一种苔藓与荒漠藻复合结皮的培育方法与流程

本发明属于环境工程技术领域，涉及沙漠化土壤的生态修复，更具体涉及一种苔藓与荒漠藻复合结皮的培育方法。

背景技术：

生物土壤结皮（Biological soil crusts）是藻类优先生长，将土表固定后，其他隐花植物随后也生长于其上所形成的表层土壤。它们广泛分布于全球干旱和半干旱地区，在这些区域发挥着固碳、固氮、稳定土壤、改变土壤反射率和水分条件、影响维管植物的生长和种子萌发等重要的生态作用。生物土壤结皮通常由真菌、地衣、苔藓和藻类组成。按照生物土壤结皮中主要组成生物的不同，可将其分为藻结皮、地衣结皮和苔藓结皮。通常情况下藻结皮是生物土壤结皮形成的首要阶段，只有藻结皮形成并稳定表层土壤后，地衣、苔藓等隐花植物才有可能拓殖。而苔藓结皮是生物土壤结皮发育演替的高级阶段，苔藓植物一旦拓殖以后，通过各种途径加速土壤的形成，并逐渐改善表土的水肥状况，当有机层达到足够的厚度时，维管植物便可进行拓殖。

干旱与半干旱地区生态退化的直观表现就是土地荒漠化。尽管荒漠化土地在消除人为干扰后能够缓慢地恢复，但通过生物土壤结皮的自然演替改善表土从而实现维管植物的拓殖则需要漫长的时间。因为在自然状态下，生物土壤结皮的发育受到多种因素的影响和制约，其演替过程十分缓慢。因此加速生物土壤结皮的演替对于荒漠化土地的治理具有重要的意义。

目前，在荒漠化地区采用人工接种大规模培养的荒漠藻形成藻结皮的方法已具有完善的技术体系与应用实践，而针对苔藓结皮培育方法的探索却存在一些技术缺点。中国专利（申请）号为200410098476.x的专利提供了利用苔藓植物治理石漠化的方法；中国专利（申请）号为201410586406.2的专利提供了一种黄土高原苔藓结皮的快速培育方法；中国专利（申请）号为201410691489.1的专利提供了一种沙地苔藓结皮的快速培育方法。上述专利对苔藓结皮的培育进行了一定的探索，但其共同点是苔藓材料依赖于野外的大量采集，而这并不适用于干旱地区和荒漠化地区。中国专利（申请）号为200810035554.x的专利提供了荒漠苔藓及其生物结皮快速增殖的方法，该技术能够实现荒漠苔藓结皮的室内小规模培养，而在大规模生产中却较难实现，同时也不适用于荒漠化地区。

在荒漠化地区，苔藓的拓殖是以藻结皮对表土的固定和改良为基础的，因此在荒漠化地区直接培育苔藓结皮用于荒漠化治理缺乏必要的物质基础和环境条件。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的难题，本发明的目的是在于提供了一种苔藓与荒漠藻复合结皮的培育方法，方法易行，操作方便，维护简便，加速了荒漠地区生物土壤结皮的演替过程，实现了干旱和半干旱地区荒漠化土壤快速高效的治理。

本发明采用以下技术方案：

一种苔藓与荒漠藻复合结皮的培育方法，其步骤是：

1. 荒漠化待治理地区苔藓优势种确认和苔藓结皮的采集与保存：根据广泛的调查，在夏季识别待修复地区自然生境中生物土壤结皮的苔藓优势种类，选择该种类发育良好的苔藓结皮，用环刀采集表层结皮，室温（20-25°C，以下相同）下风干10-15天备用。

2. 苔藓结皮的活性恢复：风干的苔藓样品喷水至完全湿润后培养至少48小时使其活性恢复；苔藓样品活性恢复过程中温度设置为10-15 °C，光照强度为5-20 μmol m^-2s^-1，光暗周期为12/12，湿度为60%-80%。

3. 用蒸馏水冲掉活性恢复后的苔藓结皮包含的沙土，获得苔藓配子体。将获得的苔藓配子体在无菌蒸馏水中清洗后进行消毒处理。消毒处理用质量分数5%次氯酸钠消毒10秒，然后再用无菌的蒸馏水清洗三次。

4. 固体培养获得原丝体： 消毒后的苔藓配子体放入固体培养基中进行培养以获得原丝体，所述的固体培养基为含有质量分数1%-1.5%琼脂的BG11固体培养基。培养条件具体为：温度分别为白天25-30°C、黑夜10-15 °C，光暗周期为12/12小时，环境湿度60%-80%，光照强度为培养初期15 μmol m^-2s^-1，待原丝体适应环境后开始大量繁殖时，光照强度增加为70-100 μmol m^-2s^-1。培养周期为15-20天。

5. 液体培养获得大量配子体：在显微镜下大量挑取固体培养得到的苔藓原丝体，将苔藓原丝体放入CT液体培养基中静置培养，培养周期为20-30天，苔藓原丝体分化为苔藓配子体。将苔藓配子体放入液体CT培养基中进行通气扩大培养，获得大量可用于接种的苔藓配子体，培养周期为30-40天。所述的CT液体培养基，其配方为：150 mg L^-1 四水硝酸钙（Ca(NO₃)₂·4H₂O）、100 mg L^-1 硝酸钾（KNO₃）、40 mg L^-1 七水硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）、25 mg L^-1 五水β甘油磷酸钠（β-Na₂ glycerophosphate·5H₂O）、400 mg L^-1 三羟甲基甲胺基丙磺酸（C₇H₁₇NO₆S）、2.25 mg L^-1 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na₂）、0.123 mg L^-1 四水氯化锰（MnCl₂·4H₂O）、0.015 mg L^-1 七水氯化锌（ZnCl₂·7H₂O）、0.012 mg L^-1 二水钼酸钠（Na₂MoO₄·2H₂O）、0.291 mg L^-1 六水氯化铁（FeCl₃·6H₂O）、0.006 mg L^-1 六水氯化钴（CoCl₂·6H₂O）。

6. 荒漠藻藻种和液体培养获得大量生物质：将荒漠藻用液体培养基通气培养至对数生长期，去除部分上清后获得藻浆。所述的荒漠藻为微鞘藻属（Microcoleus）、伪枝藻属（Scytonema）、念珠藻属（Nostoc）、席藻属（Phormidium）、鞘丝藻属（Lyngbya）其中的一种或二至五种的任意混合，荒漠藻培养所用培养基为液体BG11培养基。

7. 混合接种、结皮养护和形成苔藓与荒漠藻复合结皮：将苔藓配子体与荒漠藻藻浆混合后接种至沙化土壤表面，定期维护，培育获得苔藓和荒漠藻的复合结皮。

上述步骤4和步骤6中，所述的BG11培养基配方为：1500 mg L^-1 硝酸钠（NaNO₃）、75 mg L^-1 七水硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）、40 mg L^-1 三水磷酸氢二钾（K₂HPO₃·3H₂O）、36 mg L^-1二水氯化钙（CaCl₂·2H₂O）、20 mg L^-1 碳酸钠（Na₂CO₃）、6 mg L^-1 柠檬酸（C₆H₈O₇）、6 mg L^-1柠檬酸铁铵（C₆H₁₀FeNO₈）、1 mg L^-1 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na₂）、2.86 mg L^-1 硼酸（H₃BO₃）、1.86 mg L^-1 四水氯化锰（MnCl₂·4H₂O）、0.39 mg L^-1 二水钼酸钠（Na₂MoO₄·2H₂O）、0.22 mg L^-1 七水硫酸锌（ZnSO₄·7H₂O）、0.08 mg L^-1 五水硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）、0.05 mg L^-1 六水硝酸钴（Co(NO₃)₂·6H₂O）。

上述步骤5和步骤6中，所述的培养条件具体为：温度分别为白天25-30°C、黑夜10-15 °C，光暗周期为12/12小时，光照强度为70-100 μmol m^-2s^-1。

上述步骤5和步骤6中，所述的通气培养是以空气泵将气体泵入液体培养基中，气体通入培养液之前以Millipore Millex-GP过滤器对空气进行过滤。

上述步骤6中，所述的培养液自然沉降12小时后，去除部分上清液，获得藻浆。

上述步骤7中，苔藓配子体与荒漠藻（1种或多种混合）以干重比为1:2-1:10的比例混合均匀进行接种。

上述步骤7中，所述的定期维护流程为：接种后15天内，每6小时用微喷浇水一次，每次10-20分钟，水流量为30 mL m^-2 min^-1，15天后每12小时浇水一次，30天后停止浇水；在此过程中视情况施加1-2次稀释后的BG11培养液。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1. 使用该发明接种苔藓和荒漠藻，很快能在沙化土壤表面形成苔藓和荒漠藻复合结皮，荒漠藻结皮形成后对表层土壤环境进行缓慢的改善，为苔藓结皮的拓殖提供了必要的物质基础，加速了结皮的演替进程。

2. 以液体培养基培养苔藓原丝体能够大量获得苔藓配子体，解决了现有技术中苔藓材料大多依靠野外大量采集的问题。

3. 苔藓与荒漠藻复合结皮的培育，提高了人工生物土壤结皮的物种多样性与生存能力，使其能更好地适应各种基质条件与环境。

附图说明

图1 为一种苔藓与荒漠藻复合结皮的培育方法流程图。

其中：1－荒漠化待治理地区苔藓优势种确认、2－苔藓结皮采集与保存、3－苔藓结皮活性恢复、4－固体培养获得原丝体、5－液体培养获得大量配子体、6－荒漠藻藻种、7－液体培养获得大量生物质、8－混合接种、9－结皮养护、10－形成苔藓与荒漠藻复合结皮。

图2 为一种真藓原丝体培养20天后出现大量配子体的分化示意图。

图中细丝状为真藓原丝体，其余为配子体。

图3 为一种真藓原丝体液体培养60天时获得大量苔藓配子体示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本接种技术进行论证说明。

实施例1：

根据图1可知，一种苔藓与荒漠藻复合结皮的培育方法，其步骤是：

1. 荒漠化待治理地区苔藓优势种确认1和苔藓结皮的采集与保存2：根据广泛的调查，在夏季识别待修复地区自然生境中生物土壤结皮的苔藓优势种类，选择该种类发育良好的苔藓结皮，用环刀采集表层结皮，室温下风干10或13或15天备用。

2. 苔藓结皮活性恢复3：苔藓结皮的活性恢复，风干的苔藓样品喷水至完全湿润后培养至少48小时使其活性恢复；苔藓样品活性恢复过程中温度设置为10或12或14或15 °C，光照强度为5或10或15或20 μmol m^-2s^-1，光暗周期为12/12，湿度为60或65或70或80%。

3. 用蒸馏水冲掉活性恢复后的苔藓结皮包含的沙土，获得苔藓配子体。将获得的苔藓配子体在无菌蒸馏水中清洗后进行消毒处理。消毒处理用质量分数5%次氯酸钠消毒10秒，然后再用无菌的蒸馏水清洗三次。

4. 固体培养获得原丝体4：消毒后的配子体放入固体培养基中进行培养以获得原丝体。所述的固体培养基为含有质量分数1或1.2或1.4或1.5%琼脂的BG11固体培养基。培养条件具体为：温度分别为白天25或28或30°C、黑夜10或13或15 °C，光暗周期为12/12小时，环境湿度60或65或70或75或80%，光照强度为培养初期15μmol m^-2s^-1，待原丝体适应环境后开始大量繁殖时，光照强度增加为70或80或90或100 μmol m^-2s^-1。培养周期为15或17或20天。

5. 液体培养获得大量配子体5：在显微镜下大量挑取固体培养得到的苔藓原丝体，将苔藓原丝体放入CT液体培养基中静置培养，培养周期为20-30天，苔藓原丝体分化为苔藓配子体。将苔藓配子体放入液体CT培养基中进行通气扩大培养，获得大量可用于接种的苔藓配子体，培养周期为30-40天。所述的CT液体培养基，其配方为：150 mg L^-1 四水硝酸钙（Ca(NO₃)₂·4H₂O）、100 mg L^-1 硝酸钾（KNO₃）、40 mg L^-1 七水硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）、25 mg L^-1 五水β甘油磷酸钠（β-Na₂ glycerophosphate·5H₂O）、400 mg L^-1 三羟甲基甲胺基丙磺酸（C₇H₁₇NO₆S）、2.25 mg L^-1 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na₂）、0.123 mg L^-1 四水氯化锰（MnCl₂·4H₂O）、0.015 mg L^-1 七水氯化锌（ZnCl₂·7H₂O）、0.012 mg L^-1 二水钼酸钠（Na₂MoO₄·2H₂O）、0.291 mg L^-1 六水氯化铁（FeCl₃·6H₂O）、0.006 mg L^-1 六水氯化钴（CoCl₂·6H₂O）。

6. 荒漠藻藻种6和液体培养获得大量生物质7：将荒漠藻用液体培养基通气培养至对数生长期，去除部分上清后获得藻浆。所述的荒漠藻为微鞘藻属（Microcoleus）、伪枝藻属（Scytonema）、念珠藻属（Nostoc）、席藻属（Phormidium）、鞘丝藻属（Lyngbya）其中的一种或二至五种的任意混合，荒漠藻培养所用培养基为液体BG11培养基。

7. 混合接种8、结皮养护9和形成苔藓与荒漠藻复合结皮10：将苔藓配子体与荒漠藻藻浆混合后接种至沙化土壤表面，定期维护，培育获得苔藓和荒漠藻的复合结皮。

上述步骤4和步骤6中，所述的BG11培养基配方为：1500 mg L^-1 硝酸钠（NaNO₃）、75 mg L^-1 七水硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）、40 mg L^-1 三水磷酸氢二钾（K₂HPO₃·3H₂O）、36 mg L^-1二水氯化钙（CaCl₂·2H₂O）、20 mg L^-1 碳酸钠（Na₂CO₃）、6 mg L^-1 柠檬酸（C₆H₈O₇）、6 mg L^-1柠檬酸铁铵（C₆H₁₀FeNO₈）、1 mg L^-1 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na₂）、2.86 mg L^-1 硼酸（H₃BO₃）、1.86 mg L^-1 四水氯化锰（MnCl₂·4H₂O）、0.39 mg L^-1 二水钼酸钠（Na₂MoO₄·2H₂O）、0.22 mg L^-1 七水硫酸锌（ZnSO₄·7H₂O）、0.08 mg L^-1 五水硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）、0.05 mg L^-1 六水硝酸钴（Co(NO₃)₂·6H₂O）。

上述步骤5和步骤6中，所述的培养条件具体为：温度分别为白天25或27或30°C、黑夜10或13或15 °C，光暗周期为12/12小时，光照强度为70或80或90或100 μmol m^-2s^-1。

上述步骤5和步骤6中，所述的空气泵进行通气培养，气体通入培养液之前以Millipore Millex-GP过滤器对空气进行过滤。

上述步骤6中，所述的培养液自然沉降12小时后，去除部分上清液，获得藻浆。

上述步骤7中，苔藓配子体与荒漠藻（1种或多种混合）以干重比为1:2-1:10的比例混合均匀进行接种，接种的苔藓配子体与荒漠藻总干重为0.3-1.0 g m^-2。

上述步骤7中，所述的定期维护流程为：接种后15天内，每6小时用微喷浇水一次，每次10或13或15或18或20分钟，水流量为30 mL m^-2 min^-1，15天后每12小时浇水一次，30天后停止浇水；在此过程中视情况施加1-2次稀释后的BG11培养液。

维护一段时间后即可形成真藓与具鞘微鞘藻的初始复合结皮。

实施例2：

根据图1可知，一种苔藓与荒漠藻复合结皮的培育方法，其步骤是：

调查发现真藓（Bryum argenteum）和土生对齿藓（Didymodon vinealis）广泛分布于内蒙古自治区达拉特旗。选择发育良好的两种苔藓结皮，风干后分别保存。风干的真藓样品喷水至完全湿润后，在温度为15 °C，光照强度为20 μmol m^-2s^-1，光暗周期为12/12，湿度为80%的条件下培养至少48小时使其活性恢复。恢复活性后的真藓结皮用蒸馏水冲掉沙土，获得真藓配子体。将配子体在无菌蒸馏水中清洗三次。随后用质量分数5%次氯酸钠消毒10秒钟，然后再用蒸馏水清洗三次。将消毒后的真藓配子体放置于BG11固体培养基上培养。培养条件为：温度分别为白天30°C、黑夜15 °C，光暗周期为12/12小时，湿度80%，光照强度为70 μmol m^-2s^-1。培养周期为18天。在显微镜下大量挑取固体培养得到的苔藓原丝体，将苔藓原丝体放入CT液体培养基中静置培养，培养周期为20-30天，苔藓原丝体分化为苔藓配子体。培养条件为：温度分别为白天30°C、黑夜15 °C，光暗周期为12/12小时，光照强度为培养初期15 μmol m^-2s^-1，待原丝体适应环境后开始大量繁殖时，光照强度增加到100 μmol m^-2s^-1。培养20天后出现大量配子体的分化（图2）。将苔藓配子体放入液体CT培养基中进行通气扩大培养，获得大量可用于接种的苔藓配子体，培养周期为30-40天。培养条件为：温度分别为白天30°C、黑夜15 °C，光暗周期为12/12小时，光照强度为100 μmol m^-2s^-1。随着培养时间的增加，真藓配子体的数量仍然在持续的增长，培养到60天时真藓配子体几乎充满了整个锥形瓶（图3）。

在10 L的血清瓶中以BG11培养基通气培养具鞘微鞘藻（Microcoleus vaginatus），培养条件为：温度分别为白天30°C、黑夜15 °C，光暗周期为12/12小时，光照强度为100 μmol m^-2s^-1。培养至对数生长期后，自然沉降12小时后去除部分上清获得藻浆。

将苔藓的配子体与具鞘微鞘藻按照干重为1:8的比例进行混合，混合均匀后喷洒接种于沙子表面，接种的苔藓配子体与具鞘微鞘藻总干重为0.9 g m^-2。

接种后15天内，每6小时用微喷浇水一次，每次10-20分钟，水流量为30 mL m^-2min^-1，15天后每12小时浇水一次，30天后停止浇水；在此过程中视情况施加1-2次稀释后的BG11培养液。

一个月后即可形成真藓与具鞘微鞘藻的初始复合结皮，结皮盖度能够达到90%左右，其中苔藓的盖度能够达到60%-90%。

其它实施步骤与实施例1相同。

实施例3：

土生对齿藓配子体的培养方式同实施例1。

分别培养具鞘微鞘藻和爪哇伪枝藻（Scytonema javanicum）至对数期，培养方式同实施例1或实施例2。

将土生对齿藓配子体与具鞘微鞘藻和爪哇伪枝藻按照干重为1:5:3的比例进行混合，混合均匀后喷洒接种于沙子表面，接种的苔藓配子体与具鞘微鞘藻和爪哇伪枝藻总干重为0.9 g m^-2。

结皮接种后的维护同实施例1或实施例2。

一个月后即可形成土生对齿藓与具鞘微鞘藻和爪哇伪枝藻的初始复合结皮，结皮盖度能够达到94%左右，其中苔藓的盖度能够达到50%-92%。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。