本发明涉及农药技术领域，特别涉及一种成绿肉座菌颗粒剂及其制备方法。
背景技术：
中国是一个农业大国，随着中国人口的不断急剧增长，对农作物的需求也越来越大，但是农作物在种植的过程中往往由于病虫害的发生，导致产量和质量明显降低。种植者为了保证农作物能够顺利上市，满足人民的需要，长期大量使用化学农药来防治病虫害的发生，以保证农作物的产量和质量。但是长期使用化学农药，不但使种植的成本大大增加，而且化学农药的残留不仅危害农作物的品质和人类健康，还会造成病菌对化学药物具有耐受性，同时也会造成对农业生态环境的污染，不利于绿色环保。
植物土传病害是造成我国粮食、蔬菜、经济作物减产的重要病害之一，对农作物的危害很大，严重影响了农作物的生长，同时也给种植者造成了经济损失。目前对根腐病、立枯病等植物土传病害的防治往往采用的是化学农药。但是化学农药的使用不但增加了种植成本，而且会有农药的残留，同样也会使得根腐病、立枯病等植物土传病害对化学农药具有耐受性。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种成绿肉座菌颗粒剂及其制备方法。
本发明具体的技术方案如下：
本发明提供了一种成绿肉座菌颗粒剂，包括以下重量份数的组分：
药物活性组分5～15份，所述的药物活性组分为成绿肉座菌；
辅助剂10～25份；
药物载体50～90份；
水15～25份。
进一步，所述成绿肉座菌选自生物保藏编号为CGMCC No.7995的菌种。
进一步，所述的成绿肉座菌颗粒剂的含孢量为5-50亿孢子/克。
进一步，所述的成绿肉座菌颗粒剂的杂菌率≤0.1％。
进一步，所述的成绿肉座菌颗粒剂的粒度为400μm～2200μm。
进一步，所述的成绿肉座菌的脱落率≤3％。
进一步，所述辅助剂包括葡萄糖和/或玉米淀粉。
进一步，所述药物载体包括硅藻土、滑石粉、白炭黑、硫酸钠、陶土和高岭土中的一种或几种。
进一步，所述成绿肉座菌颗粒剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将药物载体、药物活性组分和辅助剂混合、粉碎，得到粉料；
2)将所述步骤1)得到的粉料与水混合、造粒，得到成绿肉座菌颗粒剂。
进一步，所述的成绿肉座菌颗粒剂在防治植物土传病害方面的应用。
本发明的成绿肉座菌颗粒剂高效、低毒，杀菌效果稳定，能有效防治植物土传病害。且对人畜和作物安全，安全性高。实验结果表明，成绿肉座菌对植物土传病害防效高于75％。
生物保藏说明
成绿肉座菌(Hypocrea virens)，于2013年8月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，生物保藏编号为CGMCC No.7995。
具体实施方式
本发明提供了一种成绿肉座菌颗粒剂，包括以下重量份数的组分：药物活性组分5～15份，所述的药物活性组分为成绿肉座菌；辅助剂10～25份；药物载体50～90份；水15～25份。
本发明提供的成绿肉座菌颗粒剂优选包括5～15份的成绿肉座菌，更优选为8～12份，最优选为10份。
在本发明中，所述成绿肉座菌优选为选自生物保藏编号为CGMCC No.7995的菌种活化培养得到。
在本发明中，所述成绿肉座菌的制备方法优选包括以下步骤：
1)将成绿肉座菌菌种活化；
2)将所述活化后的成绿肉座菌接种于成绿肉座菌一级液体培养基中进行一级液体培养，培养35～50h停止培养，得到成绿肉座菌一级培养液；
3)将所述步骤2)得到的成绿肉座菌一级培养液接种于成绿肉座菌二级液体培养基中进行二级液体培养，培养50～75h停止培养，得到成绿肉座菌二级培养液；
4)将所述步骤3)得到的二级培养液接种于成绿肉座菌固体培养基中，进行固体发酵培养，得到成绿肉座菌。
在本发明中，所述成绿肉座菌菌种的活化优选为将保藏的成绿肉座菌菌种接种于装有营养琼脂培养基的茄型瓶中，20～35℃培养30～65h进行活化培养。
所述活化培养后，本发明将所述活化后的成绿肉座菌接种于成绿肉座菌液体培养基中进行一级液体培养。在本发明中，所述一级培养液的接种量优选为10～30％，更优选为15～25％，最优选为20％。
在本发明中，所述成绿肉座菌二级培养液的接种量优选为10～30％，更优选为15～25％，最优选为20％。
在本发明中，所述成绿肉座菌固体发酵培养的接种量优选为10～30％，更优选为15～25％，最优选为20％。
在本发明中，所述成绿肉座菌一级液体培养基优选包括下列质量百分含量的组分：葡萄糖0.5％～2.0％、白砂糖0.5％～2.0％、黄豆粉0.1％～0.3％、硫酸铵0.1％～0.3％、磷酸氢二钾0.05％～0.1％、氯化钾0.05％～0.1％、硫酸镁0.01％～0.04％、硫酸铁0.00％～0.004％，余量为水；更优选为葡萄糖0.8％～1.5％、白砂糖0.8％～1.5％、黄豆粉0.15％～0.25％、硫酸铵0.15％～0.25％、磷酸氢二钾0.06％～0.09％、氯化钾0.06％～0.09％、硫酸镁0.015％～0.03％、硫酸铁0.001％～0.003％，余量为水；最优选为葡萄糖1％、白砂糖1％、黄豆粉0.2％、硫酸铵0.2％、磷酸氢二钾0.08％、氯化钾0.08％、硫酸镁0.02％、硫酸铁0.002％，余量为水。本发明对上述药品的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的用于制备培养基的药品即可。
在本发明中，所述成绿肉座菌液体培养基优选经120～130℃灭菌30～45min后使用。在本发明中，所述灭菌温度更优选为125℃；所述灭菌时间更优选为40min。本发明对培养基的灭菌设备没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的灭菌设备即可，如高压蒸汽灭菌锅。
本发明对所述发酵的设备没有特殊的限定，采用本技术领域熟知的发酵设备即可，如发酵罐。
在本发明中，所述成绿肉座菌一级液体培养的温度优选为20～32℃，更优选的为25～30℃，最优选为28℃；所述成绿肉座菌一级液体培养的初始pH值优选为5.5～6.5，更优选的为5.8～6.2，最优选为6.0；
本发明在所述一级液体培养过程中持续通入无菌空气，优选为接种后进入24h内，通气量为5～25m3/h，培养24h后，通气量为20～30m3/h；更优选为接种后进入24h内，通气量为10～20m3/h，培养24h后，通气量为22～28m3/h；最优选为接种后进入24h内，通气量为15m3/h，培养24h后，通气量为25m3/h。本发明对所述通入无菌空气的设备没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的通气设备即可，如空压机。
在本发明中，所述成绿肉座菌一级液体培养的时间优选为35～50h，更优选为40～48h，更优选为45h。
得到成绿肉座菌一级液体培养液后，本发明将得到的成绿肉座菌一级液体培养液接种于成绿肉座菌二级液体培养基中，进行二级液体培养，得到成绿肉座菌二级液体培养液。在本发明中，所述二级液体培养的接种量优选为10～30％，更优选为15～25％，最优选为20％。
在本发明中，所述成绿肉座菌二级液体培养基优选包括以下组分：葡萄糖1％～3％、白砂糖1％～3％、马铃薯粉0.5％～1.5％、黄豆粉0.5％～1.5％、玉米粉0.3％～1.0％、磷酸氢二钾0.01％～0.02％，余量为水；更优选为葡萄糖1.5％～2.5％、白砂糖1.5％～2.5％、马铃薯粉0.8％～1.2％、黄豆粉0.8％～1.2％、玉米粉0.4％～0.7％、磷酸氢二钾0.012％～0.018％，余量为水；最优选为葡萄糖2％、白砂糖2％、马铃薯粉1％、黄豆粉1％、玉米粉0.5％、磷酸氢二钾0.015％，余量为水。本发明对上述药品的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的用于制备培养基的药品即可。
在本发明中，所述成绿肉座菌二级液体培养基优选经120～130℃灭菌30～45min后使用。在本发明中，所述灭菌温度更优选为125℃；所述灭菌时间更优选为40min。本发明对培养基的灭菌设备没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的灭菌设备即可，如高压蒸汽灭菌锅。
本发明对所述发酵的设备没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的发酵设备即可，如发酵罐。
在本发明中，所述成绿肉座菌二级液体培养的温度优选为25～35℃，更优选的为28～32℃，最优选为30℃；所述成绿肉座菌二级液体培养的初始pH值优选为5.5～6.5，更优选的为5.8～6.2，最优选为6.0。
在本发明中，所述成绿肉座菌二级液体培养优选在持续通入无菌空气条件下进行，所述通入无菌空气的程序具体优选为：接种到二级液体培养基后的24h之内，通气量为100～180m3/h，更优选为120～160m3/h，最优选为150m3/h；培养24h后，通气量为200～260m3/h，更优选为220～250m3/h，最优选为240m3/h。本发明对所述通入无菌空气的设备没有特殊的 限定，采用本领域技术人员熟知的通气设备即可，如空压机。
在本发明中，所述成绿肉座菌二级液体培养的时间优选为50～75h，更优选为60～70h，更优选为65h。
得到成绿肉座菌二级液体培养液后，本发明将得到的成绿肉座菌二级液体培养液接种于成绿肉座菌固体培养基中，进行固体发酵，得到成绿肉座菌。在本发明中，所述固体发酵的接种量优选为10～30％，更优选为15～25％，最优选为20％。
在本发明中，所述成绿肉座菌固体培养基优选包括以下重量份的组分：麦麸64％～76％、豆粕8％～13％、玉米粉7.6％～13.5％、谷壳7.8％～13.4％，更优选为68％～74％、豆粕9％～11％、玉米粉8.4％～11.4％、谷壳8.6％～11.2％；最优选为麦麸70％、豆粕10％、玉米粉10％、谷壳10％。本发明优选在所述成绿肉座菌固体培养基中添加蒸馏水，使固体培养基含水量优选为45％～55％，更优选为47％～52％，最优选为50％，然后进行固体发酵。
本发明对所述固体培养过程的环境温度、菌料温度和环境湿度控制。在本发明中，所述温度和湿度的控制程序具体优选为：在进入固体培养1～3d之内控制环境湿度优选为85～90％，更优选为88％，环境温度优选为25～35℃，菌料温度控制为28～30℃；在进入固体培养4～5d之内控制环境湿度为40～60％，环境温度为30℃；6～7d之内环境温度优选为30～35℃；所述固体培养32～36h时优选翻盘散热；所述固体培养48～55h时优选将营养液喷洒到菌料上。
在本发明中，所述营养液优选包括质量浓度为2～7％葡萄糖和质量分数为0.0005～0.002％的ZnCl2，更优选为5％葡萄糖和质量分数为0.001％的ZnCl2。本发明对所述葡萄糖和ZnCl2的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员所熟知常规药品即可。
在本发明中，所述营养液的喷洒体积优选为菌料体积的5～10％，更优选为6～9，最优选为7％。
在本发明中，所述固体培养基的厚度优选为2～5cm，更优选为2.5～3.5cm，最优选为3cm。
完成所述成绿肉座菌固体发酵后，本发明优选对得到孢子粉的进行收集，得到成绿肉座菌。在本发明中，所述成绿肉座菌孢子的收集具体采用微生物固态发酵真菌孢子分离设备的仪器进行。所述微生物固态发酵真菌孢子分离设备的仪器购自江西天人生态股份有限公司。
在本发明中，所述固体发酵得到的成绿肉座菌的有效孢子量为300亿/克以上。
本发明提供的成绿肉座菌颗粒剂优选包括10～25份辅助剂，更优选为12～20份，最优选为15份。本发明对所述的辅助剂的种类和来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的农药颗粒剂的辅助剂的市售商品即可。具体的可优选葡萄糖和玉米淀粉中的一种或两种。 在本发明中，所述辅助剂具体的可优选7～15份葡萄糖和3～10份玉米淀粉，更优选为8～12份葡萄糖和4～8份玉米淀粉，最优选为10份葡萄糖和5份玉米淀粉。在本发明中，所述的辅助剂使药物性状稳定，提高药效。
本发明提供的成绿肉座菌颗粒剂优选包括50～90份药物载体，更优选为65～80份，最优选为75份。在本发明中，所述药物载体优选为硅藻土、滑石粉、白炭黑、硫酸钠、陶土和高岭土中的一种或几种。本发明对所述的药物载体的来源没有特殊的限定，采用市售商品即可。在本发明中，所述药物载体具体的可优选为上述物质中的任意几种，可任意比例混合。在本发明中，所述药物载体具体的更优选为上述物质中的滑石粉和高岭土，具体的可优选为5～15份滑石粉和45～75份高岭土，更优选为8～12份滑石粉和60～68份高岭土，最优选为10份滑石粉和65份高岭土。本发明所述的药物载体具有良好的药物稳定性，亦可提高药物的药效。
在本发明中，所述成绿肉座菌颗粒剂优选包括15～25份水，更优选为19～23份，最优选为22份。
本发明提供了上述技术方案所述成绿肉座菌颗粒剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将药物载体、药物活性组分和辅助剂混合、粉碎，得到粉料；
2)将所述步骤1)得到的粉料与水混合、造粒，得到成绿肉座菌颗粒剂。
在本发明中，所述药物载体、药物活性组分和辅助剂的混合优选为将药物载体、药物活性组分和辅助剂分别平均分成3～5份，更优选为4份，将第1份药物载体与第1份药物活性组分混合后，再与第1份辅助剂混合，然后再与第2份药物载体混合，再与第2份药物活性组分混合，再与第2份辅助剂混合，以此类推，直到添加完所有的原料，再继续优选混合40～80min，更优选为50～70min，最优选为60min。本发明对所述混合的设备没有特殊的限制，采用本领域技术人员熟知的混合设备即可，比如混合灌。
在本发明中，对所述粉料的粒度优选为10～25μm，更优选为12～20μm，最优选为15μm。本发明对所述粉碎的条件没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的粉碎条件即可。在本发明中，所述粉碎具体的可优选为气流式粉碎，气流式粉碎的轴密封压力优选为0.05～0.20MPa，更优选为0.1～0.15MPa，最优选为0.13MPa；气流式粉碎的出料气封压力优选为0.1～0.2MPa，更优选为0.15MPa；气流式粉碎的脉冲压力优选为0.3～0.7MPa，更优选为0.4～0.6MPa，最优选为0.5MPa；气流式的进料压力优选为0.7～0.9MPa，更优选为 0.75～0.85MPa，最优选为0.8MPa。本发明对所述粉碎的设备没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的粉碎设备即可。
得到粉料后，本发明将所述粉料与水混合造粒，得到成绿肉座菌颗粒。在本发明中，所述造粒的温度优选为50～70℃，更优选为55～65℃，最优选为60℃。所述成绿肉座菌颗粒的粒度优选为400μm～2200μm，更优选为500μm～2100μm，最优选为600μm～2000μm。本发明对所述造粒的设备没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的造粒设备即可。
在本发明中，所述的成绿肉座菌颗粒剂的含孢量优选为5～50亿孢子/克，更优选为8～15亿孢子/克，最优选为10亿孢子/克。
在本发明中，所述的成绿肉座菌颗粒剂的杂菌率≤0.1％；所述的成绿肉座菌的脱落率≤3％。
本发明还提供了上述技术方案所述的成绿肉座菌颗粒剂或上述技术方案所述方法制备得到的成绿肉座菌颗粒剂在植物土传病害方面的应用。具体的，可应用的农作物种类包括粮食作物、经济作物、蔬菜作物、果类作物、饲料作物等。本发明所述的成绿肉座菌颗粒剂可防治各类植物土传病害，如灰霉病、疫病、白粉病、根腐病、枯萎病、菌核病、蔓枯病、苗期猝倒病、立枯病等。
本发明对所述的成绿肉座菌颗粒剂的施药方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的施药方法即可。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
成绿肉座菌的制备：将保藏的成绿肉座菌菌种接种于装有营养琼脂培养基的茄型瓶中，30℃培养35h进行活化培养；活化培养后的成绿肉座菌以20％的接种量接种于121℃灭菌35min后的一级液体培养基中，具体的培养条件为：温度为28℃；pH值为6.0；接种后进入24h内，通气量为15m3/h，培养24h后，通气量为25m3/h；培养45h后停止培养，得到成绿肉座菌一级液体培养液；将得到的一级培养液以20％的接种量接种于成绿肉座菌二级液体培养液中，具体的培养条件为：温度为30℃；pH值为6.0；接种后进入24h内，通气量为150m3/h，培养24h后，通气量为240m3/h；培养65h后停止培养，得到成绿肉座菌二级液体培养液；将 得到的成绿肉座菌二级培养液以20％的接种量接种于固体培养基中，在固体培养基中加入蒸馏水，使固体培养基含水量为50％，然后进行固体发酵培养，发酵培养条件为：在进入固体培养1～3d之内控制环境湿度优选为90％，环境温度优选为25℃，菌料温度控制为30℃；在进入固体培养4～5d之内控制环境湿度为60％，环境温度为30℃；6～7d之内环境温度优选为35℃；所述固体培养36h时优选翻盘散热，在固体培养50h时将营养液喷洒到菌料上；将固体发酵后的菌料采用微生物固态发酵真菌孢子分离设备收集成绿肉座菌孢子，经检测，成绿肉座菌的有效孢子量为300亿孢子/克以上。
实施例2
成绿肉座菌颗粒剂的制备：以重量份数计，将10份滑石粉、65份高岭土、10份实施例1制备的成绿肉座菌、10份葡萄糖和5份玉米淀粉分别平均分成4堆，将第1堆滑石粉与第1堆高岭土混合后，再与第1堆成绿肉座菌混合，再与第1堆葡萄糖混合，再与第1堆玉米淀粉混合，再与第2堆滑石粉混合，以此类推，直到所有原料全部混合完，再继续混合60min，得到混合料；混合料经气流式粉碎，得到15μm的粉料；粉料再添加22份的水，在温度60℃条件下，制造成1200μm的颗粒，得到成绿肉座菌颗粒剂。
表1实施例2制备的成绿肉座菌颗粒剂的质量控制指标
实施例3
成绿肉座菌颗粒剂的制备：以重量份数计，将75份高岭土、10份实施例1制备的成绿肉座菌、15份葡萄糖分别平均分成4堆，将第1堆高岭土与第1堆成绿肉座菌混合后，再与 第1堆葡萄糖混合，再与第2堆高岭土混合，以此类推，直到所有原料全部混合完，再继续混合50min，得到混合料；混合料经气流式粉碎，得到10μm的粉料；粉料再添加25份的水，在温度60℃条件下，制造成1600μm的颗粒，得到成绿肉座菌颗粒剂。
实施例4
成绿肉座菌颗粒剂的制备：以重量份数计，将65份高岭土、10份硅藻土、15份实施例1制备的成绿肉座菌、7份葡萄糖和3份玉米淀粉分别平均分成4堆，将第1堆高岭土与第一堆硅藻土混合后，再与第1堆成绿肉座菌混合，再与第1堆葡萄糖混合，再与第一堆玉米淀粉混合，再与第2堆高岭土混合，以此类推，直到所有原料全部混合完，再继续混合40min，得到混合料；混合料在经气流式粉碎，得到12μm的粉料；粉料再添加20份的水，在温度50℃条件下，制造成1000μm的颗粒，得到成绿肉座菌颗粒剂。
实施例5
药效试验：本次试验在张家港进行，防治水稻纹枯病。本次试验将实验田均分为四个区域，区域1为对照组，只顺垄喷施清水；区域2顺垄喷施实施例2中制备的成绿肉座菌颗粒剂1000倍稀释液；区域3顺垄喷施5％井冈霉素水剂，药物活性组分的浓度与区域2相同；区域4顺垄喷施24％噻呋酰胺悬浮剂1000倍稀释液；四个区域的用药量相同，施药后7天，15天，20天，30天各调查一次。采用双行直线取样法，每处理取5点，每点查5穴。调查各处理的总株数、病株数、病情严重度，计算病株率。病情指数和防效。具体结果如表3所示，由表3的数据可以得出，施药25天区域2的防效最高，表明本发明制备的成绿肉座菌颗粒剂对水稻纹枯病效果最好，其药效均高于井冈霉素和噻呋酰胺。
表2成绿肉座菌颗粒剂的对植物土传病害(水稻纹枯病)的效果
从表2的试验数据可以得出，本发明制备的成绿肉座菌颗粒剂25天的防效可高达75.8％，随着施药后时间的延长，防效逐渐升高，持效期长。
上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用，对上述实施方式进行修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、创造性特点的方法、工艺、产品，均落入本发明的保护范围之内。