一种绵羊颗粒冻精的制作‑保存一体化装置及其应用方法与流程

本发明涉及一种绵羊颗粒冻精的一体化装置及其应用方法。

背景技术：

精液的冷冻保存在现代畜牧业中起着十分重要作用。冻精的使用可最大限度提高优良种畜的利用率，同时在品种改良，濒危动物保护上也具有极其重要意义。

从世界范围看，绵羊精子冷冻技术研究进展缓慢，主要在冷冻程序、稀释液配方、和授精方法几方面存在技术问题，导致绵羊冻精的产业化应用无法推广。由于绵羊精液冷冻具有潜在的巨大商业价值和重要的现实意义，因此，冻精制作工艺的改进创新具有研究的重要性和必要性，目前仍是动物繁殖领域内研究热点和难点。

冻精的制作主要有两种方法：颗粒冻精和细管冻精。虽然细管冻精是目前产业应用的主流方法，技术也相对成熟，但绵羊冻精生产远远落后于高度市场化、产业化的牛冻精；绵羊冻精产业化程度低，这主要由市场、技术等因素所决定，市面上并不能或很难购买到商品化绵羊细管冻精。目前，绵羊冷配仍多以自行冷冻的颗粒或细管冻精，以颗粒冻精为主。与细管冻精的制作相比较，颗粒冻精方法具有操作简单、冷冻时间短、成本低廉等优点。但仍存在以下缺陷：1、无标准的颗粒冻精制作与储存装置，基本都是就地取材；冻精储存不科学，容易造成颗粒表面脱落。2、冷冻和保存需要单独操作，无法对颗粒一对一信息标记；3、冻精颗粒大小、形状不规范，颗粒间冻精活力差异大，重复性差。

技术实现要素：

本发明目的是为了解决现有制作绵羊颗粒冻精存在储存不科学、信息标记困难、颗粒不规则和易破损的问题，而提供一种绵羊颗粒冻精的制作-保存一体化装置及其应用方法。

本发明一种绵羊颗粒冻精的制作-保存一体化装置，它由冷冻氟板、冷冻支架、冷冻托架和保存提漏四部分组成；

所述冷冻氟板：边长5cm、厚度0.1cm的正方形，冷冻氟板的四角分别设置直径0.2cm的穿孔，穿孔的中心距离边距1cm，冷冻氟板的中央平均分布16个直径为0.25cm的半球型冷冻槽；冷冻氟板厚度为0.1cm，底部设置高度0.1cm的底座；半球型冷冻槽与冷冻氟板边间、半球型冷冻槽之间覆盖单面胶纸；

冷冻支架：支架铁芯高20cm，四根支架铁芯分别从冷冻氟板的穿孔穿过；支架铁芯最高点记为第0cm，在第18cm处焊接固定装置；

冷冻托架：托架高8cm，边长4cm，四根托架的顶端分别设置支架插槽，底端设置微型脚托；

冷冻提漏：提漏高20cm，边长6cm，底部密封；提漏提手总长度50cm，提漏提手的底部10cm的长度用于焊接在提漏外侧面中间位置，其余40cm长度高出提漏，并在提漏提手的顶端设置挂钩。

上述绵羊颗粒冻精的制作-保存一体化装置的应用方法，按以下步骤进行：

一、利用假阴道方法收集绵羊精液，然后用预热至40℃的冷冻稀释液进行2倍的稀释；

二、冷冻：将步骤一稀释后的绵羊精液样品裹8-10层纱布并置于4℃冰箱中平衡2h；平衡过程中，在泡沫盒中注入6cm高度的液氮，把冷冻托架放置于泡沫盒子中央，然后把支架铁芯插入支架插槽；

在第一块冷冻氟板的单面胶纸上标记待冷冻精液信息，用镊子夹着第一块冷冻氟板穿过支架铁芯固定于18cm处的固定装置，此位置距离液氮面4cm，预冷3-5min后，用250μL移液器在每个半球型冷冻槽中滴入0.1mL平衡后的精液；

在第二块冷冻氟板的单面胶纸上标记待冷冻精液信息，置于第一块冷冻氟板上；预冷3-5min后，用250μL移液器在每个半球型冷冻槽中滴入0.1mL平衡后的精液，重复操作至放入第5块氟板后，添加液氮，重新校对液氮面与待滴定冷冻氟板高度至4cm，重复滴入精液叠加冷冻氟板的步骤至距离支架铁芯顶端1cm处结束，液氮熏蒸5min，然后用大镊子把带有冷冻氟板的冷冻支架从冷冻托架中提出，放入装满液氮的冷冻提漏中，提漏挂置于装满液氮的罐口；

三、解冻：在液氮中提出冷冻提漏，上提冷冻支架，然后用镊子捏取冻精颗粒，在空气中停留20s，平行的浸入40℃解冻液中10s，摇动至融化，完成解冻；

其中步骤一中冷冻稀释液由94mL基础稀释液和6mL甘油组成；基础稀释液按体积比80:20由基础液和卵黄组成，所述基础液由3.2g葡萄糖、3.2g柠檬酸钠、10IU青霉素和10IU链霉素溶于100mL超纯水制成；

步骤三中解冻液按体积比80:20由基础液和卵黄组成，所述基础液由3.2g葡萄糖、3.2g柠檬酸钠、10IU青霉素和10IU链霉素溶于100mL超纯水制成。

本发明与传统冻精颗粒冷冻装置和方法相比，优点如下：

1、本发明集冷冻与保存一体化，冻精制作步骤简化、规范，精液信息详细。颗粒冻精制作的传统方法通常是在铝饭盒盖子上滴定精液，普遍存在剂型规格不标准的缺陷，需要重新收集后存放于纱布袋，再放入液氮，无法标记。本发明在精子冷冻完成后，无需重新收集，直接放入液氮，并且在冷冻氟板标记精液详细信息。冻精颗粒大小、形态规则。

2、颗粒冻精制作的传统方法，在冷冻后将颗粒收集在纱布袋中，由于储存和运输过程中，颗粒间碰撞和摩擦，表面脱落严重，剥落的细微颗粒和碎片，悬浮在液氮中，极易造成品种混杂的现象。本发明完全克服这一缺点，颗粒间无直接接触。

3、本发明冻精颗粒容量大，装置所采用材料均为普通金属，成本低廉。按上述冷冻装置规格，冷冻精液体积：144mL＝16(孔/氟板)×0.1(mL精液/孔)×90(片氟板/18cm)，每套冷冻支架可冷冻精液公羊只数：72只＝144mL÷2(冷冻前稀释2倍)÷1mL(平均射精量1mL/只)。

4、本发明显著降低冷冻保护剂毒性影响。目前，无论是细管冻精还是颗粒冻精，均采用6％-8％的甘油作为冷冻保护剂冷冻。本发明在冷冻前，采用0.1mL 6％甘油浓度的冷冻液稀释，解冻时采用0.2mL无甘油解冻液再次稀释，甘油终浓度为1.5％，有效降低了甘油的毒性危害。

5、由于市面液氮罐口径大小不一，本装置型号可根据液氮罐口径灵活定制；另外，本发明结构简单，操作方便，基层技术人员可迅速完全掌握，无需专门培训。

6、社会效益及经济效益：

本发明主要应用于绵羊精液的超低温冷冻保存。随着养羊产业的快速发展，绵羊冻精在迅速扩群、杂交改良上的应用越来越重要，因此本发明具有广阔的市场前景。目前国内外尚无与此相同的装置。

目前全国从事绵羊生产的公司和机构，普遍存在扩繁速度缓慢，品种改良困难的问题，绵羊冻精无法推广应用是关键原因。近年来，绵羊精液冷冻方面的研究也没有得到足够的重视，通过改进冷冻方案和冷冻装置提高冻精品质势在必行。因此本发明具有可观的经济效益、良好的社会效益和潜在的应用价值。

本发明对改善绵羊冻精品质、推动冻精产业化应用具有重要意义，可显著提高优良公畜的利用率、减少饲养量，尤其是在中小规模羊场、养殖散户以及放牧模式下具有更大利用空间，具有广阔的市场应用前景。

附图说明

图1是本发明中绵羊颗粒冻精的制作-保存一体化装置中冷冻氟板的示意图，其中1表示穿孔，2表示半球型冷冻槽，3表示底座，4表示单面胶纸；

图2是本发明中绵羊颗粒冻精的制作-保存一体化装置中冷冻氟板、冷冻支架与冷冻托架的示意图，其中5表示支架铁芯，6表示托架，7表示支架插槽，8表示微型脚托；

图3是本发明中绵羊颗粒冻精的制作-保存一体化装置中冷冻提漏的示意图，其中9表示提漏，10表示提漏提手，11表示挂钩。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：结合图1、2和3所示，本实施方式一种绵羊颗粒冻精的制作-保存一体化装置，它由冷冻氟板、冷冻支架、冷冻托架和保存提漏四部分组成；

所述冷冻氟板：边长5cm、厚度0.1cm的正方形，冷冻氟板的四角分别设置直径0.2cm的穿孔1，穿孔1的中心距离边距1cm，冷冻氟板的中央平均分布16个直径为0.25cm的半球型冷冻槽2；冷冻氟板厚度为0.1cm，底部设置高度0.1cm的底座3；半球型冷冻槽2与冷冻氟板边间、半球型冷冻槽2之间覆盖单面胶纸4；

冷冻支架：支架铁芯5高20cm，四根支架铁芯5分别从冷冻氟板的穿孔1穿过；支架铁芯5最高点记为第0cm，在第18cm处焊接固定装置；

冷冻托架：托架6高8cm，边长4cm，四根托架6的顶端分别设置支架插槽7，底端设置微型脚托8；

冷冻提漏：提漏9高20cm，边长6cm，底部密封；提漏提手10总长度50cm，提漏提手10的底部10cm的长度用于焊接在提漏9外侧面中间位置，其余40cm长度高出提漏9，并在提漏提手10的顶端设置挂钩11。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是，所述半球型冷冻槽2用于滴定待冷冻的精液。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是，所述冷冻氟板的底座3用于是防止冷冻过程中相邻的两块冷冻氟板大面积接触而产生粘连。其它与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是，所述单面胶纸4用于记录精液信息。其它与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是，所述挂钩11用于固定在液氮罐口。其它与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是，所述固定装置用于固定安装冷冻氟板，冷冻氟板可依次叠加安装。其它与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是，所述支架插槽7用于支架铁芯5的插拔。其它与具体实施方式一至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式绵羊颗粒冻精的制作-保存一体化装置的应用方法，按以下步骤进行：

一、利用假阴道方法收集绵羊精液，然后用预热至40℃的冷冻稀释液进行2倍的稀释；

二、冷冻：将步骤一稀释后的绵羊精液样品裹8-10层纱布并置于4℃冰箱中平衡2h；平衡过程中，在泡沫盒中注入6cm高度的液氮，把冷冻托架放置于泡沫盒子中央，然后把支架铁芯5插入支架插槽7；

在第一块冷冻氟板的单面胶纸4上标记待冷冻精液信息，用镊子夹着第一块冷冻氟板穿过支架铁芯5固定于18cm处的固定装置，此位置距离液氮面4cm，预冷3-5min后，用250μL移液器在每个半球型冷冻槽2中滴入0.1mL平衡后的精液；

在第二块冷冻氟板的单面胶纸4上标记待冷冻精液信息，置于第一块冷冻氟板上；预冷3-5min后，用250μL移液器在每个半球型冷冻槽2中滴入0.1mL平衡后的精液，重复操作至放入第5块氟板后，添加液氮，重新校对液氮面与待滴定冷冻氟板高度至4cm，重复滴入精液叠加冷冻氟板的步骤至距离支架铁芯5顶端1cm处结束，液氮熏蒸5min，然后用大镊子把带有冷冻氟板的冷冻支架从冷冻托架中提出，放入装满液氮的冷冻提漏中，提漏挂置于装满液氮的罐口；

三、解冻：在液氮中提出冷冻提漏，上提冷冻支架，然后用镊子捏取冻精颗粒，在空气中停留20s，平行的浸入40℃解冻液中10s，摇动至融化，完成解冻；

其中步骤一中冷冻稀释液由94mL基础稀释液和6mL甘油组成；基础稀释液按体积比80:20由基础液和卵黄组成，所述基础液由3.2g葡萄糖、3.2g柠檬酸钠、10IU青霉素和10IU链霉素溶于100mL超纯水制成；

步骤三中解冻液按体积比80:20由基础液和卵黄组成，所述基础液由3.2g葡萄糖、3.2g柠檬酸钠、10IU青霉素和10IU链霉素溶于100mL超纯水制成。

本实施方式步骤二中预冷3-5min后冷冻氟板的温度达到-120℃—-130℃。

本实施方式中上提冷冻支架必须保证冷冻提漏中装满液氮。

本实施方式中平行的浸入是指冻精颗粒的上、下表面与解冻液面平行。

本实施方式中解冻完成后将冷冻氟板从冷冻支架取出，去除单面胶纸，清洗消毒，备于下次使用。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式八不同的是，步骤二中每一块使用的冷冻氟板的单面胶纸4上均要标记待冷冻精液信息；标记待冷冻精液信息为公羊品种、公羊耳标号和冷冻日期。其它步骤及参数与具体实施方式八相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式八或九不同的是，步骤三解冻液中精子的终浓度为原精稀释6倍。其它步骤及参数与具体实施方式八或九相同。

采用以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例：

结合图1、2和3所示，本实施方式一种绵羊颗粒冻精的制作-保存一体化装置，它由冷冻氟板、冷冻支架、冷冻托架和保存提漏四部分组成；

所述冷冻氟板：边长5cm、厚度0.1cm的正方形，冷冻氟板的四角分别设置直径0.2cm的穿孔1，穿孔1的中心距离边距1cm，冷冻氟板的中央平均分布16个直径为0.25cm的半球型冷冻槽2；冷冻氟板厚度为0.1cm，底部设置高度0.1cm的底座3；半球型冷冻槽2与冷冻氟板边间、半球型冷冻槽2之间覆盖单面胶纸4；

冷冻支架：支架铁芯5高20cm，四根支架铁芯5分别从冷冻氟板的穿孔1穿过；支架铁芯5最高点记为第0cm，在第18cm处焊接固定装置；

冷冻托架：托架6高8cm，边长4cm，四根托架6的顶端分别设置支架插槽7，底端设置微型脚托8；

冷冻提漏：提漏9高20cm，边长6cm，底部密封；提漏提手10总长度50cm，提漏提手10的底部10cm的长度用于焊接在提漏9外侧面中间位置，其余40cm长度高出提漏9，并在提漏提手10的顶端设置挂钩11。

绵羊颗粒冻精的制作-保存一体化装置的应用方法，按以下步骤进行：

一、利用假阴道方法收集绵羊精液，然后用预热至40℃的冷冻稀释液进行2倍的稀释；

二、冷冻：将步骤一稀释后的绵羊精液样品裹8层纱布并置于4℃冰箱中平衡2h；平衡过程中，在泡沫盒中注入6cm高度的液氮，把冷冻托架放置于泡沫盒子中央，然后把支架铁芯5插入支架插槽7；

在第一块冷冻氟板的单面胶纸4上标记待冷冻精液信息，用镊子夹着第一块冷冻氟板穿过支架铁芯5固定于18cm处的固定装置，此位置距离液氮面4cm，预冷3min后，用250μL移液器在每个半球型冷冻槽2中滴入0.1mL平衡后的精液；

在第二块冷冻氟板的单面胶纸4上标记待冷冻精液信息，置于第一块冷冻氟板上；预冷3-5min后，用250μL移液器在每个半球型冷冻槽2中滴入0.1mL平衡后的精液，重复操作至放入第5块氟板后，添加液氮，重新校对液氮面与待滴定冷冻氟板高度至4cm，重复滴入精液叠加冷冻氟板的步骤至距离支架铁芯5顶端1cm处结束，液氮熏蒸5min，然后用大镊子把带有冷冻氟板的冷冻支架从冷冻托架中提出，放入装满液氮的冷冻提漏中，提漏挂置于装满液氮的罐口；

三、解冻：在液氮中提出冷冻提漏，上提冷冻支架，然后用镊子捏取冻精颗粒，在空气中停留20s，平行的浸入40℃解冻液中10s，摇动至融化，完成解冻；

其中步骤一中冷冻稀释液由94mL基础稀释液和6mL甘油组成；基础稀释液按体积比80:20由基础液和卵黄组成，所述基础液由3.2g葡萄糖、3.2g柠檬酸钠、10IU青霉素和10IU链霉素溶于100mL超纯水制成；

步骤三中解冻液按体积比80:20由基础液和卵黄组成，所述基础液由3.2g葡萄糖、3.2g柠檬酸钠、10IU青霉素和10IU链霉素溶于100mL超纯水制成。

本实施例步骤二中预冷3min后冷冻氟板的温度达到-120℃。

本实施例中上提冷冻支架必须保证冷冻提漏中装满液氮。

本实施例中平行的浸入是指冻精颗粒的上、下表面与解冻液面平行。

本实施例中解冻完成后将冷冻氟板从冷冻支架取出，去除单面胶纸，清洗消毒，备于下次使用。

本实施例中集冷冻与保存一体化，冻精制作步骤简化、规范，精液信息详细。冻精颗粒大小、形态规则。颗粒间无直接接触，不会造成品种混杂的现象。