本发明属于细胞培养技术领域，涉及一种楸树胚性细胞悬浮系的建立方法。
背景技术：
楸树(Catalpa bungeiC.A.Meyer.)属紫葳科(Bignoniaceae)梓树属(Catalpa)，原产中国，是我国特有的珍贵树种，素有“木王”之称。世界上紫菀科梓属的植物约13种，主要分布于美洲和东亚（郭从俭等，1994）。在我国，楸树分布由暖温带及亚热带，在山东、江苏、河南、安徽省分布较多（石欣等，2011年）。
楸树利用历史悠久，是珍贵用材树种和著名园林观赏树种（唐玲等，2007年）。楸树被国家列为重要用材树种，其木材具有不翘裂、耐腐蚀、易加工、纹理美观等特点，专用来加工高档商品和特种产品。楸树树形优美，叶被密毛、皮糙枝密，有利于隔音、减声、防噪、滞尘，且对环境中多种有毒气体，诸如氯气和二氧化硫等具有较强吸收能力，是我国具有较高环保价值的重要园林绿化和观赏树种。由于楸树自花不育，经常开花而不结实，种子萌发率很低，且采用扦插方法繁殖生根困难，给楸树优良品系的繁殖和推广利用造成很大的障碍，加之材质优良加剧了人们的开发利用，造成楸树资源的缺乏。
目前，关于楸树体细胞胚胎发生的研究并不多，主要集中在体细胞胚胎发生过程的细胞形态学研究、生理生化以及体胚发生诱导的初期研究，尚未见有关如何建立高效稳定的楸树体细胞胚胎悬浮系培养的报道。植物细胞悬浮培养具有生长比完整个体植株快，营养和环境要求易控制，可实现周年生长，不受地缘因素影响；此外，还可能产生新的、满足医药和化工等生物活性需要的化合物；建立一个成功的细胞悬浮培养体系对开展基础研究和依托生物反应器进行产业化开发至关重要。
植物细胞悬浮培养中最常见的问题是褐化以及悬浮细胞胚性的消失。能否有效地解决这两个问题，是建立细胞悬浮系的关键之处。褐化的产生原因较多，如外植体的基因型及培养条件等。常用的防褐化物质主要包括活性炭、抗坏血酸、硝酸银、柠檬酸、PVPP等，这些添加物能在一定程度上抑制褐化对悬浮培养细胞的影响。悬浮细胞胚性的衰退消失是另外一个重要问题，特别是在单子叶植物(如甘蔗、水稻及玉米等)细胞悬浮培养过程中，胚性衰退问题亟待解决。因此，通过选择合适的外植体，维持细胞胚性稳固存在，建立稳定的胚性细胞悬浮培养体系，可为体胚发生的细胞形态学观察、体细胞杂交、遗传转化及产业化繁殖提供实验材料和重要的理论实验依据。
技术实现要素：
本发明提供一种楸树胚性细胞悬浮系的建立方法，通过细胞悬浮培养的方法建立稳定的胚性细胞悬浮系。
本发明技术方案：
一种楸树胚性细胞悬浮系的建立方法，包括以下步骤：
1）外植体灭菌及楸树胚性愈伤组织的获得：取楸树未成熟的种子，经灭菌后，剥取幼嫩种胚作为外植体，将所述的外植体诱导，获得胚性愈伤组织；
2）初级悬浮培养产物诱导：将步骤1）获得的胚性愈伤组织转接到初级培养液中进行培养，得到楸树初级悬浮培养产物；
3）胚性细胞悬浮培养筛选：将步骤2）获得的初级悬浮培养增殖产物过细胞筛后转接于胚性细胞悬浮培养液中培养，得到胚性细胞悬浮体系；
完成楸树胚性细胞悬浮系的建立。
优选地，所述步骤1）灭菌方法为依次经75%的酒精、2%的次氯酸钠溶液灭菌。
优选地，所述步骤2）初级培养液为1/2MS液体基本培养基。
优选地，所述步骤2）培养条件为转速100~120 r/min，培养温度23~27 ℃，光照强度900~1100Lx，光照时间14~16h/d的条件下培养，继代培养周期16-20天，继代培养2次，继代培养时用60目、80目的细胞筛过筛处理，过筛后液体静置1h后弃上清液，补入等量新鲜培养基，并将筛上的细胞团接入新鲜液体培养基中继续培养。
优选地，所述步骤3）培养条件为转速100~120 r/min，培养温度23~27 ℃，光照强度900~1100Lx，光照时间14~16h/d的条件培养，继代培养周期16-20天，继代培养是过60目细胞筛处理。
进一步优选地，所述步骤3）胚性细胞悬浮培养筛选培养液为1/2MS添加了聚乙二醇6000，所述培养液中聚乙二醇6000质量浓度为0%-20%
更进一步优选地，所述培养液中聚乙二醇6000质量浓度为10%。
本发明有益效果：
1、本发明提供了珍贵用材树种楸树的一种胚性细胞悬浮系的建立方法。该方法以楸树未成熟种子的幼嫩种胚诱导出胚性愈伤组织，通过细胞悬浮培养的方法建立稳定的胚性细胞悬浮系。以幼嫩种子进行离体培养优势在于诱导分化能力强，长期继代过程不易退化，获得的稳定的胚性细胞悬浮培养体系，可用于次级代谢产物生产利用、遗传转化研究及生物反应器规模化生产等方面，还可用于筛选理想的突变体及悬浮细胞系生理生化指标的研究。
2、本发明通过培养液选择，可以筛选出合适的培养液配方及有效添加物成分，诱导悬浮培养产物向胚性细胞系转化，促进细胞增殖，避免褐化死亡。通过建立液体悬浮培养体系，可获得大小均一一致的胚性细胞团或单细胞，建立悬浮培养体系，为生物反应器规模化生产、体细胞胚胎发育进场研究、体细胞杂交及遗传转化研究提供实验材料和重要的理论实验依据。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：
图1楸树初级悬浮培养产物在体视显微镜下的照片；
图2未添加PEG多次继代悬浮培养产物；
图3添加PEG的胚性细胞悬浮培养增殖产物；
图4添加PEG的悬浮培养产物固体培养增殖；
图5添加PEG的悬浮培养产物的植株再生。
具体实施方式
下面结合实施例来进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
实施例1
MS基本培养基：可参照文献（Murashige T, Skoog F. A revised medium for rapid grouth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant, 1962, 15: 473-497）配制。
一种楸树胚性细胞悬浮系的建立方法，包含以下步骤：
1）外植体灭菌及楸树胚性愈伤组织的获得：
外植体灭菌，取楸树未成熟的种子，依次经75%的酒精、2%次氯酸钠溶液灭菌后，剥取幼嫩种胚作为外植体；将所述的外植体置于一系列固体培养基中诱导，获得淡黄色胚性愈伤组织。
所述步骤1）楸树胚性愈伤组织获得方法包括：①愈伤组织的诱导：以经灭菌的楸树幼嫩种胚为外植体，将其置于愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织；诱导培养基是在1/2MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤(6-BA）和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)；②愈伤组织的增殖：将愈伤组织置于增殖培养基上增殖；培养基是在1/2MS基本培养基的基础上添加了浓度为2.0 mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)和浓度为0.1mg/L的α-萘乙酸（NAA）；③胚性愈伤组织的诱导：将增殖后的愈伤组织置于分化诱导培养基上诱导胚性愈伤组织，分化诱导培养基是在1/2MS基本培养基的基础上添加了浓度为1.0 mg/L 的6-苄基嘌呤(6-BA)和浓度为0-0.1 mg/L 的α-萘乙酸（NAA））
2）初级悬浮培养产物诱导：将步骤1）获得的胚性愈伤组织转接到初级培养液中进行培养，250ml的三角瓶中培养液的量为100ml培养液，在转速110r/min，培养温度25℃，光照强度1000Lx，光照时间16h/d的条件下培养，诱导培养周期为18天，继代培养时用60目、80目的细胞筛过筛处理，过筛后液体静置1h后弃上清液，补入等量新鲜培养基，并将筛上的细胞团接入新鲜液体培养基中继续培养。所述悬浮培养液含：1/2MS，得到楸树初级悬浮培养产物；
如图1所示，培养后的悬浮产物至体视显微镜下观察，可见大量游离透明的长条状细胞和球形细胞，少量以球形细胞为主聚集而成的细胞团，且细胞通明、内含物稀薄。二次继代后继续用1/2MS培养液继代，培养过程中易出现细胞褐化死亡的现象，悬浮液浑浊有大量褐化培养产物（图2）。
3）胚性细胞悬浮培养筛选：将步骤2）获得的楸树初级悬浮培养产物过筛后接种于胚性细胞悬浮培养筛选培养液中培养，在转速110r/min，培养温度25℃±2，光照强度1000Lx，光照时间16h/d的条件下，培养9天，开始出现白色或浅黄色的球形胚聚合体（如图3），继代培养3次，培养总时间为36天，得到悬浮培养增殖产物，建立胚性细胞悬浮系，发现悬浮培养产物增殖速度较快、大小均一，且悬浮液较清澈，无褐化现象；所述胚性细胞悬浮培养筛选培养液为1/2MS添加了聚乙二醇6000，所述培养液中聚乙二醇6000质量浓度为10%。
4）植株再生
将步骤3）液体悬浮培养获得的胚性材料接种到添加0.8%（W/V）琼脂的1/2MS固体培养基中培养，胚性组织保持稳定（图4），后接种至添加0.7%（W/V）琼脂的1/2MS固体培养基诱导分化，胚性组织分化同步性高，体胚萌发时间较一致，且出苗整齐，形态上未观察到畸形（图5）。培养条件：温度25±2℃，光照时间14h／天，光照强度2000 Lx。
实施例2
MS基本培养基：可参照文献（Murashige T, Skoog F. A revised medium for rapid grouth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant, 1962, 15: 473-497）配制。
本发明所述楸树悬浮培养体系建立的方法，包含以下步骤：
1）外植体灭菌及楸树胚性愈伤组织的获得
外植体灭菌，取楸树未成熟的种子，依次经75%的酒精、2%次氯酸钠溶液灭菌后，剥取幼嫩种胚作为外植体；将所述的外植体置于一系列固体培养基中诱导，获得淡黄色胚性愈伤组织。
所述步骤1）楸树胚性愈伤组织获得方法包括：①愈伤组织的诱导：以经灭菌的楸树幼嫩种胚为外植体，将其置于愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织；诱导培养基是在1/2MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤(6-BA）和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)；②愈伤组织的增殖：将愈伤组织置于增殖培养基上增殖；培养基是在1/2MS基本培养基的基础上添加了浓度为1.0 mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)和浓度为0.05mg/L的α-萘乙酸（NAA）；③胚性愈伤组织的诱导：将增殖后的愈伤组织置于分化诱导培养基上诱导胚性愈伤组织，分化诱导培养基是在1/2MS基本培养基的基础上添加了浓度为0.9 mg/L 的6-苄基嘌呤(6-BA)和浓度为0.05 mg/L 的α-萘乙酸（NAA））
2）初级悬浮培养产物诱导
将步骤1）获得的胚性愈伤组织转接到初级培养液中进行培养，100ml三角瓶中培养液的量为40ml，培养转速100r/min，培养温度23℃，光照强度1000Lx，光照时间16h/d的条件下，振荡培养时间32天，每16天继代一次，继代培养时用60目、80目的尼龙网过筛处理，过筛后液体静置1h后弃上清液，补入等量新鲜培养基，并将筛上的细胞团接入新鲜液体培养基中继续培养。所述悬浮培养液：1/2MS。
3）胚性细胞悬浮培养筛选：将步骤2）获得的楸树初级悬浮培养产物过筛后接种于胚性细胞悬浮培养筛选培养液中培养，
胚性细胞悬浮体系的培养液是1/2MS培养基添加5%的PEG6000。
将所述初级悬浮培养增殖产物过筛后转接于胚性悬浮体系培养液中，在转速100r/min，温度25℃，光照强度1000Lx，光照时间14h/d条件下培养，继代培养周期16天，发现悬浮培养产物增殖速度较快、大小均一，且悬浮液较清澈，无褐化现象，从而建立胚性细胞悬浮系。
4）植株再生
将步骤3）液体悬浮培养获得的胚性材料接种到添加0.8%（W/V）琼脂的1/2MS固体培养基中培养，胚性组织保持稳定，后接种至添加0.7%（W/V）琼脂的1/2MS固体培养基诱导分化，胚性组织分化同步性高，体胚萌发时间较一致，且出苗整齐，形态上未观察到畸形。培养条件：温度25±2℃，光照时间14h／天，光照强度2000 Lx。
实施例3
MS基本培养基：可参照文献（Murashige T, Skoog F. A revised medium for rapid grouth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant, 1962, 15: 473-497）配制。
本发明所述楸树悬浮培养体系建立的方法，包含以下步骤：
1）外植体灭菌及楸树胚性愈伤组织的获得
外植体灭菌，取楸树未成熟的种子，依次经75%的酒精、2%次氯酸钠溶液灭菌后，剥取幼嫩种胚作为外植体；将所述的外植体置于一系列固体培养基中诱导，获得淡黄色胚性愈伤组织。
所述步骤1）楸树胚性愈伤组织获得方法包括：①愈伤组织的诱导：以经灭菌的楸树幼嫩种胚为外植体，将其置于愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织；诱导培养基是在1/2MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤(6-BA）和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)；②愈伤组织的增殖：将愈伤组织置于增殖培养基上增殖；培养基是在1/2MS基本培养基的基础上添加了浓度为0.8 mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)和浓度为0.06mg/L的α-萘乙酸（NAA）；③胚性愈伤组织的诱导：将增殖后的愈伤组织置于分化诱导培养基上诱导胚性愈伤组织，分化诱导培养基是在1/2MS基本培养基的基础上添加了浓度为0.07 mg/L 的6-苄基嘌呤(6-BA)和浓度为0-0.1 mg/L 的α-萘乙酸（NAA））
2）初级悬浮培养产物诱导
将步骤1）获得的胚性愈伤组织转接到初级培养液中进行培养，例如200ml三角瓶中培养液的量为80ml，培养转速90r/min，培养温度25±2℃，光照强度1000Lx，光照时间16h/d的条件下，振荡培养时间40天，每20天继代一次，继代培养时用60目、80目的细胞筛过筛处理，过筛后液体静置1h后弃上清液，补入等量新鲜培养基，并将筛上的细胞团接入新鲜液体培养基中继续培养。所述悬浮培养液含：1/2MS0。
3）胚性细胞悬浮培养筛选：将步骤2）获得的楸树初级悬浮培养产物过筛后接种于胚性细胞悬浮培养筛选培养液中培养，胚性细胞悬浮体系的培养液是1/2MS培养基添加20%的PEG6000。
将所述初级悬浮培养增殖产物过筛后转接于胚性悬浮体系培养液中，在转速100r/min，温度27℃，光照强度1000Lx，光照时间15h/d条件下培养，继代培养周期20天，发现悬浮培养产物增殖速度较快、大小均一，且悬浮液较清澈，无褐化现象，从而建立胚性细胞悬浮系。
4）植株再生
将步骤3）液体悬浮培养获得的胚性材料接种到添加0.8%（W/V）琼脂的1/2MS固体培养基中培养，胚性组织保持稳定，后接种至添加0.7%（W/V）琼脂的1/2MS固体培养基诱导分化，胚性组织分化同步性高，体胚萌发时间较一致，且出苗整齐，形态上未观察到畸形。培养条件：温度25±2℃，光照时间14h／天，光照强度2000 Lx。
实施例4
MS基本培养基：可参照文献（Murashige T, Skoog F. A revised medium for rapid grouth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant, 1962, 15: 473-497）配制。
本发明所述楸树悬浮培养体系建立的方法，包含以下步骤：
1）外植体灭菌及楸树胚性愈伤组织的获得
外植体灭菌，取楸树未成熟的种子，依次经75%的酒精、2%次氯酸钠溶液灭菌后，剥取幼嫩种胚作为外植体；将所述的外植体置于一系列固体培养基中诱导，获得淡黄色胚性愈伤组织。
所述步骤1）楸树胚性愈伤组织获得方法包括：①愈伤组织的诱导：以经灭菌的楸树幼嫩种胚为外植体，将其置于愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织；诱导培养基是在1/2MS基本培养基的基础上添加了6-苄基腺嘌呤(6-BA）和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)；②愈伤组织的增殖：将愈伤组织置于增殖培养基上增殖；培养基是在1/2MS基本培养基的基础上添加了浓度为1.5mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)和浓度为0.08mg/L的α-萘乙酸（NAA）；③胚性愈伤组织的诱导：将增殖后的愈伤组织置于分化诱导培养基上诱导胚性愈伤组织，分化诱导培养基是在1/2MS基本培养基的基础上添加了浓度为0.65 mg/L 的6-苄基嘌呤(6-BA)和浓度为0.01 mg/L 的α-萘乙酸（NAA））
2）初级悬浮培养产物诱导
将所述获得的楸树愈伤组织接种于悬浮培养液中进行震荡培养，例如150ml三角瓶中培养液的量为60ml，培养转速120r/min，培养温度24℃，光照强度1000Lx，光照时间14h/d的条件下，振荡培养时间36天，每18天继代一次，继代培养时用60目、80目的尼龙网过筛处理，过筛后液体静置1h后弃上清液，补入等量新鲜培养基，并将筛上的细胞团接入新鲜液体培养基中继续培养。所述悬浮培养液含：1/2MS。
培养的悬浮产物至体视显微镜下观察，可见大量游离透明的长条状细胞和球形细胞，少量以球形细胞为主聚集而成的细胞团，且细胞通明、内含物稀薄。
3）胚性细胞悬浮体系的建立
优选的胚性悬浮培养体系的培养液是1/2MS培养基添加15%的PEG6000。
将所述初级悬浮培养增殖产物过细胞筛后转接于悬浮体系培养液中，在转速110r/min，温度27℃，光照强度1000Lx，光照时间14h/d条件下培养，继代培养周期18天，发现悬浮培养产物增殖速度较快、大小均一，且悬浮液较清澈，无褐化现象，从而建立胚性细胞悬浮系。
4）植株再生
液体悬浮培养获得的胚性材料接种到添加0.8%（W/V）琼脂的1/2MS固体培养基中培养，胚性组织保持稳定，后接种至添加0.7%（W/V）琼脂的1/2MS固体培养基诱导分化，胚性组织分化同步性高，体胚萌发时间较一致，且出苗整齐，形态上未观察到畸形。培养条件：温度25±2℃，光照时间14h／天，光照强度2000 Lx。
这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明—楸树胚性细胞悬浮系的建立方法的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
上述的实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本申请中的实施例及实施例中的特征在不冲突的情况下，可以相互任意组合。本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围。即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。