有限花序蓖麻的制作方法

文档序号:15204365发布日期:2018-08-21 07:00阅读:386来源:国知局
在其一些实施方案中,本发明涉及有限花序蓖麻(determinatecastor)、其产品及其生产方法。蓖麻(ricinuscommunisl.)是一种非食物作物,主要用作羟基化脂肪酸的天然来源。印度、中国和巴西在传统上是主要的种植者,而较发达国家是蓖麻籽油的主要消费者。在1960年代,蓖麻是在德克萨斯州高原有前景的作物,但在1972年,联邦农场项目的改变结束了在美国的生产。然而,有关含有可观水平的蓖麻油酸的蓖麻籽油生产的最新研究努力得以恢复。作为许多人类疾病潜在治疗剂的蓖麻毒蛋白的广泛应用也强化了这种重新对蓖麻籽油的关注。按照其生长的不同气候带,热带或温带,蓖麻一般被视为一年生作物草本植物、灌木或乔木。蓖麻中,在腋中发出新的嫩枝和枝条。为了使蓖麻在现代农业环境下栽培,需要选择适于联合收割的新的基因型。采用系谱方法选出具有低分枝趋势的蓖麻基因型,综述见baldanziandpugliesi1998plantbreeding117:392-394。然而这些栽培种连续几轮的自花授粉降低植物活力。据报告,因基因型与环境的高水平相互作用所致,通常难以选出矮的不分枝蓖麻植物(参见severinoetal.2012agronomyj.104(4):853-880)。有花植物显示两种类型的花序结构之一:无限的,其中花序无限地生长,或有限的,其中产生顶生花。开花途径的两种重要基因是成花基因座t(floweringlocust,ft)和顶生花1(terminalflower1,tfl1)。ft和tfl1编码在不同的信号转导途径中起作用的一对成花调节因子。ft和tfl1共有高水平的同源性(在氨基酸水平上超出60%),但以相反方式起作用。ft促进向生殖发育和开花转变,而tfl1抑制该转变。因此,tfl-1功能的丧失与有限花序表型和提早开花有关。迄今为止,在不同的植物科中成功地实现了tfl1的转基因沉默以获得有限花序表型和/或提早开花表型(综述见dicklandandhanzawa2015molecularplant1-15))。然而,在来自大戟科(euphorbiaceae)的工业植物(包括著名的植物例如麻风树属(jatropha))中,近来发现tfl-1是开花促进因子而不是抑制因子。美国专利公开号20150033414教导了通过jctfl1l-1蛋白的促花活性的转基因表达促进麻风树属和相关植物(例如蓖麻)的开花时间的方法。发明概述按照本发明一些实施方案的一个方面,提供非基因修饰的有限花序蓖麻植物(determinatecastorplant)。按照本发明的一些实施方案,该植物包含tfl1基因座的功能缺失遗传变化。按照本发明的一些实施方案,该植物包含在选自表5所列遗传基因座的遗传基因座中赋予有限花序表型的功能缺失遗传变化。按照本发明的一些实施方案,遗传变化包括缺失。按照本发明的一些实施方案,缺失位于支架(scaffold)30055(seqidno:1)。按照本发明的一些实施方案,缺失的两侧是引物l3-f(seqidno:10)和r6-r(seqidno:57)。按照本发明的一些实施方案,所述缺失缺乏选自上表2中的snp的snp标记。按照本发明的一些实施方案,缺失的断裂点由seqidno:2界定。按照本发明的一些实施方案,该植物呈现稳定活力至少5代。按照本发明的一些实施方案,该植物在seqidno:1的第371820位具有呈纯合子形式的g核苷酸。按照本发明一些实施方案的一个方面,提供经基因修饰以减量调节tfl1(seqidno:3或4)的活性或表达的有限花序蓖麻植物。按照本发明一些实施方案的一个方面,提供经基因修饰以减量调节选自seqidno:67-90的基因或其选自seqidno:126、119、120、121、123、127、128、124、129、125、122和130的多肽表达产物的活性或表达的有限花序蓖麻植物。按照本发明的一些实施方案,有限花序蓖麻植物包含经设计减量调节tfl1或由seqidno:67-90编码的基因的表达的rna沉默剂。按照本发明的一些实施方案,有限花序蓖麻植物包含减量调节tfl1的活性或表达的dna核酸酶。按照本发明的一些实施方案,有限花序蓖麻植物是近交系。按照本发明一些实施方案的一个方面,提供蓖麻植物的一部分。按照本发明的一些实施方案,蓖麻植物的部分是种子。按照本发明一些实施方案的一个方面,提供蓖麻植物的杂交种子。按照本发明一些实施方案的一个方面,提供通过种植杂交种子获得的杂交植物。按照本发明一些实施方案的一个方面,提供杂交植物的植物部分。按照本发明一些实施方案的一个方面,提供选择有限花序蓖麻植物的方法,所述方法包括检测蓖麻植物的基因组中两侧是l3-f(seqidno:10)和r6-r(seqidno:57)的染色体区的功能缺失遗传变化或与所述缺失处于连锁不平衡的seqidno:1的第371820位的g核苷酸,其中染色体区中功能缺失遗传变化的存在表示有限花序蓖麻植物。按照本发明的一些实施方案,功能缺失遗传变化包括缺失。按照本发明的一些实施方案,赋予有限花序表型的功能缺失遗传变化是选自表5所列的遗传基因座的遗传基因座。按照本发明的一些实施方案,缺失的断裂点由seqidno:2界定。按照本发明的一些实施方案,检测通过分析选自seqidno:1的这些snp位置101086、110318、123602、129239、146591的snp来进行。按照本发明一些实施方案的一个方面,提供产生有限花序蓖麻植物的方法,所述方法包括:(a)使包含两侧是l3-f(seqidno:10)和r6-r(seqidno:57)的染色体区的基因座位中的功能缺失遗传变化的蓖麻植物杂交或自交,该功能缺失遗传变化呈杂合形式,以便获得f1种子;(b)种植一定量的f1种子生长成为f1植物;(c)通过杂交或自交产生f1植物的后代植物;(d)从后代植物中选出包含呈纯合形式的功能缺失遗传变化的植物,该植物为有限花序蓖麻植物。按照本发明的一些实施方案,选择通过分析选自101086-146591的至少一种标记的植物基因组的存在来进行。按照本发明一些实施方案的一个方面,提供有限花序蓖麻植物,其代表性种子已根据布达佩斯条约于2015年11月2日在ncimbltd.以ncimb42477(vs011)、ncimb42478(vs018)、ncimb42479(vs025)、ncimb42480(vs030)或ncimb42481(vs033)保藏。所有保藏物为下表6中的f1杂种。按照本发明一些实施方案的一个方面,提供自该植物生产的油。按照本发明一些实施方案的一个方面,提供生产油的方法,所述方法包括:(a)提供蓖麻植物的种子;(b)从种子中提取油。按照本发明一些实施方案的一个方面,提供蓖麻植物块。按照本发明一些实施方案的一个方面,提供生产块的方法,所述方法包括:(a)提供蓖麻植物的种子;(b)压碎种子以便获得压碎的种子,和(c)从压碎的种子中取出油,从而产生块。按照本发明一些实施方案的一个方面,提供蓖麻粉。按照本发明一些实施方案的一个方面,提供植物的加工产品,其中产品包含植物的dna。除非另有定义,否则本文所用的所有技术和/或科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。虽然类似或等同于本文所述那些的方法和材料可用于本发明实施方案的实践或测试,但下面描述了示例性的方法和/或材料。在冲突的情况下,以本专利说明书(包括定义)为准。另外,材料、方法和实例只是说明性的,并非旨在必定限制性的。若干附图的简要描述仅通过举例的方式,参考附图,在此描述了本发明的某些实施方案。现在具体详细地参考附图,要强调的是所示细节是通过举例的方式,并用于本发明实施方案的说明性论述的目的。就此来说,说明书与附图一起,使得可如何实践本发明的实施方案对于本领域技术人员来说是显而易见的。在附图中:图1是支架30055的核苷酸1-160,000的图示(蓖麻tigr/jcviv0.1形式)。该图形描述了自gbs数据集推出的缺失区、用于实际缺失断裂点(下表4中所列)实际作图的引物和最终作图的缺失区。目标区内注释的基因用绿色矩形描绘(下表5中所列)。图2显示在通过pcr扩增子绘制缺失区的同时获得的显微照片。跨越核苷酸58259至101086的区域以绘制缺失的左断裂点的20个约200bppcr扩增子,跨越核苷酸146591至153778的8个约200bppcr扩增子。红色箭头标示其中pcr产物在有限花序和无限花序样品两者中是明显的反应与其中产物只在无限花序蓖麻样品中是明显的反应之间的变化,使断裂点缩小至这些扩增子(l3-l4,r5-r6)间的区域(非-det:无限花序植物;det:有限花序植物)。图3a显示缺失断裂点的准确作图。显示了通过对使用引物l3-f和r6-r制备的pcr产物进行sanger测序分析的缺失断裂点侧接区序列。图3b显示使用标准设置www.blast(dot)ncbi(dot)nlm(dot)nih(dot)gov/blast(dot)cgi)在bl2seq中进行的使用图3a所述序列作为查询和支架30055(seqidno:1)作为主题序列的blast结果。图4是显示使用侧接缺失区的引物l3f和r6r(分别为seqidno:10和57)扩增的381bppcr产物的显微照片。pcr产物只在有限花序样品中可见。图5是显示4个基因的mrna表达水平的图。通过不包括存在于有限花序蓖麻植物表型中的缺失的无限花序蓖麻植物(g-10)中的倍数改变显示的开花前mrna表达水平相对于2叶表达。图6a-b是显示不包括存在于有限花序蓖麻植物表型中的缺失的无限花序蓖麻植物(g-10)中2、4、6和8叶和开花前差异tfl1mrna表达水平的图。结果表明与不同植物发育阶段相比mrna表达的变化。主要的mrna表达水平作用发生在开花前期,此时tfl1mrna表达显著减量调节。本发明具体实施方案的描述本发明在其一些实施方案中涉及有限花序蓖麻、其产品及其生产方法。在详细解释本发明的至少一个实施方案前,要了解本发明不一定将其应用限于以下描述列出或实施例举例说明的细节。本发明能够有其它实施方案或能够按不同方式实施或进行。ricinuscommunis,蓖麻植物,是大戟科(euphorbiaceae)有花植物的一个物种。它是单型属ricinus和亚族ricininae的唯一物种。蓖麻籽是蓖麻油的来源,蓖麻油具有多种用途。种子含有介于40%和60%间的富含甘油三酯(主要为甘油三蓖麻油酸酯)的油。种子还含有蓖麻毒蛋白,一种可溶于水的毒素,其还可以较低浓度存在于整个植物中。蓖麻油具有许多工业用途(例如生物聚合物、生物柴油)以及软膏和医学中的应用。为了使蓖麻在现代农业环境下栽培,需要选择适于联合收割的新的基因型。因此,在简化本发明的实施方案付诸实施的同时,本发明人通过费力筛选鉴定出具有有限花序表型的蓖麻植物。该表型与涉及90kb缺失的功能缺失基因型有关。引人关注的是,缺失包括多个可读框,其中一个是tfl1基因座的可读框。然而,tfl-1的突变一般与有限花序表型和提早开花有关,在大戟科的植物中,包括主要的植物例如麻风树属和蓖麻,已提出tfl-1作为开花促进因子而不是抑制因子(参见美国专利公开号20150033414)。本研究结果首次报道了显示稳定活力持续很多代(例如超过7代)的有限花序蓖麻,因此可能是开发用于最佳联合收割和大小适于均匀和密集种植的蓖麻品系和蓖麻杂种的重要育种材料。本文所用短语“蓖麻植物”亦称“蓖麻油植物”和“蓖麻(ricinuscommunis)”是指大戟科的植物物种。本文使用的术语“植物”包括整株植物、植物的祖代和后代和植物部分,包括种子、果实、苗、茎、根(包括块茎)和植物细胞、组织和器官。植物可以是任何形式,包括愈伤组织、悬浮培养物、胚、分生组织区、叶、配子体、孢子体、花粉、胚珠和小孢子。术语“栽培种”在本文用来指具有非“野生”状态的生物学状态的植物,所述“野生”状态表示植物或增加种(accession)的原始非培育的或天然状态。术语“栽培种”(用于栽培品种)包括但不限于半自然的、半野生的、杂草的、传统栽培种、地方品种、育种材料、研究材料、育种者品系(breeder'sline)、合成种群、杂种、建立者原种(founderstock)/基础种群、近交系(杂交栽培种的亲本)、隔离种群(segregatingpopulation),突变体/遗传原种(geneticstock)和改进的/改良的栽培种。可与本发明教导一起使用的遗传背景的实例包括brightpink、gibsoni、zanziariensis、brightred和impala。按照一个具体的实施方案,蓖麻植物是植物品系(近交)。按照一个具体的实施方案,蓖麻植物是优良品系。按照一个具体的实施方案,蓖麻植物是杂种。本发明的一些实施方案的蓖麻植物是指整株植物或其部分、加工或未加工的(例如种子、油、干组织、粗粉、块等)、可再生的组织培养物或从中分离的细胞。植物部分可包含dna(例如种子)或可缺乏dna(例如油)。本文所用术语“有限花序的”是指有限花序。当主茎和主枝末端是没有叶芽的花或花序时,植物的花序被视为顶生的或有限的。本发明实施方案的有限花序蓖麻中,植物的营养部分低于植物的生殖部分。按照一个具体的实施方案,无腋肢,也无次生枝长出。因此,与相同遗传背景和发育阶段的无限花序植物相比,有限花序表型阻止植物长枝因此导致整体较少的分枝表型。因此,按照本发明的一个方面,提供非基因修饰的有限花序蓖麻植物。本文所用短语“非基因修饰的”是指非转基因植物或没有赋予有限花序习性的转基因的植物。按照一个具体的实施方案,本发明的非基因修饰的有限花序蓖麻植物产生于通过多次杂交/自交引起的自发遗传事件(参见随附的实施例章节中的实施例1)。备选或此外,通过将植物或其部分暴露于化学诱变剂中可提高造成有限花序习性的原因的遗传事件的发生。化学诱变剂的实例包括但不限于亚硝酸、烷化剂例如甲磺酸乙酯(ems)、甲磺酸甲酯(mms)、硫酸二乙酯(des)和碱基类似物例如5-溴-脱氧尿苷(5bu)。本发明人能够使功能缺失遗传变化与有限花序习性关联。本文所用“功能缺失遗传变化”或“功能缺失突变”是指基因序列的改变(例如突变),这引起基因产物(通常为蛋白质)的功能降低或完全缺乏。功能缺失遗传变化可由完整染色体或其部分的插入或缺失引起。例如,通过因为移码或无义突变的基因产物的截短或通过单个或多个氨基酸的改变,可引起功能缺失突变。与具有功能缺失突变的等位基因有关的表型通常是隐性的,但也可以是显性的。按照一个具体的实施方案,缺失位于30055支架(seqidno:1)的核酸坐标60520-152129。按照一个具体的实施方案,缺失的断裂点由图3a所示序列界定(具体参见侧接缺失的突出显示的ac)。按照一个具体的实施方案,缺失位于特征在于下表2的任何或所有snp(60520-152129)的30055支架(seqidno:1)。按照一个具体的实施方案,缺失内的snp位置是101086、110318、123602、129239、146591。按照一个具体的实施方案,对于缺失,snp371820(参见表3,seqidno:1)是多态性的提供信息的snp,因为在有限花序样品中,当呈纯合形式时核苷酸为g,而在支架(无限花序)中时,这个位置的核苷酸为c或呈杂合形式的c和g。按照一个具体的实施方案,缺失的两侧是引物l3-f(seqidno:10)或r6-r(seqidno:57)。按照一个具体的实施方案,381bp的扩增子(参见图4)在有限花序蓖麻中是明显的,而在无限花序植物中在相同分辨率下没有产物是明显的。用于检测缺失的其它引物是位于以下的引物:相当于30055坐标的det_del_2_f:60479(seqidno:64);det_del_2_r:152212(seqidno:65);nd_f:152101(seqidno:66)。按照一个具体的实施方案,赋予有限花序习性的功能缺失遗传变化处于选自以下的遗传基因座:30055.t000008(基因和转录物,分别为seqidno:67和79)、30055.t000009(基因和转录物,分别为seqidno:68和80)、30055.t000010(基因和转录物,分别为seqidno:69和81)、30055.t000011(基因和转录物,分别为seqidno:70和82)、30055.t000012(基因和转录物,分别为seqidno:71和83)、30055.t000013(基因和转录物,分别为seqidno:72和84)、30055.t000014(基因和转录物,分别为seqidno:73和85)、30055.t000015(基因和转录物,分别为seqidno:74和86)、30055.t000016(基因和转录物,分别为seqidno:75和87)、30055.t000017(基因和转录物,分别为seqidno:76和88)、30055.t000018(基因和转录物,分别为seqidno:77和89)和30055.t000019(基因和转录物,分别为seqidno:78和90)。按照另一个具体的实施方案,遗传变化处于seqidno:1的核酸坐标60520-152129的基因间区内。按照一个具体的实施方案,功能缺失遗传变化处于tfl1基因座(seqidno:1的支架30055的tfl1坐标113916-114125参见下表5的粗体字:30055.t000014)。本文所用术语“tfl1”是指蓖麻的拟南芥(arabidopsis)terminalflower1同源物。因为本文预期功能缺失遗传变化和或转基因沉默,所以本文预期内源蓖麻变体是用于靶定的对象。按照一个具体的实施方案,有限花序蓖麻植物包含tfl1基因座的两个等位基因的功能缺失遗传变化。本文所用术语“等位基因”是指一个基因座的任一个或多个备选形式,所述等位基因的全部与性状或特性有关。在二倍体细胞或生物中,指定基因的两个等位基因占据一对同源染色体中相应的基因座。本文所用术语“基因”是指决定生物(即甜瓜植物)的生物学特性的遗传因子,“等位基因”是存在于(二倍体)甜瓜植物的基因对中的各个基因。当植物含有基因的相同的等位基因时,植物被称为对于所述基因是“纯合的”,而当植物含有所述基因的两个不同的等位基因时,被称为对于所述基因是“杂合的”。使用大写字母表示显性基因(基因的显性形式),使用小字字母表示隐性基因:“x,x”因此表示基因或性质x的纯合子显性基因型;“x,x”和“x,x”表示杂合子基因型;和“x,x”表示纯合子隐性基因型。如通常所知,只有纯合子隐性基因型一般可提供相应的隐性表型(即导致显示性质或性状“x”的植物),而杂合子和纯合子显性的基因型一般可提供相应的显性表型(即导致显示性质或性状“x”的植物),除非其它基因和/或因子例如多个等位基因、抑制子、共显性等(也)在决定表型时起作用。如所述,本发明的蓖麻植物的杂种对于有限花序性状可以是杂合的(即,如上所述等位基因中只有一个具有有限花序性赋予基因座中的功能缺失突变),但在这种情况下,因为固有性状是隐性的,将不会有表观的有限花序表型。应认识到,可对本发明的有限花序蓖麻植物或其杂种进行基因修饰以表达赋予农业有利性状(例如生物胁迫耐受、非生物胁迫耐受、昆虫/线虫抗性等)的基因表达产物(例如rna或蛋白质)。按照本发明的另一个方面,提供经基因修饰的有限花序蓖麻植物以减量调节tfl1(seqidno:3和4,分别相当于tfl1的基因组和转录物)的活性或表达。因此,本发明的有限花序蓖麻植物还可采用其它方法产生,包括但不限于(a)tfl1(seqidno:4)基因座的缺失和备选或此外包含在缺失中的其它基因例如seqidno:80、81、82、83、86、88和/或89(或可由其编码的多肽序列例如seqidno:126、119、120、121、123、127、128、124、129、125、122或130)的缺失,详情见上文;(b)tfl1基因和任选包含在缺失中的其它基因的转录失活,详情见上文;(c)反义rna介导的tfl1基因和任选包含在缺失中的其它基因的转录物失活,详情见上文;(d)tfl1基因和任选包含在缺失中的其它基因的转录物的翻译失活,详情见上文;和(e)tfl1基因和备选或此外包含在缺失中的其它基因的基因组编辑,详情见上文。下面是用于实现植物中的敲入、敲除和转录沉默的平台技术的描述。将核酸改变引入目标基因的方法是本领域众所周知的[参见例如menked.genesis(2013)51:-618;capecchi,science(1989)244:1288-1292;santiagoetal.procnatlacadsciusa(2008)105:5809-5814;国际专利申请号wo2014085593、wo2009071334和wo2011146121;us专利号8771945、8586526、6774279和up专利申请号20030232410、20050026157、us20060014264;其内容通过引用以其整体予以结合],包括定向同源重组、位点特异性重组酶、pb转座酶和由工程核酸酶引起的基因组编辑。用于将核酸改变引入目标基因的试剂可设计成公共可获得资源或商购获自transposagen、addgene和sangamobiosciences。下面是用于将核酸改变引入目标基因的各种示例性方法和可按照本发明的具体实施方案使用的用于执行所述方法的试剂的描述。使用工程内切核酸酶的基因组编辑—该方法是指使用在基因组的所需位置处切割并产生特定双链断裂的人工工程核酸酶的反求遗传学方法,所述双链断裂然后通过细胞内源过程例如同源指导修复(hdr)和非同源末端连接(nhej)得到修复。nhej直接连接双链断裂中的dna末端,而hdr利用同源序列作为模板用于在断裂点再生缺失的dna序列。为了将特定的核苷酸修饰引入基因组dna,含有所需序列的dna修复模板在hdr期间必须存在。基因组编辑不能使用传统的限制性内切核酸酶进行,因为大多数限制性内切酶识别dna中的少数碱基对作为其靶标,且所识别的碱基对组合将存在于基因组中的许多位置,导致多个切割不限于所需位置的概率非常高。为了克服该挑战并产生位点特异性单链或双链断裂,迄今发现了若干不同类别的核酸酶并经生物工程改造。这些包括大范围核酸酶、锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应物核酸酶(talen)和crispr/cas系统。大范围核酸酶—大范围核酸酶通常被分成4个家族:laglidadg家族、giy-yig家族、his-cys框家族和hnh家族。这些家族的特征在于影响催化活性和识别序列的结构基序。例如,laglidadg家族的成员的特征在于具有一个或两个拷贝的保守的laglidadg基序。就保守的结构元件和因此dna识别序列特异性和催化活性而论,将大范围核酸酶的4个家族彼此大大区分开来。大范围核酸酶通常存在于微生物物种中,具有有极长的识别序列(>14bp)的独特性质,因此使其当然非常特异性地在所需位置切割。这可被用于在基因组编辑中产生位点特异性双链断裂。本领域技术人员可以使用这些天然存在的大范围核酸酶,然而这类天然存在的大范围核酸酶的数目是有限的。为了克服该挑战,采用诱变和高通量筛选方法以产生识别独特序列的大范围核酸酶变体。例如,不同的大范围核酸酶经融合以产生识别新序列的杂交酶。或者,可改变大范围核酸酶的dna相互作用氨基酸以设计序列特异性大范围核酸酶(参见例如美国专利8,021,867)。可采用描述于例如certo,mtetal.naturemethods(2012)9:073-975;美国专利号8,304,222;8,021,867、8,119,381、8,124,369、8,129,134、8,133,697、8,143,015、8,143,016、8,148,098或8,163,514(其内容通过引用以其整体结合到本文中)的方法,设计大范围核酸酶。或者,可采用商购可获得的技术例如precisionbiosciences'directednucleaseeditor™基因组编辑技术,获得具有位点特异性切割性质的大范围核酸酶。zfn和talen—工程核酸酶的两个不同类别锌指核酸酶(zfn)和转录激活因子样效应物核酸酶(talen),已被证实在产生定向双链断裂时是有效的(christianetal.,2010;kimetal.,1996;lietal.,2011;mahfouzetal.,2011;milleretal.,2010)。基本上,zfn和talen限制性内切核酸酶技术利用与特异性dna结合结构域(分别为一系列锌指结构域或tale重复序列)连接的非特异性dna切割酶。通常,选择其dna识别位点和切割位点彼此间隔开的限制性内切酶。切割部分被分开,然后与dna结合结构域连接,从而得到对所需序列有极高特异性的内切核酸酶。具有这种性质的示例性的限制性内切酶是fokl。此外fokl具有需要二聚化以具有核酸酶活性的优势,这就意味着特异性大幅提高,因为每个核酸酶配偶体识别独特的dna序列。为了增强这种效果,fokl核酸酶已经工程改造,使得仅作为异二聚体起作用且催化活性增加。异二聚体功能化核酸酶避免不需要的同二聚体活性的可能性,因此增加双链断裂的特异性。因此,例如为了靶向特定位点,构建zfn和talen作为核酸酶对,该对的每个成员被设计成在靶定位点结合相邻序列。在细胞中瞬时表达时,核酸酶与其靶位点结合,且foki结构域异二聚化以产生双链断裂。这些双链断裂通过非同源末端连接(nhej)途径的修复最通常导致小的缺失或小的序列插入。由于通过nhej进行的各个修复是独特的,因此使用单个核酸酶对可在靶位点产生具有多种不同缺失的等位系列。缺失的范围通常为约几个碱基对到几百个碱基对的任何长度,但通过同时使用两对核酸酶,已成功地在细胞培养中产生较大的缺失(carlsonetal.,2012;leeetal.,2010)。另外,当联合核酸酶对引入与靶定区具有同源性的dna片段时,通过同源指导修复,可修复双链断裂以产生特异性修饰(lietal.,2011;milleretal.,2010;urnovetal.,2005)。虽然zfn和talen两者的核酸酶部分具有相似的性质,但是这些工程核酸酶间的差异在于其dna识别肽。zfn依赖cys2-his2锌指,而talen依赖tale。这两个dna识别肽结构域具有它们天然组合存在于其蛋白质中的性质。cys2-his2锌指通常存在于相隔3bp的重复序列中,并以不同的组合存在于多种核酸相互作用蛋白质中。另一方面tale存在于氨基酸和所识别的核苷酸对之间识别率为1:1的重复序列中。因为锌指和tale两者恰好呈重复的形式,所以不同的组合会试图产生多种多样的序列特异性。用于产生位点特异性锌指内切核酸酶的方法包括例如模块式装配(modularassembly)(其中与三联体序列相关的锌指成行连接以覆盖所需序列)、open(肽结构域的低严格性选择相对于三联体核苷酸接着肽组合的高严格性选择相对于细菌系统中的最终靶标)和锌指文库的细菌单杂交筛选等。zfn也可经设计和商购获自例如sangamobiosciences™(richmond,ca)。用于设计和获得talen的方法描述于例如reyonetal.naturebiotechnology2012may;30(5):460-5;milleretal.natbiotechnol.(2011)29:143-148;cermaketal.nucleicacidsresearch(2011)39(12):e82和zhangetal.naturebiotechnology(2011)29(2):149-53。mayoclinic引进了名为mojohand的最新开发的基于web的程序,用于设计基因组编辑应用的tal和talen构建体(可通过www(dot)talendesign(dot)org访问)。talen还可经设计和商购获自例如sangamobiosciences™(richmond,ca)。能够减量调节tfl1和/或所述基因座的任何其它基因的另一种试剂是rna引导内切核酸酶技术,例如crispr系统。本文所用术语“crispr系统”亦称为成簇规律间隔短回文重复(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats),总的来说是指参与crispr相关基因的表达或指导其活性的转录物和其它元件,包括编码cas9基因(例如crispr相关内切核酸酶9)的序列、tracr(反式激活crispr)序列(例如tracrrna或活性部分tracrrna)、tracr-配偶序列(包括“同向重复(directrepeat)”和tracrrna加工的部分同向重复)或指导序列(亦称为“间隔区”)包括但不限于crrna序列(即赋予靶标特异性然而需要tracrrna与cas结合的内源细菌rna)或sgrna序列(即单指导rna)。在一些实施方案中,crispr系统的一个或多个元件来源于i型、ii型或iii型crispr系统。在一些实施方案中,crispr系统的一个或多个元件(例如cas)来源于包含内源crispr系统的特定生物,例如酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)、脑膜炎奈瑟球菌(neisseriameningitides)、嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)或齿垢密螺旋体(treponemadenticola)。一般来说,crispr系统的特征在于在靶序列(在内源crispr系统的情况下亦称为前间区)位点上促进crispr复合体形成的元件。在crispr复合体形成的情况下,“靶序列”是指指导序列(即指导rna,例如sgrna或crrna)被设计成与之具有互补性的序列,其中靶序列和指导序列间的杂交促进crispr复合体的形成。完全互补性不一定是必需的,条件是有足够的互补性引起杂交和促进crispr复合体形成。因此,按照一些实施方案,与靶序列的整体同源性可为50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%。靶序列可包含任何多核苷酸,例如dna或rna多核苷酸。在一些实施方案中,靶序列位于细胞的核或胞质中。因此,crispr系统包含两种不同的组分,与靶序列杂交的指导rna(grna)和核酸酶(例如ii型cas9蛋白),其中grna靶向靶序列,核酸酶(例如cas9蛋白)切割靶序列。指导rna可包含内源细菌crrna和tracrrna的组合,即grna使crrna的靶向特异性与tracrrna的支架性质(cas9结合所需要的)联合。或者,指导rna可以是能够直接结合cas的单指导rna。通常,在内源crispr系统的情况下,crispr复合体(包含与靶序列杂交并与一个或多个cas蛋白形成复合物的指导序列)的形成导致靶序列中或附近(例如距靶序列1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50个或更多个碱基对以内)的一条或两条链的切割。虽不希望受理论束缚,但tracr序列(其可包含野生型tracr序列的全部或部分(例如野生型tracr序列的约或超过约20、26、32、45、48、54、63、67、85个或更多个核苷酸)或由其组成),例如还可通过沿tracr序列的至少一部分与指导序列有效连接的tracr配偶序列的全部或部分杂交,形成crispr复合体的部分。在一些实施方案中,tracr序列与tracr配偶序列具有足够的互补性以杂交并参与crispr复合体形成。如同靶序列一样,不需要完全互补性,只要其足以是功能性的。在一些实施方案中,在最佳比对时,tracr序列沿tracr配偶序列的长度具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的序列互补性。将crispr/cas导入细胞可使用驱动crispr系统的一个或多个元件表达的一个或多个载体实现,使得crispr系统元件的表达在一个或多个靶位点指导crispr复合体的形成。例如,cas酶、与tracr-配偶序列连接的指导序列和tracr序列各自可在分开的载体上与分开的调节元件有效连接。或者,自相同或不同调节元件表达的两个或更多个元件可在单个载体与一个或多个其它载体(提供不包括在第一载体中的crispr系统的任何组分)组合。在单个载体中组合的crispr系统元件可以任何合适的方向排列,例如一个元件位于相对于第二元件的5'(“上游”)或3'(“下游”)。一个元件的编码序列可位于第二元件的编码序列的相同或相对链上并以相同或相反方向取向。单个启动子可驱动编码crispr酶的转录物和嵌入一个或多个内含子序列(例如不同内含子的每一个、至少一个内含子中的两个或更多个或单个内含子中的全部)的指导序列、tracr配偶序列(任选与指导序列有效连接)和tracr序列的一个或多个的表达。“击中逃离(hitandrun)”或“入-出(in-out)”—包括两步重组程序。第一步中,使用含有阳性/阴性双重选择标记盒的插入型载体引入所需序列变化。插入载体含有与靶定基因座同源的单个连续区并经修饰以携带目标突变。将这种靶向构建体用限制性内切酶在同源区内的一个位点线性化,转化至细胞中,进行阳性选择以分离同源重组体。这些同源重组体含有间插载体序列(包括选择盒)分隔开的局部重复。在第二步中,对靶定克隆进行阴性选择以鉴定通过重复序列间的染色体内重组失去选择盒的细胞。局部重组事件除去重复,并根据重组位点,等位基因保留引入的突变或恢复到野生型。最终结果是引入所需修饰而不保留任何外源序列。“双重置换”或“标签和交换”策略—包括与击中逃离方法类似,但需要使用两种不同的靶向构建体的两步选择程序。第一步中,使用具有3′和5′同源臂的标准靶向载体在其中将引入突变的位置附近插入阳性/阴性双重选择盒。在转化和阳性选择后,鉴定同源靶定克隆。接下来,将含有与所需突变同源的区域的第二靶向载体转化至靶定克隆,应用阴性选择除去选择盒并引入突变。最终的等位基因含有所需突变同时排除不需要的外源序列。位点特异性重组酶—来源于p1噬菌体的cre重组酶和来源于酵母酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)的flp重组酶是位点特异性dna重组酶,各自识别独特的34碱基对dna序列(分别称为“lox”和“frt”),且被lox位点或frt位点侧接的序列在cre或flp重组酶表达时,可通过位点特异性重组分别容易地除去。例如,lox序列由两侧是13个碱基对反向重复序列的不对称的8个碱基对间隔区组成。通过与13个碱基对反向重复序列结合并催化链切割和间隔区内的再连接,cre使34碱基对loxdna序列重组。间隔区中由cre产生的交错dna切口被6个碱基对分隔开,得到起同源传感器作用的重叠区以确保仅具有相同重叠区的重组位点进行重组。基本上,位点特异性重组酶系统提供在同源重组之后除去选择盒的手段。该系统还允许产生可以时间或组织特异性方式失活或激活的条件改变的等位基因。值得注意的是,cre和flp重组酶留下34个碱基对的lox或frt“痕(scar)”。保留的lox或frt位点通常留在修饰基因座的内含子或3′utr中,现有的证据表明这些位点通常不显著干扰基因功能。因此,cre/lox和flp/frt重组包括引入带有含有目标突变、两个lox或frt序列和通常置于两个lox或frt序列之间的选择盒的3′和5′同源臂的靶向载体。应用阳性选择,鉴定含有靶定突变的同源重组体。cre或flp的瞬时表达结合阴性选择导致选择盒切离,并选出其中失去盒的细胞。最终的靶定等位基因含有外源序列的lox或frt痕。转录物(rna)水平上的沉默可采用下列示例性平台实现。本文所用短语“rna沉默”是指由rna分子介导的一组调节机制[例如rna干扰(rnai)、转录基因沉默(tgs)、转录后基因沉默(ptgs)、压抑、共抑制和翻译阻遏],其导致相应蛋白质编码基因表达的抑制或“沉默”。在许多类型的生物中,包括植物、动物和真菌,观察到rna沉默。本文所用术语“rna沉默剂”是指能够特异性抑制或“沉默”靶基因(例如tfl1和/或seqidno:67-90)的表达的rna。在某些实施方案中,rna沉默剂能够通过转录后沉默机制防止mrna分子的完整加工(例如完全翻译和/或表达)。rna沉默剂包括非编码rna分子,例如包含配对链的rna双链体以及这类小的非编码rna可从中产生的前体rna。示例性rna沉默剂包括dsrna,例如sirna、mirna和shrna。在一个实施方案中,rna沉默剂能够诱导rna干扰。在另一个实施方案中,rna沉默剂能够介导翻译阻遏。按照本发明的一个实施方案,rna沉默剂对靶rna(例如tfl1和/或seqidno:79-90)是特异性的,不交叉抑制或沉默显示与靶基因有99%或更低的整体同源性,例如与靶基因有小于98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%整体同源性的其它靶标或剪接变体;如通过pcr、蛋白质印迹、免疫组织化学和/或流式细胞术测定的。rna干扰是指动物中由短干扰rna(sirna)介导的序列特异性转录后基因沉默的过程。下面是可按照本发明的具体实施方案使用的rna沉默剂的详细描述。dsrna、sirna和shrna—细胞中长dsrna的存在刺激称为切酶(dicer)的核糖核酸酶iii酶的活性。切酶参与dsrna加工成dsrna的短片段,称为短干扰rna(sirna)。来源于切酶活性的短干扰rna通常长约21-约23个核苷酸,并包含约19个碱基对双链体。rnai反应的特征还在于内切核酸酶复合物,通常称为rna诱导沉默复合物(risc),其介导切割具有与sirna双链体的反义链互补的序列的单链rna。靶rna的切割发生在与sirna双链体的反义链互补的区域中部。因此,本发明的一些实施方案预期使用dsrna以减量调节蛋白质自mrna表达。按照一个实施方案,使用长于30bp的dsrna。不同的研究表明长dsrna可用于沉默基因表达而不诱导应激反应或引起重大脱靶作用—参见例如[stratetal.,nucleicacidsresearch,2006,vol.34,no.133803-3810;bhargavaaetal.brainres.protoc.2004;13:115-125;diallom.,etal.,oligonucleotides.2003;13:381-392;paddisonp.j.,etal.,proc.natlacad.sci.usa.2002;99:1443-1448;trann.,etal.,febslett.2004;573:127-134]。按照本发明的一些实施方案,在其中干扰素途径不被激活的细胞中提供dsrna,参见例如billyetal.,pnas2001,vol98,pages14428-14433和dialloetal,oligonucleotides,october1,2003,13(5):381-392.doi:10.1089/154545703322617069。按照本发明的一个实施方案,特别设计了不诱导减量调节基因表达的干扰素和pkr途径的长dsrna。例如,shinagwa和ishii[genes&dev.17(11):1340-1345,2003]开发了一种载体(名为pdecap)以从rna聚合酶ii(polii)启动子表达长双链rna。因为来自pdecap的转录物缺乏有利于ds-rna输出至胞质的5'-帽结构和3'-poly(a)尾两者,因此来自pdecap的长ds-rna不干扰干扰素反应。哺乳动物系统中逃避干扰素和pkr途径的另一种方法是经由通过转染或内源表达引入小抑制rna(sirna)。术语“sirna”是指诱导rna干扰(rnai)途径的小抑制rna双链体(一般介于18-30个碱基对之间)。通常,sirna被化学合成为21聚体,具有中心19bp双链体区和在末端的对称的2-碱基3'-突出端,但最近描述了与相同位置的21聚体相比,25-30碱基长度的化学合成rna双链体效能可增加高达100倍。提出了所观察到的采用较长rna引发rnai而获得的效能提高产生于为切酶提供底物(27聚体)而不是产物(21聚体),且这提高sirna双链体进入risc的速率或效率。已经发现,3'-突出端的位置影响sirna的效能,且在反义链上具有3'-突出端的不对称双链体一般比在有义链上具有3'-突出端的那些更有效(roseetal.,2005)。这可归因于加载至risc的不对称链,因为当靶向反义转录物时观察到相反的功效模式。双链干扰rna(例如sirna)的链可连接形成发夹或茎-环结构(例如shrna)。因此,如所述,本发明的一些实施方案的rna沉默剂也可以是短发夹rna(shrna)。本文所用术语“shrna”是指rna试剂,其具有茎-环结构,包含互补序列的第一和第二区,所述区的互补性程度和取向足够使得碱基配对发生在所述区之间,第一和第二区通过环区连接,该环产生于在环区内的核苷酸(或核苷酸类似物)间缺乏碱基配对。环中核苷酸的数目是介于和包括3-23、或5-15、或7-13、或4-9、或9-11的数目。环中的一些核苷酸可参与与环中其它核苷酸的碱基对相互作用。可用于形成环的寡核苷酸序列的实例包括5'-caagaga-3'和5’-uuacaa-3’(国际专利申请号wo2013126963和wo2014107763)。本领域技术人员应认识到,所得的单链寡核苷酸形成包含能够与rnai机器相互作用的双链区的茎-环或发夹结构。适于与本发明的一些实施方案使用的rna沉默剂的合成可如下实现。首先,扫描aa二核苷酸序列的aug起始密码子下游的tfl1(或seqidno:79-90)mrna序列。每个aa和3’邻接的19个核苷酸的出现记录为可能的sirna靶位点。优选,sirna靶位点选自可读框,因为非翻译区(utr)较富含调节性蛋白质结合位点。utr结合蛋白和/或翻译起始复合物可干扰sirna内切核酸酶复合物的结合[tuschlchembiochem.2:239-245]。但应认识到,针对非翻译区的sirna也可以是有效的,正如对于gapdh其中针对5’utr的sirna介导细胞gapdhmrna约90%降低和蛋白质水平完全消失所表明的(www(dot)ambion(dot)com/techlib/tn/91/912(dot)html)。第二,应用任何序列比对软件,例如可获自ncbi服务器的blast软件(www(dot)ncbi(dot)nlm(dot)nih(dot)gov/blast/),将可能的靶位点与合适的基因组数据库(例如人、小鼠、大鼠等)进行比较。筛选出显示与其它编码序列有显著同源性的推定的靶位点。选择合格的靶序列作为模板用于sirna合成。优选的序列是包括低g/c含量的那些,因为与具有高于55%的g/c含量的那些相比,这些被证实在介导基因沉默中更有效。沿靶基因的长度优选选择数个靶位点用于评价。为了更好的评价所选的sirna,优选联合使用阴性对照。阴性对照sirna优选包括与sirna相同的核苷酸组成但缺乏与基因组的显著同源性。因此,优选使用sirna的杂混核苷酸序列,只要它不显示与任何其它基因有任何显著同源性。可用于本发明的方法的构建体可采用本领域技术人员众所周知的重组dna技术构建。可将编码序列(例如编码seqidno:79-90的任一个的沉默剂)构建体插入载体中,载体可为市购获得的,适于转化至植物并适于在转化细胞中表达目标基因。遗传构建体可以是表达载体,其中核酸序列与允许在植物细胞中表达的一个或多个调节序列有效连接。植物细胞可用本发明的核酸构建体稳定或瞬时转化。在稳定转化中,本发明的核酸分子整合至植物基因组,因此它代表了稳定的遗传性状。在瞬时转化中,核酸分子通过经转化细胞表达,但它未整合至基因组,因此它代表了瞬时性状。有各种将外源基因引入单子叶植物和双子叶植物两者中的方法(potrykus,i.,annu.rev.plant.physiol.,plant.mol.biol.(1991)42:205-225;shimamotoetal.,nature(1989)338:274-276)。引起外源dna稳定整合至植物基因组dna的主要方法包括以下两种主要方法:(i)土壤杆菌(agrobacterium)介导的基因转移:kleeetal.(1987)annu.rev.plantphysiol.38:467-486;kleeandrogersincellcultureandsomaticcellgeneticsofplants,vol.6,molecularbiologyofplantnucleargenes,eds.schell,j.,andvasil,l.k.,academicpublishers,sandiego,calif.(1989)p.2-25;gatenby,inplantbiotechnology,eds.kung,s.andarntzen,c.j.,butterworthpublishers,boston,mass.(1989)p.93-112。(ii)直接dna摄取:paszkowskietal.,incellcultureandsomaticcellgeneticsofplants,vol.6,molecularbiologyofplantnucleargeneseds.schell,j.,andvasil,l.k.,academicpublishers,sandiego,calif.(1989)p.52-68;包括直接摄取dna进入原生质体的方法,toriyama,k.etal.(1988)bio/technology6:1072-1074.dnauptakeinducedbybriefelectricshockofplantcells:zhangetal.plantcellrep.(1988)7:379-384.frommetal.nature(1986)319:791-793。通过粒子轰击将dna注射至植物细胞或组织中,kleinetal.bio/technology(1988)6:559-563;mccabeetal.bio/technology(1988)6:923-926;sanford,physiol.plant.(1990)79:206-209;通过使用微量移液管系统:neuhausetal.,theor.appl.genet.(1987)75:30-36;neuhausandspangenberg,physiol.plant.(1990)79:213-217;细胞培养物、胚或愈伤组织的玻璃纤维或碳化硅晶须转化,美国专利号5,464,765或通过dna与萌发的花粉直接孵育,dewetetal.inexperimentalmanipulationofovuletissue,eds.chapman,g.p.andmantell,s.h.anddaniels,w.longman,london,(1985)p.197-209;以及ohta,proc.natl.acad.sci.usa(1986)83:715-719。土壤杆菌系统包括使用含有整合至植物基因组dna的确定dna区段的质粒载体。植物组织接种的方法随植物种和土壤杆菌递送系统而变化。广泛使用的方法是叶盘法,该方法可采用提供引发整株植物分化的良好来源的任何组织外植体进行。horschetal.inplantmolecularbiologymanuala5,kluweracademicpublishers,dordrecht(1988)p.1-9。补充方法采用与真空渗入结合的土壤杆菌递送系统。土壤杆菌系统在产生转基因双子叶植物中尤其是切实可行的。有各种将直接dna转移至植物细胞的方法。在电穿孔中,将原生质体短暂暴露于强电场中。在显微注射中,使用非常小的微量移液管将dna机械地直接注入细胞中。在微粒子轰击中,dna被吸附在微弹(microprojectile)(例如硫酸镁晶体或钨粒)上,微弹被物理加速进入细胞或植物组织中。在稳定转化后,进行植物繁殖。最见的植物繁殖方法是通过种子。然而,通过种子繁殖的再生因杂合性所致在作物中没有一致性而有缺陷,因为种子通过植物按照孟德尔定律规定的遗传方差产生。基本上,每个种子在遗传上是不同的,各自将以其自身的特定性状生长。因此,优选如此产生转化植物,使得再生植物具有亲本转基因植物的相同性状和性质。因此,优选转化植物通过微体繁殖(micropropagation)再生,所述微体繁殖提供转化植物的快速一致的繁殖。然而还预期其它生产方法,包括有性繁殖(和不论从形态上的还是使用本文所述分子标志物选择有限花序表型)、组织培养等。微体繁殖是从所选的亲本植物或栽培种上切割的单块组织生长出新一代植物的过程。该过程允许具有表达融合蛋白的优选组织的植物的大量繁殖。产生的新一代植物在遗传上与原始植物相同并具有原始植物的全部性质。微体繁殖允许在短时间内大量产生优质植物材料,并提供在保持原始转基因或转化植物的性质的情况下所选栽培种的快速繁殖。克隆植物的优势是植物繁殖的速度和所生产的植物的品质和一致性。微体繁殖是一个在各阶段之间需要培养基或生长条件变化的多阶段过程。因此,微体繁殖过程包括4个基本阶段:第1阶段,初始组织培养;第2阶段,组织培养物繁殖;第3阶段,分化和植物形成;和第4阶段,温室培养和锻炼。在第1阶段,初始组织培养,建立组织培养物,并证实是无污染物的。在第2阶段,初始组织培养物经繁殖直到产生足量的组织样品以满足逐步的增加,使得它可在自然环境下生长。已显示可用于转化植物宿主的病毒包括camv、tmv、trv和bv。使用植物病毒转化植物描述于美国专利号4,855,237(bgv)、ep-a67,553(tmv)、日本公布的申请号63-14693(tmv)、epa194,809(bv)、epa278,667(bv)和gluzman,y.etal.,communicationsinmolecularbiology:viralvectors,coldspringharborlaboratory,newyork,pp.172-189(1988)。用于在许多宿主(包括植物)中表达外源dna的假病毒颗粒描述于wo87/06261。由于有限花序习性受ft/tfl1分子开关控制,本发明还预期ft的增量调节以赋予有限花序习性(例如seqidno:1支架30055上tfl1坐标113916-114125的增量调节参见下表5中的粗体字:30055.t000014或与seqidno:1具有至少70%整体同源性的直向同源物(ortholog))。按照本发明的一些实施方案,有限花序蓖麻植物(基因修饰的或非基因修饰的)的活力稳定持续至少4、5、7、9或10代。本文所用短语“植物活力”是指由植物在指定时间产生的组织的量(以重量测量)。不论用于产生本发明的一些实施方案的有限花序蓖麻的方法如何,一旦植物或任何繁殖材料在手,其就从有限花序习性中选择。因此,按照本发明的一个方面,提供选择有限花序蓖麻植物的方法,所述方法包括检测蓖麻植物的基因组中两侧是l3-f(seqidno:10)和r6-r(seqidno:57)的染色体区的功能缺失遗传变化,其中所述染色体区中功能缺失遗传变化的存在表示有限花序蓖麻植物。本领域已知用于分析突变的许多方法,包括例如单碱基延伸(sbe)、等位基因特异性引物延伸测序(aspe)、dna测序、rna测序、基于微阵列的分析、通用pcr、等位基因特异性延伸、杂交、质谱法、连接、延伸-连接、flap内切核酸酶介导测定法、限制性片段长度多态性(rflp)、电泳、序列比对、等位基因特异性寡核苷酸杂交(aso)和随机扩增多态性dna(rapd)。因此,本发明预期可用来区分tfl1的突变和非突变形式的寡核苷酸(例如引物)。一组示例性的引物描述于实施例章节,例如seqidno:10和57。因此,一旦鉴定出携带功能缺失遗传变化的植物,便视其为具有有限花序习性。这种植物材料可在开发具有农业上所需性状的蓖麻变种中用作育种材料。按照一个实施方案,本发明的植物是杂交变种的—即在两株非等基因植物杂交(即交配)后产生。杂交可以是f1杂种。本文所用“f1杂种”是指使两株非等基因植物杂交的第一代后代。本发明的蓖麻杂种的发育需要开发稳定的亲本品系,然而它们的至少一个对上述例如tfl1基因中的功能缺失遗传变化是杂合的。在育种程序中,将来自两个或更多个种质来源或基因库的所需性状组合以开发出优良的育种变种。通过最佳育种品系的连续自花受粉和/或回交和选择开发所需的近交或亲本品系,有时利用分子标志物加速选择过程。一旦鉴定出产生最优杂交性能的亲本品系,例如均携带上述例如在tfl1基因中的功能缺失遗传变化,便可无限地产生杂交种子,只要保持亲本的同质性。按照一个实施方案,本发明的蓖麻植物是稳定的亲本植物品系(携带例如呈杂合形式的tfl1基因中的功能缺失遗传变化)。本文所述短语“稳定的亲本品系”是指开放授粉的近交系,在自花受粉和种植的周期中对所需植物是稳定的。按照一个具体的实施方案,在本发明的亲本品系中,95%的基因组呈纯合形式。植物育种中的常规实践是采用回交方法以通过单一性状转变生成新的变种。本文所用短语“单一性状转变”是指将新的单个基因掺入亲本品系中,其中除转移的单个基因以外,基本上亲本品系所有所需的形态和生理性质得以恢复。本文所用术语“回交”是指杂交后代重复杂交回到亲本蓖麻植物之一。为所需性质贡献基因的亲本蓖麻植物称为非轮回或供体亲本。该术语是指在回交方案中非轮回亲本被使用一次并因此不再轮回的事实。基因从非轮回亲本向其转移的亲本蓖麻植物称为轮回亲本,因为它在回交方案中被使用几轮。在典型的回交方案中,使来自原始目标变种(轮回亲本)的植物与选自携带待转移的目标单一基因的第二变种(非轮回亲本)的植物杂交。然后使来自这种杂交的所得后代再次与轮回亲本杂交,重复此过程直到获得这样的蓖麻植物,其中转化植物中除了来自非轮回亲本单个转移基因以外,基本上轮回亲本的所有所需形态和生理性质恢复。因此,近等基因系(nil)可通过多次回交产生以得到在遗传组成上几乎相同的一系列个体,不同的是研究中的性状或基因组区,在此情况下为例如tfl1基因中的功能缺失遗传变化。回交方法可与本发明一起使用以改进特征或将其引入亲本品系。上文所述标记辅助育种(选择)可用于该方法中。通过实施本发明的实施方案,本发明人能够产生有限花序蓖麻植物,其代表性种子已根据布达佩斯条约于2015年11月2日在ncimbltd.以ncimb42477(vs011)、ncimb42478(vs018)、ncimb42479(vs025)、ncimb42480(vs030)或ncimb42481(vs033)保藏。下表6中提供显示有限花序表型的这类杂交植物的实例。因此,本发明提供新的蓖麻植物和栽培种及用于产生它们的种子和组织培养物。根据本发明的教导产生的蓖麻植物可进一步加工以产生蓖麻植物产品,其通常用于多种工业应用,包括生物型润滑油、蜡、油漆和涂料、塑料、药用的抗真菌化合物和化妆品。按照一个具体的实施方案,蓖麻加工产品包含植物的dna。因此,按照本发明的一个方面,提供生产蓖麻油的方法,所述方法包括:提供(例如通过收获)蓖麻植物的种子或上文所述植物部分;和从种子中提取油从而生产蓖麻油。下面是种子收集和加工的非限制性描述。在大约95-180天,在完全成熟和叶可能是干的时,收获蓖麻果实,这取决于栽培种。种植和收获可用手工方法进行或完全机械化(其中有限花序表型赋予巨大优势)。在热带地区收获应在雨季前开始,但在干燥地区,最好在所有果实成熟时收获。切下或折断总状花序,剥开蒴果并收集。除非蒴果是干的,否则必须将它们铺开以快速干燥,例如通过晒干、冻干或通过使用落叶剂。可以使用收割机械,例如改良的小麦收割机,其通过在它们的基部上震动植物以将蒴果从植物上摇下。45%或更低的相对湿度是机械收割机有效运作所需要的。某些果皮不裂的品种通过普通的谷物脱粒机在400-800r.p.m.滚筒转速下脱粒。对于有限花序表型可使用专用收割机。收获以后,必需从蒴果或壳上取出种子,如果蒴果是干燥的,则通常使用脱壳机。种子与壳的百分比平均是55-70,这取决于收割时种子的成熟度和遗传背景和农业技术和条件。从蓖麻种子提取油以类似于大多数其它含油种子的方式进行。在提取之前,对种子清理、蒸煮并干燥。进行蒸煮来凝固蛋白质(允许有效提取所必需的),并释放油用于有效的压榨。第一阶段的油提取是利用高压连续式螺旋压榨机(称为螺旋榨机)进行预压榨。过滤提取的油,使从油中除去的材料与新料一起返回到流路中。最后从压榨机中排出的物料(称为块(cake))含有8-10%的油。将它挤压成粗粉,用己烷或庚烷进行溶剂提取。一旦从种子中提取出油,则必需从油中除去杂质。油是基本上纯的甘油三酯,含有几乎90%的甘油蓖麻油酸酯(glyceryltricinoleate)。这是生产高质量蓖麻油所需要的蓖麻油酸甘油三酯。精炼粗制油的步骤包括:油的沉淀和脱胶—进行沉淀和脱胶以从脂质中除去水相,并从油中除去磷脂。漂白—漂白引起有色物质、磷脂和氧化产物的去除。中和—中和步骤是从油中除去游离脂肪酸所必需的。这可以两种方式之一来进行:(a)碱(化学的)或(b)汽提(物理)的方式。碱/化学方法:将苛性钠(碱)以适当的量混合,除去水溶液,留下中性油。汽提:这在真空下进行,以从油中除去水分、游离脂肪酸、气味体和其它杂质。由于这在真空条件下进行,油可以保持在低温下,通过不使它经受可能发生不希望的脱水反应的温度来保持它的化学结构。油的脱臭—脱臭使得从油中除去气味。可从蓖麻油中生产许多衍生物。这些衍生物的一些具有类似于基于石油的油的化学成分。蓖麻种子残渣,也称为蓖麻粉—蓖麻粉是通过溶剂提取过程从蓖麻块获得的残余物。它是最通用的天然肥料之一。这种肥料提高土壤的肥力而不引起任何损害或退化。它富含对作物适当生长是关键和有助的三种元素,即氮、磷和钾。它还具有痕量营养物,如锰、锌和铜,因而使得它成为一种平衡肥料。此外,它有助于中和化学肥料的有害作用。除了它们对营养物的贡献之外,它们在农业上具有许多益处,这些都是合成肥料或杀虫剂不能提供的。它们提供缓慢和稳定的营养、刺激、保护免遭土壤线虫和昆虫,改进产量,和产品质量,如口味、风味、氨基酸组成等。在蓖麻子提取过程后获得的压缩块常常用作肥料。根据脱皮程度,蓖麻籽块的蛋白质含量在21-48%间变动。它具有具有适度高的半胱氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸的理想的氨基酸分布。但是它的抗营养物质蓖麻毒蛋白(ricin)和各种变应原限制了它在家禽饲料中的用途,甚至在非常低的包含水平下。氢化蓖麻油(hco)——亦称蓖麻蜡,是坚硬的、易碎的、不溶的蜡。它通过在存在镍催化剂的情况下添加氢来产生。它主要在需要对抗潮湿、油和其它石油化学产品时用于涂料和润滑脂。hco通过用镍催化剂对蓖麻油进行氢化作用来生产。它的白色薄片是极度不溶的,并且是耐水的。主要用途是生产润滑脂,并用于食品包装的纸张涂层中。氢化油还可用于蜡、磨光剂、复写纸、蜡烛和蜡笔的制造中。12羟基硬脂酸(12hsa)—12hsa是灰白色固体脂肪酸,用于制造基于锂和钙的润滑性润滑脂。当与酯反应时,12hsa提供了硬质罩面漆,用于汽车和小家电产业。甲基12hsa(甲基12羟基硬脂酸,甲基12羟基硬脂酸酯)—甲基12hsa通过12hsa与甲醇直接酯化形成。它通常以液体形式出售,广泛用于连续的润滑脂加工。它具有比12hsa低的熔点,因而,更容易在液体形式下操作。用甲基12hsa制备的润滑脂可以配置为更高的滴点,它们经历更少的分油(bleeding)和改善的氧化稳定性。吹制蓖麻油—吹制蓖麻油是一种蓖麻油衍生物,其具有比天然蓖麻油更高的粘度和比重。这些性质通过在升高的温度下将空气鼓泡通过它来诱导。吹制蓖麻油可用作墨水、漆和粘合剂的增塑剂。colm,聚氨酯级—colm(低水分蓖麻油)是蓖麻油的精炼级,用于需要最低水分的专门应用。典型应用包括聚氨酯涂料、粘合剂和墨水。colm还可用于聚氨酯吹制和聚氨酯塑模。脱水油是可以与桐油相媲美的优良干燥剂,用于油漆和清漆中。预期在从本申请获取的专利的期间,将开发出有限花序习性的许多相关蓖麻植物,术语有限花序蓖麻的范围意包括所有这类新技术为先验的。本文所用术语“约”是指±10%。术语“包含”、“含有”、“包括”、“含”、“具有”及其变化形式意指“包括但不限于”。术语“由……组成”意指“包括并限于”。术语“基本上由……组成”意指组合物、方法或结构可以包括其它成分、步骤和/或部分,但只有当所述其它成分、步骤和/或部分不实质性地改变所要求保护的组合物、方法或结构的基础的和新的特征时。如本文所用,单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代,除非文中另有明确规定。例如,术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物,包括其混合物。在整个本申请中,本发明的各种实施方案可以范围形式呈现。应理解,范围形式的描述仅仅是为方便和简洁起见,不应视解释为是对本发明范围的不可变更的限制。因此,范围的描述应当被视为具体公开了所有可能的子范围以及该范围内各个数值。例如,从1到6的范围的描述应当被视为具体公开了子范围例如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等以及该范围内的各个数字,例如1、2、3、4、5和6。这不论范围宽度如何均适用。无论何时本文标明数值范围时,意味着包括该指定范围内的任何引用数字(分数或整数)。短语第一标示数字和第二标示数字“之间的范围”以及“从”第一标示数字“到”第二标示数字“的范围”在本文可互换使用,意味着包括第一和第二标示数字及其之间的所有分数和整数。本文所用术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和步骤,包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的或易于从已知的方式、手段、技术和步骤发展出的那些方式、手段、技术和步骤。本文所用术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转病况的进展,基本上改善病况的临床或审美症状或基本上防止病况的临床或审美症状的出现。当引用特定序列表时,要了解所述引用还包括基本上相当于其互补序列的序列,如包括产生于例如测序错误、克隆错误的少数序列变异或导致碱基取代、碱基缺失或碱基添加的其它改变,条件是这种变异的频率为50个核苷酸中少于1个,或者100个核苷酸中少于1个,或者200个核苷酸中少于1个,或者500个核苷酸中少于1个,或者1000个核苷酸中少于1个,或者中5,000个核苷酸少于1个,或者10,000个核苷酸中少于1个。要认识到,为了清楚起见,在各个实施方案的情况下描述的本发明的某些特征,也可以组合在单个实施方案中提供。反之,为了简洁起见在单个实施方案的情况下描述的本发明的不同特征,也可以单独地或以任何适合的亚组合、或适当时在本发明的任何其它描述的实施方案中提供。在不同实施方案的情况下描述的某些特征不得视为是那些实施方案的必要特征,除非所述实施方案没有那些要素不起作用。上文描述的以及随附权利要求书部分中要求保护的本发明的不同实施方案和方面可以在以下实施例中找到实验支持。实施例现在参照以下实施例,其与上文的描述一起,以非限制性方式说明了本发明的某些实施方案。实施例1系谱描述实施例2有限花序基因座作图为了使有限花序植物的表型性状与基因组事件关联,进行了gbs/rad分析。限制位点相关dna(rad)是指限制性内切核酸酶识别位点相关dna方法,其降低基因组的复杂性。在参比基因组不存在时,该技术鉴定snp位点,使得可构建高密度遗传学图。该图可用于qtl作图。从亲本品系即502和503(参见下表3)及其来源于使上述亲本品系杂交的f2分离群(参见下表3)采集共150个植物样品。从各采集的样品如下制备高质量dna:称取150mg组织,在液氮中冷冻,使用研钵和研杵捣碎。然后将样品重新悬浮于750µlctab裂解缓冲液[300mmtris-hc1ph8.0、25mmedtaph8.0、2mnac1、2%(w/v)可溶性pvp(mw40000)、2%(w/v)ctab]中,加入5µlrnaea[3.3mg/ml],涡旋混合,在65℃水浴中孵育30分钟。然后使样品冷却至室温,加入750µl氯仿-异戊醇(24:1,v/v)。在将管轻轻振荡5分钟后,将样品以14,000rpm离心15分钟。将上相转移到加有650µl异丙醇100%的清洁管中,在-20℃冷冻室中孵育2小时,之后通过14,000rpm离心15分钟使dna沉淀。沉淀用70%预冷却的乙醇(etoh)洗涤,重新悬浮于120µlte缓冲液中。在dna制备以后,采用qubiths测定法(lifetechnologies)定量测定样品,在凝胶上电泳以证实dna在该过程中未降解。按照视野中的表型表现,选择分离的f2种群的96个样品。该f2种群分离成无限花序和有限花序植物。选出一些有限花序和无限花序,但无限花序的一些是纯合的,一些是杂合的。dna通过中国bgi测序。在产生配对末端91bp数据的illuminahiseq2000机中对dna测序。测序原始数据采用fastqc检查qc,过滤,按照与各样品有关的条码指派样品。采用soap对样品进行比对。然后利用samtools以识别(call)比对标签上每一个的snp变异。snp分析检出42926-60876个snp标记,与蓖麻基因组草图进行比较,它们中约5000个显示亲本品系间的杂合性。一旦获得88个样品和来自各亲本样品(即502和503)的2个样品的基因型数据,将文件类型从基因型转换成hapmap格式。针对蓖麻基因组中所有可获得的支架构建1,657个hapmap文件。各文件由支架内所有可获得的标记和在经测序的所有样品中鉴定的基因型组成。tassel软件工具被用来进行所有可获得的样品间有限花序性状的关联检验。将所有1,657个hapmap文件连同性状表保持表型信息一起加载至tassel数据库。将支架信息同时合并到所有蓖麻基因组的1个基因型表中。关联分析采用一般线性模型(generallinearmodel,glm)统计方法进行,并应用1,000置换的置换检验进一步检测可能的随机化作用。然后将结果通过最严格关联过滤:p值得到最小可能置换的支持(p值在此情况下为0.001)。下表2显示与蓖麻有限花序性状关联的最高评分标记。有限花序蓖麻植物的缺失区包含如下表5描述注解的12个编码基因。表2:通过tassel发现的与有限花序性状关联的snp标记的输出表:实施例3对有限花序蓖麻的构成原因的突变作图检查来自gbs数据集的snp识别(参见下表3),显然显示有限花序表型的植物缺失来自标记1-2和4-5的snp(参见上表2),这导致以下设想,即有限花序表型由在具有位于存在于有限花序和无限花序样品两者的标记中和仅存在于无限花序样品中的标记之间有确切断裂点,即左断裂点:58259-101086和右缺失断裂点:146591-153778的区域(支架30055,核苷酸101086-146591,seqidno:1)内的基因组缺失引起。为了对缺失区有效作图,设计引物以扩增特定的小pcr产物,覆盖疑似的断裂点区并且间隔为2000-5000bp(参见图1)。图2显示扩增子l1-l3(参见下表4)在有限花序和无限花序样品两者中是阳性,而l4-l20(参见表4)扩增子在无限花序样品中失去,将左断裂点限于60494-61345,扩增子r6-r8(参见下表4)在有限花序和无限花序两者中为阳性,而r1-r5(参见下表4)仅在无限花序样品中为阳性,将右缺失断裂点限于15226-151623。用于对扩增子作图的引物描述于下表4。为了进一步对确切断裂点作图,使用引物l3-f(seqidno:10)和l6-r(seqidno:57)以扩增断裂点区,随后对其进行sanger测序。将所得序列(图3a,seqidno:2)与蓖麻基因组比对(图3b),将确切缺失断裂点作图至30055支架序列(seqidno:1)上的坐标60520-152129。实施例4蓖麻tfl1同源物位于关联的有限花序缺失区内30055的基因注释:60520-152129缺失区发现12个基因在其中作图(描述于下表5)。发现基因座id:30055.t000014与参与开花调节的保守的蛋白质家族同源。在发表的草图中,30055.t000014包括失去的核苷酸。为了对完全转录物测序,将基因扩增,并用引物tfl1_30055_fcaaaagttcacaagccatgag(seqidno:62)和tfl1_30055_rttctcccaacaaggcagaag(seqidno:63)测序,发现所得序列(多核苷酸seqidno:3;cdsseqidno:4和推测的蛋白质序列seqidno:5)与tfl1高度同源。表3:来源于gbs数据的标记和关联s=按照iupac核苷酸编码为g或c。表4:用于断裂点作图的引物表5.位于缺失区内的基因及其注释:表6.本发明一些实施方案的有限花序蓖麻杂交植物的谱系实施例5位于关联的有限花序缺失区内和在植物发育阶段中蓖麻基因的表达材料和方法植物材料将来自有限花序近交系g-60(见上文)和无限花序近交系g-10的蓖麻(ricinuscommunisl.)植物在温室中栽于盆内。在不同的植物发育阶段从芽、叶和根采集组织样品。在2叶、4叶、6叶和在开始开花时(开花前期)采集g-60株植物组织样品。由于较迟花期所致,在2叶、4叶、6叶、8叶和在开始开花时(开花前期)从g-10采集植物组织样品。将所有组织样品在液氮中速冻,保存在-80℃下用于进一步分析。rna的分离和cdna合成将冷冻组织样品在液氮中研磨成细粉。按照生产商的使用说明,使用hiyield™总rna分离试剂盒,从100mg组织样品中分离总rna(realbiotechcorporation)。使用versocdna合成试剂盒(thermoscientific),使总rna(1μgrna)的一部分反转录。引物设计和定量实时聚合酶链式反应应用primer3软件(www./primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)设计引物以产生介于70和150bp间的扩增子。用于包括2种管家基因泛素和gapdh(用作内参基因)的qrt-pcr的引物序列描述于表7。在steponeplusreal-timepcr系统(appliedbiosystems)中在96孔板内进行qrt-pcr。qrt-pcr反应(总体积12µl)含有4µlcdna(13ng)、1.5µl引物(2.5µm的各引物)、0.5µl水和6µlfastsybr®greenmastermix(appliedbiosystems)。qrt-pcr反应如下进行:在95℃下初始解链步骤20秒钟,接着以下的40个循环:在95℃下变性3秒钟,并在60℃下退火、延伸和荧光信号采集30秒钟。通过在95℃下孵育3秒钟接着从60℃以0.3℃逐步升温至95℃,获得解链曲线图。各样品的相对cdna水平应用2−δδct方法计算。表7用于qrt-pcr分析的引物。基因正向引物/seqidno:反向引物/seqidno:30055.m001538gacgcagaacctgatgatgttg/91atctcctttgggcgactgtac/9230055.m001539tctctgcgtgaacaattgcg/93tgaaggcgagttttgcgttg/9430055.m001540tggtttccaagctgtgatgc/95tgtgctgatttcccaaagcc/9630055.m001541tggtgtgacttgccttgttg/97cctttccattgcttcagagagc/9830055.m001542aaagcttccatggctgtacc/99cccccacatatgcatctgc/10030055.m001543ttctaacggtgcccttttgg/101tccggactacctttccaagaac/10230055.m001544(tfl1)actctggtagtgatgacagacc/103tggccttggcatttcatagc/10430055.m001545accctggttgttctactggtg/105tggcgaaccttttcctgaac/10630055.m001546tgctgaccaaatgcaactgg/107acaccagctagcctgtgtg/10830055.m001547agcgcatgacattgaagagc/109tgtacctgctagcctgtgtg/11030055.m001548aacggaattgggcatgcaac/111ccgtatacgcctgcttcctag/11230055.m001549tgttgattgtgtcggctcag/113agtgctggaaatggcaactg/11430169.m006323泛素atcgatcgaatcaaggaacg/115caccctcaatgttgtagtcacg/11630190.m010986gapdhgctgctatcaaggctgaatctg/117agccttggcgtcaaaaatgc/118结果有限花序蓖麻植物(g-60)在30055支架序列(seqidno:1)上的坐标60520-152129处包含缺失,这赋予该有限花序表型。为了评价位于缺失区的注释基因对有限花序蓖麻表型的贡献,本发明人研究了表5所列基因在不同植物发育阶段的表达。在上述材料和方法中描述的不同植物发育阶段从不同植物部分采集来自有限花序蓖麻近交系(g-60)和无限花序近交系(g-10)的植物组织样品。对于基因表达评价,切下来自g-60和g-10近交系的苗端,例如,通过qrt-pcr测定4种基因(参见表5)mrna表达水平。在2、4、6和8叶时从植物采集的苗端基本上是叶芽,而开花前期的苗端是花芽。正如所预期的,g-60近交系样品不含上文表5所列基因的mrna可检测水平。相比之下,所有12个基因(参见表5)在g-10近交系中在不同的植物发育阶段以不同的mrna水平表达(参见图)。结果表明在不同的植物发育阶段mrna表达的变化。将8叶与开花前期相比,发现mrna表达水平的主要差异。30055.m001542(seqidno:83)、30055.m001544(tfl1)(seqidno:3或4)、30055.m001545(seqidno:86)和30055.m001547(seqidno:88)显示在其繁殖组织分化中减量调节(参见图5)。在开花前这些基因表达的减量调节表明在开花抑制中的可能作用。在无限花序蓖麻近交系中这些基因表达的缺乏可促进花分化和如在本发明一些实施方案中描述的在有限花序近交系中提早开花。例如,本领域已知tfl1(seqidno:3或4)为开花抑制物。在本研究中,seqidno:3或4,tfl1,在开花前期mrna表达水平显著减量调节,与本领域一致(参见图6a-b)。图6b清楚表明,虽然tfl1在从无限花序(g-10)叶芽采集的2、4、6和8叶样品中表达,但在开花前期未检出tfl1mrna表达,与有限花序蓖麻近交系(g-60)观察结果类似(图6b)。这些结果进一步支持在上述缺失内显著减量调节或增量调节的基因与有限花序蓖麻表型相关的设想。尽管已经结合其具体实施方案描述了本发明,但显然,多种供选方案、修改和变化对于本领域技术人员是显而易见的。因此,意图包括所有落在随附权利要求书的精神和宽范围内的这类供选方案、修改和变化。当前第1页12
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