一种铁皮石斛组培苗的培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种铁皮石斛组培苗的培养方法，属于植物组织培养【技术领域】。本发明的步骤为：步骤一、种子的诱发及培养，选取铁皮石斛果荚作为外植体，将果荚内的种子散播在外植体诱导培养基上，诱导种子萌发形成胚芽；步骤二、胚芽增殖继代培养，将胚芽转接于增殖继代培养基上进行培养，将增殖继代培养基放在培养室中，培养得到铁皮石斛幼苗；步骤三、生根苗的培养，将铁皮石斛幼苗转入到生根培养基上，对其进行培养，培养得到铁皮石斛壮苗；步骤四、移栽，将生根培养后的铁皮石斛壮苗进行炼苗后移栽。本发明解决了传统的铁皮石斛的培养方法所带来的生根缓慢、成活率不高的问题，为大规模培育出优质铁皮石斛苗提供便利。
【专利说明】一种铁皮石斛组培苗的培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物组织培养【技术领域】，更具体地说，涉及一种铁皮石斛组培苗的培 养方法。
【背景技术】
[0002] 铁皮石斛为多年生草本，属附生兰类，俗名铁皮枫斗，因其老茎外呈黑色，又名为 黑节草，石斛是常用的名贵中药，应用历史悠久，在《神农本草经》中被列为上品，现已证实 它具有滋阴清热、生津益胃、止咳润肺、润喉明目、提高人体免疫功能、防治肿瘤和心血管疾 病以及改善睡眠、防治白内障、延年益寿等功效。但由于生长环境特殊和分布局限，以及长 期采挖，自然资源日趋枯竭，已被国家列为重点保护的野生药材并鼓励人工大面积栽培铁 皮石斛。
[0003] 植物组织培养作为一种有效的技术手段已被广泛应用于生产实践的各个领域。传 统的铁皮石斛的培育主要是通过扦插、分株的方式，但其繁殖率较低，生根缓慢，生长周期 长。为了满足市场的需求，国内外许多科研人员进行了铁皮石斛组织培养技术的研究，期望 能进行批量生产并提高种苗的繁殖系数及移栽成活率，这是目前亟待解决的问题。而要提 高种苗的移栽成活率，用于组织培养的培养基配方至关重要。
[0004] 通过专利检索，关于铁皮石斛组织培养技术的技术方案，已有相关技术方案公开。 如中国专利申请号201310173395. 0,申请日为：2013. 05. 13,发明创造名称为：一种铁皮石 斛组培苗方法，该申请案公开了一种铁皮石斛组培苗方法，包括如下操作步骤：制作铁皮石 斛组培苗的培养基，按下列质量配比装入容器中，然后烧开，经过灌装机将培养基灌入组培 瓶中，杀菌消毒，1000?1500克香蕉搅拌成糊状，白糖200?300克，硫酸亚铁90?105 毫升，硝酸铵25?33克，硝酸钾35?40克，硫酸镁5?8克，甘氨酸8?12毫升，维生素 B11?3晕升，B21?3各晕升，糖氨基酸20?30晕升，萘乙酸20?30晕升，自来水1000 毫升；用成熟铁皮石斛种子的花粉播种在上述培养基上，经过3个月后母苗长出。
[0005] 又如，中国专利申请号201210102034. 2,申请日为：2012. 03. 31，发明创造名称 为：一种铁皮石斛无激素组织培养的方法，该申请案公开了一种铁皮石斛无激素组织培养 的方法，该方法包括铁皮石斛种子萌发为圆球茎，圆球茎的生长，增殖分化，茎段的生根、壮 苗四个组织培养阶段，这四个阶段所用的培养基依次为：无激素的MS培养基、无激素的MS 基本培养基+ 土豆泥15?20g/L培养基、无激素的MS基本培养基+香蕉泥15?20g/L+ 土豆泥15?20g/L培养基和无激素的1/2MS基本培养基+香蕉泥15?20g/L+ 土豆泥 15?20g/L培养基。上述两个申请案中：中国专利申请号201310173395.0公开的技术方 案是用成熟铁皮石斛种子的花粉播种在上述培养基上，经过3个月后母苗长出，然后人工 接种分苗，这种培养方式在实际应用中无法保证成活率，推广应用难度大。中国专利申请号 201210102034. 2公开的技术方案主要是采用了无激素组织培养技术，但是其培养基的配方 不尽合理，需要进一步改进。
【发明内容】
[0006] 1.发明要解决的技术问题
[0007] 本发明的目的在于克服现有技术中铁皮石斛组培苗培养技术的不足，提供了一种 铁皮石斛组培苗的培养方法，采用本发明的技术方案，能够提高铁皮石斛组培苗的繁殖系 数及移栽成活率。
[0008] 2?技术方案
[0009] 为达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
[0010] 本发明的一种铁皮石斛组培苗的培养方法，其步骤为：
[0011] 步骤一、种子的诱发及培养
[0012] 选取铁皮石斛果荚作为外植体，用无菌刀切开铁皮石斛果荚，将果荚内的种子散 播在外植体诱导培养基上，诱导种子萌发，将外植体诱导培养基置于培养架上，培养温度为 23?25°C，光照时间为12小时/天，光照强度1500LX条件下培养30?45天，种子萌发形 成胚芽；
[0013] 步骤二、胚芽增殖继代培养
[0014] 将步骤一中形成的胚芽转接于增殖继代培养基上进行培养，将增殖继代培养基放 在培养室中，培养温度为23?25°C，光照时间为12小时/天，光照强度1800?2000LX条 件下培养80?90天，得到铁皮石斛幼苗；
[0015] 步骤三、生根苗的培养
[0016] 将步骤二中得到的铁皮石斛幼苗转入到生根培养基上，对其进行培养，培养温度 为25?26°C，光照时间为12小时/天，光照强度1800?2000LX条件下培养100?120 天，得到铁皮石斛壮苗；
[0017] 步骤四、移栽
[0018] 将步骤三进行生根培养后的铁皮石斛壮苗进行炼苗后移栽。
[0019] 更进一步地，步骤一中的外植体诱导培养基以MS培养基作为基本培养基，在基本 培养基中添加琼脂5?9g/L，白糖28?30g/L，活性炭0? 5?0? 6g/L，香蕉65?75g/L， 自制有机液肥1. 5?2g/L，灭菌剂1. 5?2. 5ml/L，外植体诱导培养基的pH为5. 4?5. 8， 对上述的外植体诱导培养基进行灭菌操作，其灭菌温度为120?126°C，灭菌时间为10? 40min〇
[0020] 更进一步地，步骤二中的增殖继代培养基以MS培养基作为基本培养基，在基本培 养基中添加琼脂5?9g/L，白糖30?32g/L，活性炭0? 48?0? 5g/L，香蕉45?50g/L，灭 菌剂1. 5?2. 5ml/L，增殖继代培养基的pH为5. 4?5. 8,对上述的增殖继代培养基进行灭 菌操作，其灭菌温度为120?126°C，灭菌时间为10?40min。
[0021] 更进一步地，步骤三中的生根培养基以自制母液作为基本培养基，在基本培养基 中添加琼脂5?9g/L，白糖20?22g/L，活性炭0? 5?0? 55g/L，香蕉50?55g/L，自制天 然有机液肥1. 5?1. 8g/L，灭菌剂1. 5?2. 5ml/L，生根培养基的pH为5. 4?5. 8,对上述 的生根培养基进行灭菌操作，其灭菌温度为120?126°C，灭菌时间为10?40min。
[0022] 更进一步地，所述的外植体诱导培养基和生根培养基中添加的自制天然有机液肥 配方相同，该自制天然有机液肥的配方具体如下：生麸3000g、乳酸菌500g、全脂奶粉500g、 水50000g、米糠3000g、酵母菌500g、磷肥500g、红糖6000g、海带3000g、五花肉500g、鱼骨 粉500g、鸡蛋6个。
[0023] 更进一步地，所述的生根培养基中的自制母液的配方具体为：硫酸铵0. 46g/L、氯 化钙〇? 17g/L、肌醇0? lg/L、硝酸钾2. 83g/L、硫酸亚铁0? 03g/L、1-萘乙酸2mg/L、磷酸二氢 钾 0. 4g/L、硫酸镁 0. 19g/L。
[0024] 3?有益效果
[0025] 采用本发明提供的技术方案，与现有技术相比，具有如下显著效果：
[0026] (1)本发明的一种铁皮石斛组培苗的培养方法，通过在铁皮石斛组织培养各阶段 采用特定的天然有机物用量和培养基对其进行培养，解决了传统的铁皮石斛的培养方法所 带来的生根缓慢、成活率不高的问题，所培育出的铁皮石斛组培苗较未添加天然有机物的 培养基培育出的苗株粗度、高度、叶片数均有增加且对根系有良好的促进作用，使铁皮石斛 的组培苗繁殖得到有效地提高，进而促进铁皮石斛的产业化生产。
[0027] (2)本发明的一种铁皮石斛组培苗的培养方法，其操作简便，生产周期短，种苗成 活率高，培养基配置方便，营养丰富，且培养条件简单，便于管理，为大规模培育出优质铁皮 石斛苗提供便利。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合实施例对本发明进行详细的描述，但它们不是对本发明的进一步限制。
[0029] 实施例1
[0030] 本实施例的一种铁皮石斛组培苗培养基，该培养基包括外植体诱导培养基、增殖 继代培养基和生根培养基，其中：所述的外植体诱导培养基用于散播铁皮石斛果荚内的种 子，诱导种子萌发形成胚芽；所述的胚芽增殖继代培养用于转接胚芽并进行培养，得到铁皮 石斛幼苗；所述的生根培养基用于转入铁皮石斛幼苗并进行培养，得到铁皮石斛壮苗。
[0031] 具体在本实施例中，外植体诱导培养基、增殖继代培养基和生根培养基具体如下： 外植体诱导培养基以MS培养基作为基本培养基，在基本培养基中添加琼脂5. 5g/L，白糖 3〇g/L，活性炭0. 5g/L，香蕉67g/L，自制有机液肥2g/L，灭菌剂2. 5ml/L。本实施例中外植 体诱导培养基的制备过程具体如下：（1)、根据MS培养基的成分及用量称取药品，使其充分 溶解，并按相应浓度依次取用。（2)、在MS培养基中按所需来加入各类物质，其分别为：琼 脂5. 5g/L，白糖30g/L，活性炭0. 5g/L，香蕉67g/L，自制有机液肥2g/L，灭菌剂2. 5ml/L，其 中：本实施例中的香蕉是指香蕉泥，该香蕉泥是将香蕉去皮，称重后放于料理机中加水打成 香蕉泥；在MS培养基中加入各类物质的具体过程为：蒸馏水加热烧开，取蒸馏水溶解白糖 后，加入琼脂并搅拌，待其完全熔化，将活性炭、香蕉泥、自制有机液肥、灭菌剂、基本培养基 一齐加入，用pH试纸测pH值，并用0. lmol/L的NaOH或HCI调节pH值为5. 8,最后加水定 容至所需体积。（3)、将配好的外植体诱导培养基灌装于培养瓶中，然后用瓶盖封口，放入高 压蒸汽灭菌锅中灭菌，其灭菌温度为120?126°C，灭菌时间为10?40min均可，将灭过菌 好的培养基置于冷凝室，观察无污染后即可用于接种。本实施例中的外植体诱导培养基中 没有添加植物生长调节剂，目的就是要改善细胞和组织增殖与分化的环境，本实施例中的 外植体诱导培养基采用天然的香蕉泥和特定的自制有机液肥能够促进细胞和组织的增殖 与分化，既安全又环保。作为本发明中关键的技术改进，本实施例中自制有机液肥中的微量 元素多样，能够更均衡的利于植物生长，为提高铁皮石斛组培苗的繁殖系数及移栽成活率 提供了保证。此外，白糖为细胞呼吸代谢提供底物和能量，它比葡萄糖价格便宜得多，节约 成本。
[0032] 本实施例中的增殖继代培养基以MS培养基作为基本培养基，在基本培养基中添 加琼脂6g/L，白糖30g/L，活性炭0. 5g/L，香蕉50g/L，灭菌剂2. 5ml/L。本实施例中增殖继代 培养基的制备过程具体如下：（1)、根据MS培养基的成分及用量称取药品，使其充分溶解， 并按相应浓度依次取用。（2)、在MS培养基中按所需来加入各类物质，其分别为：琼脂6g/ L，白糖30g/L，活性炭0. 5g/L，香蕉50g/L，灭菌剂2. 5ml/L，其中：本实施例中的香蕉是指香 蕉泥，该香蕉泥是将香蕉去皮，称重后放于料理机中加水打成香蕉泥；在MS培养基中加入 各类物质的具体过程为：蒸馏水加热烧开，取蒸馏水溶解白糖后，加入琼脂并搅拌，待其完 全熔化，将活性炭、香蕉泥、灭菌剂、基本培养基一齐加入，用pH试纸测pH值，并用0. lmol/ L的NaOH或HCI调节pH值为5. 8,最后加水定容至所需体积。（3)、将配好的增殖继代培 养基灌装于培养瓶中，然后用瓶盖封口，放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌，其灭菌温度为120? 126°C，灭菌时间为10?40min均可，将灭过菌好的培养基置于冷凝室，观察无污染后即可 用于接种。本实施例中的增殖继代培养基没有添加植物生长调节剂，而用天然的香蕉泥作 为营养成分，采用本实施例特定的增殖继代培养基，能够在没有植物生长调节剂的情况下 保证铁皮石斛组培苗的培养过程。此外，本实施例中增殖继代培养基添加活性炭用于吸附 培养过程中产生的部分有毒物质，且增加通气度，利于发根。
[0033] 本实施例中的生根培养基以自制母液作为基本培养基，在基本培养基中添加琼脂 6g/L，白糖20g/L，活性炭0? 5g/L，香蕉50g/L，自制天然有机液肥1. 5g/L，灭菌剂2. 5ml/ L。本实施例中生根培养基的制备过程具体如下：（1)、根据自制母液的成分及用量称取各组 分，使其充分溶解，并按相应浓度依次取用。（2)、在自制母液中按所需来加入各类物质，其 分别为：琼脂6g/L，白糖20g/L，活性炭0. 5g/L，香蕉50g/L，自制天然有机液肥1. 5g/L，灭 菌剂2. 5ml/L，其中：本实施例中的香蕉是指香蕉泥，该香蕉泥是将香蕉去皮，称重后放于 料理机中加水打成香蕉泥；在自制母液中加入各类物质的具体过程为：蒸馏水加热烧开， 取蒸馏水溶解白糖后，加入琼脂并搅拌，待其完全熔化，将活性炭、香蕉泥、自制天然有机液 月巴、灭菌剂、基本培养基一齐加入，用pH试纸测pH值，并用0. lmol/L的NaOH或HCI调节pH 值为5. 8,最后加水定容至所需体积。（3)、将配好的生根培养基灌装于培养瓶中，然后用瓶 盖封口，放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌，其灭菌温度为120?126°C，灭菌时间为10?40min 均可，将灭过菌好的培养基置于冷凝室，观察无污染后即可用于接种。本实施例中生根培养 基中添加的香蕉泥对根系有良好的促进作用，且通过其它特定的组分作为配合，利用本发 明特定的生根培养基配方能够显著促进根系生长，尤其是其中的自制天然有机液肥为后续 对成活率的保证起到了关键作用。此外，本实施例通过添加灭菌剂，降低了污染率。
[0034] 关于本实施例中自制天然有机液肥具体说明如下，外植体诱导培养基和生根培 养基中添加的自制天然有机液肥配方相同，该自制天然有机液肥的配方具体如下：生麸 3000g、乳酸菌500g、全脂奶粉500g、水50000g、米糠3000g、酵母菌500g、磷肥500g、红糖 6000g、海带3000g、五花肉500g、鱼骨粉500g、鸡蛋6个。本实施例中自制天然有机液肥的 制作过程为：(a)将海带晒干后打成粉；(b)按照上述配方将所有物料全部倒入肥桶混合搅 拌并密闭封存，其中：本实施例中的米糠为细米糠，生麸由豆饼和花生麸组成，且豆饼：花 生麸=1:1 (质量比），乳酸菌即为酸牛奶；（c)每日早晚各搅拌一次，具体可以是早上8:00 和晚上18:00各搅拌一次；(d)待50?60天后发酵腐熟，无臭味，即可使用。本实施例配置 的特定自制天然有机液肥由八十几种天然微量元素含钙、镁、硫、铜、铁、钥、锰、铝、硼、锌、 铅、钾、钠、磷、维生素B1、维生素C、叶绿素、胡萝卜素等组成。发明人经过十余年的研究发 现，采用这种自制天然有机液肥能够用于植物生长期使用，补充植物生长阶段所需的营养 元素，使其得到均衡的养分，更全面的促进生长，并提高植物抗病能力，以此改善组培苗的 质量，促进根系与叶片的生长，提高了移栽成活率，这是本发明能够实现的关键所在。
[0035]关于本实施例中自制母液具体说明如下，自制母液的配方具体为：硫酸铵0. 46g/ L、氯化钙0? 17g/L、肌醇0? lg/L、硝酸钾2. 83g/L、硫酸亚铁0? 03g/L、1-萘乙酸2mg/L、磷酸 二氢钾0. 4g/L、硫酸镁0. 19g/L。本实施例在生根培养基没有采用MS培养基作为基本培养 基，而采用自制母液作为基本培养基是本发明的关键所在。本实施例中的自制母液中添加 的1-萘乙酸可以用于诱导不定根的生长，且植物在不同的生长发育阶段对无机盐的需求 不同，故按此比例自制母液能够满足不同的生长发育阶段对无机盐的需求。本实施例采用 自制母液提高了铁皮石斛组培苗的品质及种苗移栽成活率，从而解决铁皮石斛产业化生产 中的关键技术难点。
[0036] 采用本实施例的铁皮石斛组培苗培养基进行培养，铁皮石斛组培苗的培养方法具 体步骤为：
[0037]步骤一、种子的诱发及培养：选取颗粒饱满、无病虫害的铁皮石斛果荚作为外植 体，在超净工作台上对其进行初步修剪，用75%乙醇溶液冲洗3遍，再用95%乙醇溶液冲洗 1遍，滤干水分。用无菌刀切开铁皮石斛果荚，将果荚内的种子散播在外植体诱导培养基上， 诱导种子萌发，将外植体诱导培养基置于培养架上，培养温度为23?25°C均可，光照时间 为12小时/天，光照强度1500LX条件下培养30?45天，种子萌发形成胚芽；
[0038]步骤二、胚芽增殖继代培养：将步骤一中形成的胚芽转接于增殖继代培养基上进 行培养，将增殖继代培养基放在培养室中，培养温度为23?25°C均可，光照时间为12小时 /天，光照强度1800?2000LX条件下培养80?90天，得到铁皮石斛幼苗；
[0039]步骤三、生根苗的培养：将步骤二中得到的铁皮石斛幼苗转入到生根培养基上，对 其进行培养，培养温度为25?26°C均可，光照时间为12小时/天，光照强度1800?2000Lx 条件下培养1〇〇?120天，得到铁皮石斛壮苗；
[0040] 步骤四、移栽：将步骤三进行生根培养后的铁皮石斛壮苗进行炼苗后移栽。
[0041] 本实施例培养的铁皮石斛组培苗具体情况见表1，由此可以证明本实施例通过向 铁皮石斛组培苗的培养基中添加天然有机物，以此改善组培苗的质量，促进根系与叶片的 生长，提高了铁皮石斛组培苗的品质及种苗移栽成活率，从而解决铁皮石斛产业化生产中 的关键技术难点。
[0042] 表1实施例1-3的铁皮石斛组培苗具体情况
[0043]
【权利要求】
1. 一种铁皮石斛组培苗的培养方法，其特征在于，其步骤为： 步骤一、种子的诱发及培养 选取铁皮石斛果荚作为外植体，用无菌刀切开铁皮石斛果荚，将果荚内的种子散播 在外植体诱导培养基上，诱导种子萌发，将外植体诱导培养基置于培养架上，培养温度为 23?25°C，光照时间为12小时/天，光照强度1500LX条件下培养30?45天，种子萌发形 成胚芽； 步骤二、胚芽增殖继代培养 将步骤一中形成的胚芽转接于增殖继代培养基上进行培养，将增殖继代培养基放在培 养室中，培养温度为23?25°C，光照时间为12小时/天，光照强度1800?2000Lx条件下 培养80?90天，得到铁皮石斛幼苗； 步骤三、生根苗的培养 将步骤二中得到的铁皮石斛幼苗转入到生根培养基上，对其进行培养，培养温度为 25?26°C，光照时间为12小时/天，光照强度1800?2000Lx条件下培养100?120天， 得到铁皮石斛壮苗； 步骤四、移栽 将步骤三进行生根培养后的铁皮石斛壮苗进行炼苗后移栽。
2. 根据权利要求1所述的一种铁皮石斛组培苗的培养方法，其特征在于，步骤一中的 外植体诱导培养基以MS培养基作为基本培养基，在基本培养基中添加琼脂5?9g/L，白糖 28?30g/L，活性炭0? 5?0? 6g/L，香蕉65?75g/L，自制有机液肥1. 5?2g/L，灭菌剂 1. 5?2. 5ml/L，外植体诱导培养基的pH为5. 4?5. 8,对上述的外植体诱导培养基进行灭 菌操作，其灭菌温度为120?126°C，灭菌时间为10?40min。
3. 根据权利要求1所述的一种铁皮石斛组培苗的培养方法，其特征在于，步骤二中的 增殖继代培养基以MS培养基作为基本培养基，在基本培养基中添加琼脂5?9g/L，白糖 30?32g/L，活性炭0? 48?0? 5g/L，香蕉45?50g/L，灭菌剂1. 5?2. 5ml/L，增殖继代培养 基的pH为5. 4?5. 8,对上述的增殖继代培养基进行灭菌操作，其灭菌温度为120?126°C， 灭菌时间为10?40min。
4. 根据权利要求2所述的一种铁皮石斛组培苗的培养方法，其特征在于，步骤三中的 生根培养基以自制母液作为基本培养基，在基本培养基中添加琼脂5?9g/L，白糖20? 22g/L，活性炭0? 5?0? 55g/L，香蕉50?55g/L，自制天然有机液肥1. 5?1. 8g/L，灭菌剂 1. 5?2. 5ml/L，生根培养基的pH为5. 4?5. 8,对上述的生根培养基进行灭菌操作，其灭菌 温度为120?126°C，灭菌时间为10?40min。
5. 根据权利要求4所述的一种铁皮石斛组培苗的培养方法，其特征在于，所述的外植 体诱导培养基和生根培养基中添加的自制天然有机液肥配方相同，该自制天然有机液肥 的配方具体如下：生麸3000g、乳酸菌500g、全脂奶粉500g、水50000g、米糠3000g、酵母菌 500g、磷肥500g、红糖6000g、海带3000g、五花肉500g、鱼骨粉500g、鸡蛋6个。
6. 根据权利要求4或5所述的一种铁皮石斛组培苗的培养方法，其特征在于，所述的生 根培养基中的自制母液的配方具体为：硫酸铵〇.46g/L、氯化钙0. 17g/L、肌醇0. lg/L、硝酸 钾2. 83g/L、硫酸亚铁0? 03g/L、1-萘乙酸2mg/L、磷酸二氢钾0? 4g/L、硫酸镁0? 19g/L。
【文档编号】A01H4/00GK104429973SQ201410828043
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月25日 优先权日:2014年12月25日
【发明者】郑毓华, 于太和, 周道阳 申请人:安徽同创现代农业投资发展有限公司