本发明涉及重金属超富集蕨类植物孢子繁育方法，特别是凤尾蕨科凤尾蕨属的超富集植物大叶井口边草(Pteris cretica var.nervosa)的孢子繁育方法，是一种满足砷超富集植物大叶井口边草孢子的萌发、配子体的发育与新孢子体的形成、孢子体幼苗期管护的方法，具体是涉及一种砷超富集植物大叶井口边草的孢子繁殖方法。
背景技术：
水体和土壤重金属污染问题是困扰全球的环境问题之一，近年来，一些能够在地上部大量富集污染物的特殊植物———超富集植物(hyperaccumulator)已成为学术界研究的热点。利用超富集植物清除土壤和水体环境中的金属和类金属污染———植物修复(phytoremediation)技术以其潜在的高效、廉价及其环境友好性获得了广泛关注。通过种植收割这种植物可有效地清除环境中的砷污染。随着超富集植物广泛应用，野生资源集聚减少，其自然地繁育速度已无法满足对超富集植物的需求量，从而超富集植物中人工繁育方法的探索十分活跃。
能够大量富集砷的凤尾蕨属植物———蜈蚣草(pteris vittata L.)在砷污染修复工程中已大量应用。继蜈蚣草之后新发现的另一种对砷具有富集能力的凤尾蕨属植物就是大叶井口边草，其推广应用面积正逐年扩大，市场需求将越来越大。蕨类植物主要通过孢子进行繁育，其在自然条件下生长周期较长，成苗率低，难以满足实际的应用需求。虽然组织培养是一种可行的大叶井口边草快速繁殖技术，但其成本较高且操作复杂，如何快速经济而简便地大规模培育大叶井口边草种苗，来降低修复成本，仍然是砷污染修复工程推广应用中急需解决的难题。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供了一种可用于砷超富集植物大叶井口边草进行规模化人工繁育的方法。该方法能够保障大叶井口边草孢子的萌发，原叶体发育，新孢子体的形成和新孢子体苗期生长所需条件，并且便于规模化育苗操作。根据大叶井口边草孢子繁育对育苗基质的酸碱度、透气性、保水性及特殊营养物质的需求，设计了该繁殖方法。考虑到孢子体积小，难以播种的困难，设计了采用将孢子悬浮于液体中进行播种的方法，以便控制播种量及播种均匀度。为解决大叶井口边草孢子繁育中成苗率低的问题，设计了不同播种密度，不同种类、浓度的营养液及激素诱导，提高孢子的萌发率、原叶体增殖率及孢子体转化率，达到提高成苗率的效果。该方法操作简单，繁育的超富集植物种苗整齐健壮，可为土壤修复提供大批量的超富集植物种苗。
本发明提供的一种砷超富集植物大叶井口边草孢子繁育方法，具体包括以下步骤：
第一步，将符合砷超富集植物大叶井口边草孢子育苗要求的育苗基质配方，通过配比进行混合，形成大叶井口边草育苗基质；
第二步，将第一步所得的育苗基质加入适合大叶井口边草孢子育苗的育苗盆中，轻压，使育苗基质的疏松度符合大叶井口边草孢子育苗要求；
第三步，将大叶井口边草孢子收集、称量、浸泡后播种到装有育苗基质的育苗盆表面；
第四步，将播种好的育苗盆放置在育苗大棚中，浇透水；
第五步，将完成第四步操作的育苗盆覆盖薄膜、遮阳网保证孢子萌发的温度、湿度、光照条件；
第六步，定期观察，进行雾状喷水，保持孢子萌发的水分条件；
第七步，孢子萌发形成原叶体，生长期，喷洒营养液1，促进叶原体生长；
第八步，叶原体成熟期，喷洒营养液2，促进叶原体成熟，形成成熟雌雄生殖细胞，进而形成新的孢子体；
第九步，孢子体生长期，定期喷洒营养液3，使其茁壮成苗；
第十步，小苗长成后定期间苗、移栽。
本发明砷超富集植物大叶井口边草孢子繁育方法，与传统的育苗方法相比，更加符合大叶井口边草原叶体萌发和孢子体初期生长的需求，且操作简便，适合规模化育苗操作。本发明所配制的育苗基质含植物生长所需的的基本养分条件，酸碱度控制在pH5-7之间，育苗基质孔隙度在45％-55％之间。播种期，控制播种密度，在30-40mg/盆为宜，为缩短繁育期，提高成苗率，孢子播种前用清水浸泡24小时，在孢子繁育期喷洒不同营养液。整个育苗期间，湿度控制在80％以上，温度在15-30℃之间，进行75％密度遮阳网遮光暗培养。
本发明与现有技术相比，其显著优点：(1)缩短大叶井口边草孢子萌发及原叶体形成期，通过采用液体浸泡24小时后播种，缩短原叶体萌发时间；(2)提高大叶井口边草原叶体萌发率，通过采用原叶体生长期喷洒营养增殖液，促进原叶体的生长和增殖，达到提高原叶体萌发率；(3)提高大叶井口边草新孢子体的形成率，通过在原叶体成熟期喷洒营养液3，有效提高孢子体的形成的数量；(4)应用本发明培育大叶井口边草种苗，具有操作简便，育苗期短，成苗率高，种苗健壮的特点，为重金属污染土壤的修复工程提供了一种超富集植物的繁育方法，具有较好的应用前景和经济效益。
具体实施方式
下面通过实施实例对本发明做进一步的说明
实施例1
砷超富集植物大叶井口边草育苗基质制备，采用草炭土60％和珍珠岩40％的配比，混合拌匀，分装到10*10育苗盆中，再用多菌灵800倍液进行基质消毒；
实施例2
砷超富集植物大叶井口边草孢子粉播种，每年7-9月，当天到大叶井口边草母本园中，采集健壮成熟的孢子叶，收集孢子粉，同时将孢子粉称量好30-40mg/份，并将其用清水浸泡，待24小时后播种于备好的基质盆中。
实施例3
砷超富集植物大叶井口边草苗期管护，将播种好的育苗盆浇透水，放置于育苗大棚，盖上塑料薄膜，和75％遮阳网培养，定期揭膜透气，定期喷水保持湿度。培育期间棚内温度控制在15-30℃之间，定期育苗盆内湿度80％以上，保持相对暗光培养。
播种10-15d左右，发现明显的孢子萌发形成绿色的丝状体，30-35d左右形成大量的心形的原叶体，同时喷洒pH6，1/2MS+20g/l蔗糖+1g/lKH2PO4+0.2mg/lNAA增殖营养液50ml/盆；60-70d后，叶原体发育效果佳，叶原体铺满盆，颈卵器、精子器形成，原叶体基本成熟，同时喷洒50mg/lGA350ml/盆；80-90d左右，新孢子体形成，逐渐长成完整植株，之后每半个月喷洒1000倍叶面肥50ml/盆一次，直到成苗移栽；120d左右，小苗长至2-5cm，开始进行间苗移栽到穴盘，150d左右，小苗长至15-20cm可进行换袋培养。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于提供本领域技术人员了解本发明的内容并据以实施，并非具体实施方式的列举，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。