一种草鱼和罗非鱼生态混养方法与流程

本发明属于水产养殖领域，具体涉及一种草鱼和罗非鱼生态混养方法。

背景技术：

长泰地区是整个漳州地区养殖黑罗非最为集中也是产量较大的区域之一，黑罗非养殖面积1万余亩，年产黑罗非1.2万吨，最近大量暴发的罗非鱼“链球菌病”是急需解决的问题。

罗非鱼“链球菌”病自2009年暴发以来一直未有有效的方法控制，近两年更是导致罗非鱼药残超标，出口受阻，国内滞销，鱼价低靡，给整个罗非鱼产业带来了致命性的打击。今年罗非鱼链球菌病与往年相比流行性更加广泛，耐药性明显增强，土塘养殖黑罗非80％以上养殖户大幅度限量，投喂量仅为体重的0.1-0.5％之间，稍有加量就会引起大幅度死亡。因此，急需一种健康的生态养殖综合防控方法，既能控制链球菌的发生，也能保证罗非鱼的食用安全。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供一种草鱼和罗非鱼生态混养方法。

本发明提供的草鱼和罗非鱼生态混养方法包括如下步骤：

1)养殖池选择：选择深2m以上，面积为2-3亩的池塘，用隔网隔开1/4-1/3的面积，在高温季节，水温超过30℃以上时，严禁鸭粪、猪粪水进塘；

2)种植水草：在隔网隔开的池内种植大薸，控制大薸密度为60-80棵/平米；控制池塘无水草部分溶解氧在3mg/L以上，一天当中的最 高温度控制在水草处温度在32℃以下；

3)在高温季节每半月用一次水产微生态制剂。

其中，所述的水产微生态制剂由沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonas palustris CGMCC No.9136发酵而成。

本发明的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)的分离鉴定过程如下：

1.配制光合细菌培养基

富集培养基(/L)：NaHCO₃2g，酵母粉1g，K₂HPO₄·3H₂O 0.2g，NH₄Cl 1g，NaAc·3H₂O 0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NaCl 0.2g，Na₂S₂O₃·5H₂O 1g，pH7.0，121℃高压灭菌20min。

分离培养基在富集培养基基础上添加琼脂，最终质量分为1.5％，121℃高压灭菌20min。

2.富集：

将采集来的泥水样品放于已加有富集培养基的带螺口的厌氧管中，其中厌氧管盛有15mL培养基及10mL池塘水+底泥，每个覆盖2-3cm石蜡油。光照强度1000lx～2000lx，30℃厌氧培养。

3.分离纯化

富集一周后，从培养基变红的厌氧管中取出1mL液体，取稀释度为10^-3、10^-4，10^-5的液体100μL涂板，10天左右观察到有红色菌落长出；挑出红色菌落平板画线至纯。

4.鉴定

挑取单菌落进行16S rRNA菌落PCR，送Invitrogen测序，序列如SEQ ID No.1所示。测得序列在NCBI上进行Blast比对，初步鉴定为沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonas palustris，与沼泽红假单胞菌R.palustrisATCC 17003的16S rRNA基因相似性距离为100％。该菌生长缓慢，5天可出现单菌落，大小0.5mm～1mm；厌氧状态下为暗红色菌落，革兰氏染色为阴性短杆状，固体平板培养为短杆状(图1)。

将分离到沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonas palustris于2014年5月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC No.9136。

本发明的一个实施方案中，池塘养殖密度为草鱼每亩300-500尾，罗非鱼每亩1500-2000尾。

在本发明的一个实施方案中，按如下方法控制大薸的密度：将碳铵和过碳酸钙按重量比5：1的比例进行混合，水草处局部泼洒，直接将粉剂撒在水草上，每亩5-10kg。

其中，所述隔网用空塑料瓶塞入网袋制得。

本发明确定了草鱼、罗非鱼不喜摄食的水草“大薸”，选出了控制杀灭水草的药物，结合使用降亚硝酸盐的微生态制剂，在水草覆盖池塘1/4时，可降低水中温度2-3℃，对水中氨氮、亚硝酸盐具有很好的调节作用，能显著提高鱼的免疫力，有效防止链球病的发生，降低了药物应用带来的食用风险。

附图说明

图1两种条件下光合细菌对亚硝酸盐的降解效果。左边为无光条件下CGMCC No.9136对亚硝酸盐的降解，右边为光照条件下CGMCC No.9136对亚硝酸盐的降解。

图2所示为试验塘和对照塘温度随时间的变化。

图3所示为试验塘和对照塘溶解氧随时间的变化。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

通过实地调查发现当地浮性水草主要有水葫芦、浮萍、大薸等。经过调查发现水葫芦草鱼较爱吃，数量少了很难大量繁殖，数量大了 繁殖很快，并且一般药物都不能将其杀死，又很难控制，很容易引起鱼的缺氧而大量死亡。浮萍草鱼罗非鱼都非常爱吃少量很难繁殖，即使放足够量大量繁殖起来由于其个体较小连片后密度较大，引起耗氧非常严重。经过实地试验发现大薸草鱼不喜摄食只需在塘中隔出一片区域，往该区域中投放少量“大薸”即可，并且在试验中发现了一种“药物”对大薸非常敏感，且对鱼无毒害作用。

在水草种植过程中研究发现了将碳铵和过碳酸钙按重量比5：1的比例进行混合，水草处局部泼洒，直接将粉剂撒在水草上，每亩5kg。大薸对该合剂非常敏感，该合剂对鱼和水体无伤害，非常适合控制大薸的数量和密度。

实施例2水草拦网制备

现有技术使用单层拦网直接将池塘隔开，但实际操作中发现单层网隔开时在水位变化及大风天气容易发生水草的游窜。综合考虑成本和实用性，选择用矿泉水瓶和网袋制作成隔网，既可以随着水位上下移动又可以节约成本。

实施例3沼泽红假单胞菌微生态制剂制备

1.沼泽红假单胞菌扩大培养基的配方(/L)：

CaCl₂0.1g，KH₂PO₄0.5g，NH₄Cl 1g，MgCl₂·6H₂O 0.5g，NaCl 1g，NaAc·3H₂O 1g，二水合丁二酸钠1g，酵母粉0.3g，蛋白胨0.3g

2.扩大培养基培养步骤

(1)按照培养基配方称取各个组分，用水溶解，将培养基分装至5L已用酒精消毒的PET塑料桶中，每桶4.5L，接种沼泽红假单胞菌CGMCC No.9136500mL，封盖。置于纸箱中白炽灯光照培养4天，可以作为下一步大规模培养的种子液。

(3)称量1吨培养液所需要的各个成分，先用少量自来水完全溶解，再与剩下的自来水充分混合于大桶中，接种10桶光合细菌种子液，混匀后分装于5L透明PET塑料桶中封盖。光照培养5天，待 培养至红棕色，即得到高纯度的沼泽红假单胞菌微生态制剂。

2.沼泽红假单胞菌CGMCC No.9136对亚硝酸盐的降解能力测试

(1)做亚硝酸盐标准曲线：配制不同浓度的亚硝酸盐溶液，置于酶标仪下测量OD₅₅₀，做成盐浓度与OD₅₅₀的对应性标准曲线。

(2)降亚硝实验用的培养基：配制3°盐水分装于150mL小三角瓶中，50mL/瓶，每瓶加入0.05g池塘底泥。121℃，高压蒸汽灭菌20min。

(3)设置黑暗条件和光照条件，每个条件下设置实验组和对照组，每株菌3个重复，实验组加入光合细菌种子液50μL，分别放置于黑暗和光照条件下，30℃放置培养。

(4)每24小时测量一次亚硝酸盐含量，具体方法为：在超净工作台内取1mL液体于1.5mL的离心管中，12,000rpm离心2分钟，吸取上清200μL于96孔板中，先后加入格利斯试剂Ⅰ、Ⅱ各20μL，静置5min使其完全反应，然后置于酶标仪下测量OD₅₅₀。

(5)根据标准曲线计算实验组和对照组的亚硝酸盐浓度，测量2天，记录实验数据并分析。

2.实验结果

如图1所示，黑暗和光照条件下所述泽红假单胞菌CGMCC No.9136菌剂均有较明显的亚硝酸盐降解效果。无光照条件下，亚硝含量从2.5mg/L降解到最低0.05mg/L；在光照条件下，亚硝酸钠从2.3mg/L降解到0.005mg/L的水平。

实施例4

试验塘水体面积3亩，平均水深2.5米，主养罗非鱼套养草鱼，共计放罗非鱼7000尾，草鱼400尾，用拦网隔开水面1/4左右，在该1/4水面上种植大薸。大薸密度在70棵/平方米。在夏季高温季节每半月用一次实施例3制备的水产微生态制剂。对照塘水体面积5亩， 平均水深2.5米，主养罗非鱼套样草鱼，放养密度同试验塘相当。两塘每天投喂量为1.5％，其他条件相当。每天测定试塘水草处温度与溶氧(水下30cm处测量)以及试验塘无水草处溶解氧、温度、氨氮、亚硝酸盐等水中理化指标，试验塘具体测定结果祥见表1，对照塘试验结果详见表2。由表1和表2可以看出在气温达到34℃以上时，水面下30cm处水温即可超过32℃，死亡量明显增加，而种植水草的池塘，水草处水温一般都会比对照塘低2-3℃且晴天时水中氨氮、亚硝酸盐等指标下降非常迅速。

表1试验塘测测定结果

(注：试验溶氧为试验塘水草处溶氧；试验温度为水草处温度；溶解氧为试验塘无水草处温度；温度为试验塘无水草处温度)

表2对照塘测定结果

结果分析

1、试验塘温度与对照塘温度变化关系

试验塘和对照塘温度随时间的变化如图2所示。可以看出有水草覆盖的池塘在8月19日到8月24日及在9月5日到9月10日温度明显低于对照塘2-3℃，在8月25-9月26日温度相当(主要是因为此段时间多为阴雨天气)。由此可证明，在池塘中种植1/4面积的水草在晴天高温季节可有效降低池塘水温2-3℃，进而可缓解高温季节罗非鱼高热病的发生。

2、试验塘溶解氧与对照塘溶解氧之间的变化关系

试验塘和对照塘溶解氧随时间的变化如图3所示。结果表明，试验塘溶解氧(无水草部分)与对照塘溶解氧相差不大，幅度范围在0.2-1mg/L之间，且溶解氧都在3mg/L以上，证明当水草覆盖面积在1/4时对水体中的溶解氧影响不大。

3、试验塘氨氮、亚硝酸盐、pH与对照塘的对比变化结果

试验塘水中的氨氮、亚硝酸盐、在配合使用自主研发的微生态制剂后与对照组相比明显下降，说明在塘中种植水草配合使用微生态制剂对水中氨氮、亚硝酸盐具有很好的调节作用，能显著提高鱼的免疫力，有效防止链球病的发生。

经过为期近一个月的试验，本研究确定了草鱼、罗非鱼不喜摄食的水草“大薸”，选出了控制杀灭水草的药物(粉剂碳铵+过碳酸钙)，得出了水草在覆盖池塘1/4时可降低水中温度2-3℃，溶氧降低0.5-1mg/L，死亡量可明显降低。在费用方面，总计每个养户的实验费用不超过2500元，如果推广此养殖模式，养护可自备废品矿泉水瓶等，综合核算水草控制药物，网袋等费用，每5亩塘不超过300元，具备大规模推广的可能性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。