本发明涉及一种烟草茄尼醇突变体的制备、筛选方法及应用，特别是涉及一种利用化学诱变剂EMS制备烟草茄尼醇突变体及该突变体在烟草品种改良和功能成分利用中的应用。
背景技术：
茄尼醇是一种重要的医药中间体，是泛醌类药物中间体不可替代的成分，是合成维生素K的侧链和辅酶Q10以及合成抗溃疡药物、抗癌药物、治疗心脑血管病药物、抗艾滋病病毒药物、降血压药物的原料。由于茄尼醇特殊的分子结构，是倍受关注的药物中间体，在制药工业上需求量大。茄尼醇合成难度较大，而只在烟草、桑叶、马铃薯等少数植物中含量较高。桑叶中茄尼醇约为桑叶干重的0.1％左右，含量太小。马铃薯叶中的茄尼醇含量为1.5％左右，但种植面积不够广泛，大量的马铃薯叶不易获得，提取茄尼醇受到原料的限制。烟叶是生产茄尼醇的最主要来源，烟叶中茄尼醇的含量高达叶片干重的3％。Rao等研究发现烤烟废次烟叶中茄尼醇含量为0.5％～2.7％。目前大多数生产工艺采用烟叶废弃物作为原料提取茄尼醇。因此，进一步提高烟草中茄尼醇含量，将烟草作为生物反应器，用于提取茄尼醇具有广阔的应用前景。同时，Schlotzhauer等报道茄尼醇对香烟烟气中的多环芳烃物质(PAH)贡献高达30％。烟草加热到500℃，茄尼醇热裂解产生多环芳香烃物质，尤其苯并[a]芘被认为是主要的致癌物质。降低烟草茄尼醇的含量，有利于减少香烟对人体健康的危害。
自然突变的烟草种质资源有限，利用创制的烟草突变体筛选高茄尼醇或低茄尼醇含量的烟草材料是非常有效的方法。甲基磺酸乙酯(ethyl methyl sulfonate，EMS)是一类应用最广、效率最高的化学诱变剂，主要诱发点突变，可以在基因组上产生多个突变位点，只需要很小的突变群体便可以获得饱和的突变体库，产生可稳定遗传的丰富表型变异。烟草种子小，数量多，非常适合进行突变体库的构建。同时，烟草是重要的模式植物，突变体库的建立有助于我们认识烟草基因的功能。烟草茄尼醇突变体的筛选和深入研究，有助于深入认识茄尼醇合成代谢途径的分子机理。通过创制烟草突变体库，筛选茄尼醇合成代谢突变体，高茄尼醇突变体材料可以作为生物反应器提取茄尼醇作为药物生产原料；低茄尼醇突变体材料可以用于培育低害烟草品种。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供了一种制备茄尼醇含量提高或降低的烟草突变体的方法，本方法简单且突变率高，所得突变体茄尼醇含量与烟气中部分有害物质含量成正相关。本发明通过以下的技术方案来实现：
一种化学诱变剂甲基磺酸乙酯(sthyl methyl sulfonate，EMS)在诱导制备烟草茄尼醇突变体中的应用。
一种制备烟草茄尼醇突变体的方法，包括以下步骤：
(1)化学诱变剂甲基磺酸乙酯(sthyl methyl sulfonate，EMS)溶液的配置及EMS诱变的烟草M1代种子的获得；
(2)M1代种子的播种，自交后M2代种子的获得；
(3)M2代种子的播种，利用液相色谱测定M2代单株成熟期中部烟叶中的总茄尼醇含量，鉴定筛选茄尼醇突变体植株。
进一步的，所述EMS溶液的配置为使用pH 6.5的0.01mol/L磷酸缓冲液(Na2HPO4·12H2O-NaH2PO4·H2O)配置质量体积比为0.6％的EMS溶液。
进一步的，所述EMS诱变的烟草M1代种子的获得为使用所述配置好的EMS溶液，在室温下浸泡烟草种子，震荡处理16小时后，取出，使用0.01mol/L磷酸缓冲液润洗处理后的种子3次，并使用蒸馏水冲洗，至EMS溶液冲洗干净，获得EMS诱变的烟草M1代种子。
进一步的，所述M1代种子的播种，M2代种子的获得为M1代种子播种两个月后移栽大田，单株成熟后套袋自交收获M2代种子。
进一步的，所述筛选出的突变体茄尼醇含量与烟气中有害物质含量成正相关。具体为通过步骤(3)筛选出的突变体植株获得M3代种子，对M3代株系测定突变体烟气有害成分，分析茄尼醇含量与其相关性，鉴定低危害烟草材料。
进一步的，所述烟气中有害含量包括苯并芘、氨、苯酚。
进一步的，使用本发明所述方法制备和筛选的突变体烟草植株在烟草成分改善中的应用及在制备特殊功能香烟及低危害香烟中的应用。为茄尼醇的合成机理给出了启示。
有益效果：
化学诱变剂EMS在烟草茄尼醇含量相关突变体中具有良好的应用，使用其制备烟草茄尼醇含量相关突变体，方法简单，诱变效果显著，可获得茄尼醇含量显著降低或提高的烟草植株，所获得的突变植株茄尼醇的含量与烟气中有害成分如苯并芘、氨、苯酚含量呈现极显著正相关，使用所述方法制备和筛选的突变体在烟草成分改善中的应用及在制备特殊功能香烟及低危害香烟中的应用。为茄尼醇的合成机理给出了启示。
附图说明
图1本发明经EMS化学诱变获得的烟草中总茄尼醇含量分布
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案进行详细的说明，但是本发明的范围不受这些实施例的限制。
实施例1
(1)用pH 6.5的0.01mol/L磷酸缓冲液(Na2HPO4·12H2O-NaH2PO4·H2O)配置质量体积比为0.6％的EMS溶液。用配好的EMS在室温下浸泡烟草品种“中烟100”的种子，在摇床内震荡(110rpm/min)处理16小时。用磷酸缓冲液润洗处理后的种子3次，用大量蒸馏水连续冲洗，获得EMS诱变的烟草M1代种子。
(2)M1代种子播种两个月后移栽大田，单株成熟后套袋自交收获M2代种子；M2代种子播种两个月后移栽大田，在叶片成熟期对500个株系各挑选1株取中部叶片3片，并收获该株M3代种子。
(3)M2代中部鲜烟叶烘烤后磨成烟草粉末，利用液相色谱测定烟叶中的总茄尼醇含量。
(4)依据500份烟草突变体总茄尼醇含量的测定结果，选取代表性的25份种植M3代；利用液相色谱测定株系的茄尼醇含量和利用近红外光谱法根据模型预测烟气有害成分苯并芘、氨、苯酚的含量，分析茄尼醇含量与烟气有害物质的相关性。
结果显示，诱变处理中烟100的种子，获得500份M2代烟草突变体。与对照的总茄尼醇含量1.8％相比，多份EMS诱变突变体中的茄尼醇含量显著降低或提高，说明EMS化学诱变是获得高茄尼醇或低茄尼醇突变体材料的有效方法(图1)。
检测25份代表性茄尼醇突变体M3株系的烟气有害物质含量，发现茄尼醇含量与烟气有害成分苯并芘、氨、苯酚含量呈现极显著正相关(表1)。
表1为25份烟草EMS突变体株系茄尼醇含量与烟气有害成分含量的相关
性分析
需要指出的是，以上的实施例只是对本发明的解释，并非是对发明的限定，在不违背本发明的精神的情况下，本发明可以作任何形式的修改，例如简单的浓度更换或者反应体系的变化都应在本发明技术方案保护范围之内。