殖【技术领域】，涉及一种提高南方生态型枣树苗木耐盐性的组织培养快繁方法。本发明所述的提高南方生态型枣树苗木耐盐性的组织培养快繁方法，包括：水培枣头枝；启动培养，获得无菌外植体；盐胁迫下初代和继代培养；盐胁迫下生根培养；炼育移栽。本发明解决了盐胁迫及盐胁迫下组培繁殖南方生态型枣树耐盐苗木的技术方法，显著提高了南方生态型枣苗的耐盐性和适应性，为枣南方生态型品种耐盐苗木的快速繁育和栽培推广打下了坚实基础。
【专利说明】一种提高南方生态型枣树苗木耐盐性的组织培养快繁方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于赛属（ZiziphusjujubaMill.)植物的苗木无性繁殖【技术领域】，具体 涉及一种提高南方生态型枣树苗木耐盐性的组织培养快繁方法。
【背景技术】
[0002] 枣原产中国，是中国重要的果树种类，目前的品种已达700种之多。自从利用微茎 段组织培养快繁"鸣山大枣"获得成功以来，迄今已有"金丝小枣"、"临泽小枣"、"灰枣"等 10多个枣品种建立起了组织培养快繁体系。组织培养枣苗可稳定遗传亲本的优良性状，育 苗周期短、效率高，还可结合脱除枣疯病病原菌等，因而，有力地促进了枣树优良品种的繁 殖和栽培。同时，组织培养作为植物生物技术的基础手段和载体，还可能是培育枣优良突变 体的一种有效途径。
[0003] 枣在中国有北方生态型和南方生态型两大类群，以北方生态型的品种最多， 南方生态型的品种明显较少，但却是江苏、浙江、湖南、广东、广西、贵州枣产区的主栽 品种。大量研宄和实践表明，枣北方生态型抗干旱、耐盐碱，加之育苗中普遍以酸枣 (Z.spinosa(Bunge)Hu)为站木，因此，赛苗抗逆性强、适应性广，而南方生态型则不然，赛品 种自身抗干旱、耐盐碱能力弱，也没有酸枣那样优良的砧木可资利用，繁育的枣苗主要为自 根苗（扦插苗或根蘖苗）。
[0004] 盐（包括通常所说的"碱"一一碱性盐）胁迫是中国枣产区的主要逆境之一，对枣 树的生长发育和枣果产量与品质有重大影响，无论北方和南方都存在，但在南方其对枣树 的胁迫与危害实际上更重，主要是因为南方生态型枣品种耐盐性明显较弱，而南方建立枣 园的立地类型往往是盐渍化重度发育的滨海滩涂、石灰岩山地或故河道形成的沙砾地。枣 树苗木是枣树科研和生产的物质基础，也是对盐胁迫最敏感的时期。因此，提高南方生态型 枣树苗木的耐盐性有重大现实意义和应用前景。
【发明内容】
[0005] 针对中国南方枣园建园的立地类型、生态特点与实际需要，本发明的目的在于提 供一种一种提高南方生态型枣树的苗木耐盐性的组织培养快繁方法，该方法能快捷、高效、 低成本地培育出具有显著耐盐性、适用性广、适应性强的南方生态型枣树苗木。
[0006] 本发明所述的提高南方生态型枣树品种苗木耐盐性的组织培养快繁方法，包括以 下步骤：
[0007] A.水培枣头枝：选择生长健壮、无病虫害的南方生态型枣树品种的植株，剪取休 眠期的1年生枣头枝，在温室中水培至新枝长度达15?20cm;
[0008] B.启动培养，获得无菌外植体：将步骤A培养获得的新生枣头枝，切割成带1?2 个腋芽的茎段，水浸15分钟，流水冲洗2小时，依次用70%酒精、0. 1 %HgCl2消毒5分钟后 用无菌水冲洗5次，接入启动培养基上培养60天；
[0009] C.盐胁迫下初代和继代培养：将步骤B获得的无菌外植体转接至同样成分的培养 基上进行初代培养，30天后转接至继代培养基上进行增殖扩繁，连续增殖扩繁3代，每代培 养30天，然后转接至生根培养基进行生根培养；
[0010]D.盐胁迫下生根培养：将步骤C获得的经盐胁迫诱导的第4代继代枣苗转接至生 根培养基上进行生根培养30?35天，当组培苗株高达6?7cm、生出10?12片叶、生根率 达95 %以上，具有2?3条长度为1?I. 5cm左右的白色根时，移入温室进行炼苗；
[0011]E.炼育移栽：将步骤D获得的生根组培苗转移到温室中，封闭瓶口炼育4?5天， 再打开瓶口炼苗8?10天，至叶色转为浓绿色时，取出组培苗，用30°C温水洗去枣苗根部附 带的培养基，移栽至温室苗圃地中；移栽后每株浇灌15ml1/2MS营养液，成活率在90%以 上；培育30天后，新根大量形成，移栽到大田苗圃中培育。
[0012] 根据本发明所述的提高南方生态型枣树品种苗木耐盐性的组织培养快繁方法 的进一步特征，所述步骤B中，所述启动培养基包括：MS培养基，I.Omg/L6-苄基腺嘌呤 (6-BA)，0?lmg/La-萘乙酸（NAA)。
[0013] 根据本发明所述的提高南方生态型枣树品种苗木耐盐性的组织培养快繁方法的 进一步特征，所述步骤C中，所述继代培养基包括：MS培养基，2.Omg/L6-BA，0. 5mg/LNAA， 75mmol/LNaCl0
[0014] 根据本发明所述的提高南方生态型枣树品种苗木耐盐性的组织培养快繁方法的 进一步特征，所述步骤D中，所述生根培养基包括：1/2MS培养基，0. 01mg/L6-BA，2.Omg/L 3-吲哚丁酸（IBA)，0.5mg/LIAA，75mmol/LNaCl。
[0015] 根据本发明所述的提高南方生态型枣树品种苗木耐盐性的组织培养快繁方法的 进一步特征，所述步骤E中，组培苗炼育的温室的昼温为26 ± 2°C，夜温为22 ± 2°C，光周期 为14小时/d，相对湿度为80±2%。
[0016] 根据本发明所述的提高南方生态型枣树品种苗木耐盐性的组织培养快繁方法的 进一步特征，所述步骤E中，移栽基质为疏松、透气、排水良好的輕石和草炭土等比例（V/V) 混合的基质，移栽前基质用〇. 1%甲醛进行消毒。
[0017] 本发明针对南方生态型枣树品种耐盐性弱、以普通方法繁育的枣树苗木对耐盐性 没有提升作用的实际和需要，进行了大量试验，寻求使枣树苗木在盐胁迫下经受诱导、锻 炼、驯化是提高其耐盐性的有效途径。枣树是木本植物，树体大，生育周期长，与采用普通枣 苗或在土培条件下诱导、锻炼、驯化相比，结合组织培养快繁技术的诱导、锻炼、驯化更为精 细、快捷、高效，尤其是对于提高南方生态型枣树苗木的耐盐性。本发明的研宄成果很好地 解决了盐胁迫及盐胁迫下组培繁殖南方生态型枣树耐盐苗木的技术方法，是枣树优良抗逆 苗木繁育中的重要集成与技术创新，显著提高了南方生态型枣苗的耐盐性和适应性，为枣 南方生态型品种耐盐苗木的快速繁育和栽培推广打下了坚实基础。
[0018] 本发明与现有技术相比，其有益效果是：提高南方生态型枣树苗木耐盐性的组织 培养快繁方法，集成了传统的枣树组织培养快繁育苗与人工逆境诱导、锻炼、驯化植物两种 方法各自的优势，是对枣树苗木培育理念、原理和技术方法的一项重要革新，弥补了中国南 方枣树栽培发展中没有优良耐盐枣树品种及砧木的欠缺，而且，繁育的南方生态型枣树苗 木耐盐性显著提高，繁殖系数大，工序简便，成本较低，没有突出的额外工作量，能保持亲本 原有的优良性状，省工省时，移栽及定植成活率高，苗木抗逆性强。
[0019] 本发明的创新之处主要有下列几点：
[0020] (1)首次证实结合组织培养快繁方法诱导、锻炼、驯化南方生态型枣树品种的耐盐 苗木切实可行；
[0021] (2)确定了组培快繁条件下诱导、锻炼、驯化南方生态型枣树品种耐盐苗木适宜的 盐胁迫浓度；
[0022] (3)确定了南方生态型枣树品种耐盐苗木快繁中各阶段培养基的优化配方；
[0023] (4)确定了南方生态型枣树品种耐盐苗木快繁中的3个关键阶段及培养时间；
[0024] (5)使用本发明组织培养快繁南方生态型枣树耐盐苗木，增殖系数达4. 5以上，生 根率和移栽成活率达99 %以上，可耐受的土壤含盐量达0. 438 %。
[0025] 因此，根据本发明所述方法可以培育出中国南方虽然没有耐盐枣树品种但照样有 适应盐土生态条件的枣树耐盐苗木，最大限度地实现了植物生物技术在枣树苗木高效耐盐 快繁中的集成与创新，为南方生态型枣树品种的栽培应用提供了可靠保障。
【具体实施方式】
[0026] 以下详述本发明的提高南方生态型枣树的苗木耐盐性的组织培养快繁方法。
[0027] 选择南方枣品种群的代表性品种"泗洪大枣"来进行实验，南方生态型的其他枣品 种也可参考本发明的方法。
[0028] (1)水培枣头枝：选择生长健壮、无病虫害的南方生态型枣品种的植株，剪取休眠 期的1年生赛头枝，除去无用枝条，在温室内水培至赛头枝新枝长度达15?20cm。
[0029] (2)启动培养，获得无菌外植体：将步骤（1)培养获得的水培枣头新枝，切割成带 1?2个腋芽的茎段，先用清水浸泡15分钟，随后在自来水龙头下流水冲洗2小时，然后 放在超净工作台上，在无菌条件下，用70%酒精消毒5分钟后用无菌水反复冲洗，用0. 1% HgCl2消毒5分钟后用无菌水冲洗5次，接入启动培养基上培养60天。启动（初代）培养 基的组成是：基本培养基（MS培养基）+1.Omg/L6-苄基腺嘌呤（6-BA)+0.lmg/La-萘乙酸 (NAA)〇
[0030] (3)盐胁迫下初代和继代培养：将步骤（2)获得的无菌外植体转接至同样成分的 培养基上进行初代培养，30天后转接至继代培养基上进行增殖扩繁，连续增殖扩繁3代后 (每代培养日数均为30天）转接至生根培养基进行生根培养。继代培养的组成是：MS培养 基+2.Omg/L6-BA+O. 5mg/LNAA+75mmol/LNaCl。
[0031] (4)盐胁迫下生根培养：将步骤（3)获得的经盐胁迫诱导的第3代继代枣苗转接 至生根培养基上进行生根培养，所用基本培养基为MS培养基，琼脂含量7.Og/L，蔗糖含量 30. 0g/L，pH6. 2 ?6. 5。生根培养的组成是：1/2MS培养基+0? 01mg/L6-BA+2.Omg/L3-吲 哚丁酸（IBA)+0. 5mg/LIAA+75mmol/LNaCl。当组培苗生出2?3条长度达I. 5cm左右的 白色根时，移入温室进行炼苗。
[0032] 组培室的昼温为26±2°C，夜温为22±2°C，光周期14h/d，相对湿度为80±2%。
[0033] 本发明采用了盐胁迫方法，即在完成启动培养后的步骤（3)和步骤（4)的各代培 养中，在制备培养基时加入NaCl进行耐盐性诱导、提高，NaCl浓度以最佳75mmol/L。培养 基配好后放置5天，选择没有被污染的供接种使用。
[0034] (5)炼育移栽：将步骤（4)获得的生根组培苗转移到温室中，打开瓶盖，经8?10 天时间、叶色转为浓绿色时，取出，用30°C温水洗去枣苗根部附带的培养基，移栽至温室苗 圃中。移栽基质选择疏松、透气、排水良好的蛭石和草炭土等比例（V/V)混合基质，移栽前 基质用0.1 %甲醛进行消毒，移栽后每株浇灌15ml1/2MS营养液。培育30天后，新根大量 形成，移栽到大田苗圃中培育。
[0035] 通过组织培养法提高枣树苗木耐盐性的实验数据
[0036] (1)盐胁迫对北方和南方生态型枣树品种微茎段组培中初代培养效果的影响：培 养基中加入不同浓度NaCl后，金丝小枣（北方生态型）和泗洪大枣（南方生态型）初代培 养中外植体成活率下降、苗高减小，但25mmol/LNaCl、75mmol/LNaCl胁迫对组培效果的影 响有显著差异。由表1可见，启动培养30天后转接到含NaCl的初代培养上，25mmol/LNaCl 胁迫下，2个枣品种外植体的成活率虽然都表现为下降，但均与对照无显著性差异，而对于 苗高，金丝小赛和泗洪大赛的均显著低于对照。75mmoI/LNaC1胁迫下，2个赛品种外植体初 代培养的成活率均显著低于对照；与对照相比，2个枣树品种的苗高均显著低于对照，泗洪 大赛甚至显著低于其在25mmol/LNaCl胁迫下的苗高，苗高降低幅度泗洪大赛为37. 3%、 金丝小枣为29. 6%。结果表明，两种生态型枣树品种在苗木阶段均对盐胁迫很敏感，但南方 生态型比北方生态型更敏感。
[0037] 表1:盐胁迫诱导对2种生态型枣树品种微茎段组培中第1代和第4代培养效果 的影响
[0038]
【权利要求】
1. 一种提高南方生态型枣树苗木耐盐性的组织培养快繁方法，其特征在于，所述方法 包括以下步骤： A. 水培枣头枝：选择生长健壮、无病虫害的南方生态型枣树品种的植株，剪取休眠期 的1年生枣头枝，在温室中水培至新枝长度达15?20cm ; B. 启动培养，获得无菌外植体：将步骤A培养获得的新生枣头枝，切割成带1?2个腋 芽的茎段，水浸15分钟，流水冲洗2小时，依次用70%酒精、0. 1%取(：12消毒5分钟后用无 菌水冲洗5次，接入启动培养基上培养60天； C. 盐胁迫下初代和继代培养：将步骤B获得的无菌外植体转接至同样成分的培养基上 进行初代培养，30天后转接至继代培养基上进行增殖扩繁，连续增殖扩繁3代，每代培养30 天，然后转接至生根培养基进行生根培养； D. 盐胁迫下生根培养：将步骤C获得的经盐胁迫诱导的第4代继代枣苗转接至生根培 养基上进行生根培养30?35天，当组培苗株高达6?7cm、生出10?12片叶、生根率达 95%以上，具有2?3条长度为1?1. 5cm左右的白色根时，移入温室进行炼苗； E. 炼育移栽：将步骤D获得的生根组培苗转移到温室中，封闭瓶口炼育4?5天，再打 开瓶口炼苗8?10天，至叶色转为浓绿色时，取出组培苗，用30°C温水洗去枣苗根部附带的 培养基，移栽至温室苗圃地中；移栽后每株浇灌15ml 1/2MS营养液，成活率在90%以上；培 育30天后，新根大量形成，移栽到大田苗圃中培育。
2. 根据权利要求1所述的提高南方生态型枣树品种苗木耐盐性的组织培养快繁方 法，其特征在于，所述步骤B中，所述启动培养基包括：MS培养基，1. 0mg/L6-苄基腺嘌呤 (6-BA)，0? lmg/L a -萘乙酸（NAA)。
3. 根据权利要求1所述的一种提高南方生态型枣树品种苗木耐盐性的组织培养快繁 方法，其特征在于，所述步骤C中，所述继代培养基包括：MS培养基，2. 0mg/L6-BA，0. 5mg/L NAA，75mmol/L NaCl〇
4. 根据权利要求1所述的一种提高南方生态型枣树品种苗木耐盐性的组织培养快 繁方法，其特征在于，所述步骤D中，所述生根培养基包括：1/2MS培养基，0. 01mg/L6-BA， 2.0mg/L3-吲哚丁酸（IBA)，0.5mg/L IAA，75mmol/L NaCl。
5. 根据权利要求1所述的一种提高南方生态型枣树苗木耐盐性的组织培养快繁方法， 其特征在于：所述步骤E中，组培苗炼育的温室的昼温为26±2°C，夜温为22±2°C，光周期 为14小时/d，相对湿度为80±2%。
6. 根据权利要求1所述的一种提高南方生态型枣树苗木耐盐性的组织培养快繁方法， 其特征在于：所述步骤E中，移栽基质为疏松、透气、排水良好的蛭石和草炭土等比例（V/V) 混合的基质，移栽前基质用〇. 1 %甲醛进行消毒。
【文档编号】A01H4/00GK104472366SQ201410828056
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月25日 优先权日:2014年12月25日
【发明者】徐呈祥, 马艳萍 申请人:肇庆学院