本发明涉及动物遗传育种与繁殖、分子生物学领域，特别是涉及一种大白猪抗病新品系的培育方法。
背景技术：
我国养猪业具有强大的肉猪生产系统，也就是常说的“我国是养猪大国”，但是在“金字塔”繁育体系中顶端核心种猪资源长期依赖进口。在很长的一段时间内，对于种猪，我国都处于“引种→维持→退化→再引种”的恶性循环，在加入wto后，这一状况更严重。总之，明显的种猪引进依赖对我国养猪业的持久发展十分不利，从国家的长远利益考虑，此种现象不宜再发展下去。面对这一状况，迫使我们必须变依赖进口为创造性地进行选育，寻求适合我国国情、在国际种猪市场占有一席之地的种猪品系和繁育体系。
猪病是养猪生产的大敌。育种实践中，单纯追求高产通常导致猪的抵抗力降低，一些原有疾病未根除，又出现了新的疾病，严重制约了养猪业的发展。疾病可导致畜禽产品低劣和产量下降，同时它还严重降低遗传进展，给养猪业造成的直接经济损失约占总产值的12％～15％，因此，做好疾病预防是发展养猪业的前提。
产肠毒素性大肠杆菌(etec)是初生和断奶仔猪腹泻和水肿病最常见和最重要的病原菌，是养猪业中的重要威胁因素(boldinb，2008)，其中f18大肠杆菌又是目前在养猪业中发生最普遍、危害最大的大肠杆菌病原之一(vandenbroeckwetal,2000)。尽管当前对仔猪腹泻采取的一些预防性措施(如提高管理水平、改善卫生环境、注射药物以及亚单位疫苗接种等)，在一定程度上减少了该病的发生，但并没有从根本上消除断奶仔猪腹泻的发生与流行，大肠杆菌性仔猪腹泻仍然是引起仔猪高发病率和死亡率最主要的原因之一。为进一步保障我国养猪业步入高产、高效和优质的新时期，非抗生素治疗、广谱、直接、高效和全新的仔猪细菌性腹泻防治措施的研发是目前最迫切的攻关难题。从长远来看，采用现代遗传学方法，提高猪对大肠杆菌的抗病力，进行抗病育种，才是治本的办法。
为了获得更多的疾病防治方法，必须清楚地了解动物的免疫抗病系统及致病机理。疾病的发生一般是动物的遗传背景与其所处环境之间相互作用的结果。若某一动物在遗传上对一种疾病易感，则环境条件(包括常规疾病防治方法)可能仅对疾病的防治部分有效。一个可取代疾病常规防治法是针对提高家畜抗病力进行选择性育种。遗传性抗病力包括了机体免疫抗病系统及其相互作用的许多方面，因而极为复杂。目前从根本上开展猪的抗性遗传机制研究，进行抗病育种，已引起了国内外学者的高度重视。
病原体在传染过程中，会遇到3道防御机制，即上皮防御机制、非特异性防御机制和特异性防御机制。当个体受到病原体侵染时，会调动这3方面的防御机制加以抵抗。猪是否发病取决于侵染和防御机能相互作用的结果，防御机能加强的猪便表现出自然抗病力。抗病力按遗传基础的不同可分为特殊抗病力和一般抗病力。特殊抗病力是指猪对某种特定疾病或病原体的抗性，这种抗性主要受一个主基因位点控制，同时也可不同程度地受其它位点(包括调控子)及环境因素影响。现有的研究结果表明，特殊抗病力的内在机理在于宿主体内存在或缺少某种分子或其变体，这不仅能决定异体识别及特异性异体反应，还能决定病原体的特殊附着力，病原体进入体内后在体内增殖，能否导致宿主发病。一般抗病力不限于抗某一种病原体，它受多基因和环境的综合影响，病原体的抗原性差异对一般抗病力影响极小，甚至根本没有影响，这种抗病力体现了机体对疾病的整体防御功能。
研究发现，不少猪病的发病机制与猪本身的遗传背景有关，即猪可能对一些疾病存在完全或部分抗性。广义上讲，任何疾病的发生都是遗传与环境因素共同作用的结果，几乎所有疾病都与遗传有关。狭义上讲，遗传病是由于生殖细胞或受精卵中遗传物质发生了结构或功能上的变异所致。因此，从长远角度来看，采用遗传学方法从遗传基础上提高猪对疾病的一般抗性具有治本的功效。而一般抗性是维持猪在不良环境中生存和生产的必要条件，因此培育具有一般抗性的猪种成为育种领域的主要课题之一。
衡量动物机体对疾病抵抗能力大小的指标有很多，细胞因子(cytokines，ck)是其中一项重要指标，其是由机体免疫细胞分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子多肽，具有免疫调节、抗肿瘤、促进造血、参与炎症反应以及神经内分泌效应等多种生物学功能；在动物体内，绝大多数细胞因子含量较低，其主要作用是提高动物的免疫功能。据报道，免疫指标可代表机体的免疫功能状态，从而间接反映机体的抗病能力，因此可通过免疫指标的测定来了解动物的一般抗病力。然而迄今为止，尚未建立对大白猪一般抗病力的评价体系，因而无法从众多的细胞因子测定指标中选择最佳数量指标，形成一套适用的综合评价指标体系。
一般抗病力多个测量指标中需要构建一套适用的综合评价指标体系，在该体系中指标模型的构建是关键问题之一，主成分分析法(principalcomponentanalysis，pca)正好科学地解决了这一问题。pca是研究如何将多指标问题转化为较少的综合指标的一种重要统计方法，能使问题变得比较简单、直观，近来已成为多指标综合评价和权重系数确定的重要方法。
大白猪又称为大约克夏，原产于英国。由于大白猪体型大，繁殖能力强，饲料转化率和屠宰率高，世界各养猪业发达的国家均有饲养，是世界上最著名，分布最广的主导瘦肉型猪种。大白猪在我国“三元”杂交商品猪生产中发挥着极其重要的作用，引进的大白猪优良特性主要是高生长性能，但是也存在抗病力和繁殖力下降等问题和不足，尤其是近年来仔猪腹泻病等疾病的发病率较高，直接和间接导致母猪受胎率、产活仔数和断奶仔猪成活率下降。
技术实现要素：
本发明主要解决的技术问题是提供一种大白猪抗病新品系的培育方法，提升断奶仔猪抗腹泻病、抗应激和适应环境的能力，使得大白猪新品系的饲料报酬高和产仔数多。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种大白猪抗病新品系的培育方法，包括以下步骤：
(1)采用饲料添加的方法对大白猪核心群断奶仔猪进行大肠杆菌感染试验，根据表型鉴定的结果，组建大白猪大肠杆菌抗病育种基础群；
(2)对基础群中大肠杆菌抗性型群体细胞因子白介素1β、白介素4、白介素6、白介素8、白介素10、转化生长因子β、肿瘤坏死因子α、γ干扰素进行浓度测定；通过建立主成分综合评价模型，根据不同个体的综合得分来对大白猪一般抗病力进行综合指数选育，同时对繁殖性能、生长速度、瘦肉率、胴体品质性状进行检测和选择，组建第一个世代；
(3)用群体继代选育和分子标记辅助选择的方法，经过4-5个世代，逐步实现既定育种目标，建立新品系核心群。
在本发明一个较佳实施例中，步骤(1)所述的大白猪大肠杆菌抗病育种基础群的组建方法具体是：
1)选取的健康的30日龄大白仔猪自由饮水，按照断奶仔猪的营养需求饲喂含有21.7％粗蛋白的颗粒饲料，饲料中不含有任何抗生素和微生态制剂；每天喂料4次，一次饲料计量50g，连续饲喂3天；
2)采用饲料添加的方法进行大肠杆菌感染试验，将大肠杆菌菌株与饲料混合饲喂，每头猪每天接受菌株的平均剂量是4.6×108cfu，连续进行10天，每天对猪的粪便采集进行检测，以“正常”、“糊状”、“水样”对粪便的粘稠度进行记录；
3)对感染试验后个体的大肠杆菌抗性/易感性进行进一步验证，结合常规选种的标准，选留感染试验后表型一直为“正常”的个体，并且在相同饲养管理环境条件下按家系分开饲养，组建大白猪大肠杆菌抗病育种基础群。
在本发明一个较佳实施例中，步骤(2)第一世代的组建具体是：
1)将大白猪大肠杆菌抗病育种基础群继续一般抗病力性状的检测和选择；对大肠杆菌抗病育种基础群仔猪在35日龄时采集前腔静脉血，获得血清样品后利用猪多细胞因子检测试剂盒对细胞因子白介素1β、白介素4、白介素6、白介素8、白介素10、转化生长因子β、肿瘤坏死因子α、γ干扰素进行浓度测定；将上述测得的指标数据转化为标准化z分值，代入下述综合选择指数公式，计算每个个体的综合选择指数值fi；
fi＝0.164zx1+0.209zx2+0.223zx3+0.446zx4+0.412zx5+0.232zx6+0.396zx7+0.303zx8，，其中zx1-zx8分别为白介素1β、白介素4、白介素6、白介素8、白介素10、转化生长因子β、肿瘤坏死因子α和γ干扰素测定值的标准化数据；
fi值越大表示该个体的一般抗病力越强；结合其他性状的育种目标选留fi值高的个体。
2)对一般抗病力强的个体实行选择，运用blup模型进行种猪的遗传评估：测定的主要项目有繁殖性状、肥育性状、胴体性状和体型外貌，同时剔除出现遗传损征的个体；通过测定和评定，选留符合育种目标的个体；
断奶阶段选择：此阶段许多性状还没有表现出来,因此主要是以多留为原则，剔除不合格的整窝及生长发育差的个别猪只，原则是：剔除出现遗传缺陷的整窝猪，所有公猪去势处理；根据亲代成绩，剔除繁殖指数过低的整窝猪，所有公猪去势处理；在保证每窝至少有3头公猪的前提下，将体重低、外形差、生活力弱的所有公猪去势处理；
75日龄阶段，保育结束时的选择：此阶段的选择主要依据个体本身生长发育进行选择，仅淘汰生长发育差或有遗传缺陷的猪只，因采用的是“全进全出”的饲养模式，在断奶阶段选择剔除的猪只是在此时进行剔除出群的，原则是：剔除出现遗传缺陷的整窝猪，所有公猪去势处理；在保证每窝至少有2头公猪的前提下，将体重低、生长发育差、生活力弱的所有公猪去势处理；在保育出猪时，将在断奶阶段和此阶段选择剔除的猪只剔除至育肥舍，剩下的种猪转入后备舍或种猪测定舍；
5～6月龄阶段选择：5～6月龄时，猪只重要的生产性状除繁殖性能外都基本表现出来，因此，这一阶段是选种的关键时期，应该精选，原则是剔除体质衰弱、肢蹄存在明显疾患、有内翻乳头、体型有严重损征、外阴部特别小、同窝出现遗传缺陷、体形外貌不符合选育目标要求的猪只；其余猪只均进行测定，按照综合选择指数进行选留或淘汰；
母猪繁殖配种阶段选择：此阶段主要是依据猪只本身的繁殖性能进行选择，原则是同批次的后备母猪应在1个月内集中配种完毕，1个月后淘汰未能发情配种的后备母猪；集中配种后，淘汰流脓、非正常返情的个体；正常返情的个体转入生产群中再次配种，若再次返情者淘汰；初产时，淘汰母性太差的个体；对进入生产群繁殖了3胎的母猪，发现其繁殖性能特别优秀者，可再次纯繁1胎；对于其繁殖性能较差的，则后代不留种；
3)采用不完全闭锁的一年一世代的群体继代选育法，维持6个以上的独立血统数量。
在本发明一个较佳实施例中，步骤(3)群体继代选育的方法是：
1)统一场内测定性状、测定方法及数据库结构，将统计的各项测定数据输入gbs遗传评估软件，采用多性状动物模型blup法对种猪进行遗传评估，估算单性状的育种值和多性状综合选择指数，根据测定评估数据并结合现场观察来严格选择，只有最优秀者才被入选为核心群；
2)世代选育，结合分子标记辅助选择mas，实施分子育种与常规育种相结合，对个体繁殖性能进行早期选择，提高选择准确性，缩短世代间隔，从而加大年遗传进展；对特别优秀的个体允许适当的世代重叠，提高群体中高产基因频率，通过不断合理调整、优化核心群的结构来进一步选育提高大白猪抗病新品系种猪的各项生产繁殖性能。
在本发明一个较佳实施例中，所述繁殖性状包括总产仔数和活产仔数，所述活产仔数包括主选性状、初生重、21日龄窝重和产仔间隔，所述肥育性状包括达100kg日龄、30kg－100kg日增重和30kg～100kg饲料转化率，所述胴体性状包括达100kg活体背膘。
在本发明一个较佳实施例中，所述多性状综合选择指数包括生长指数、繁殖指数、父系指数和母系指数。
本发明的有益效果是：本发明指出的一种大白猪抗病新品系的培育方法，具有以下优点：
(1)从大白猪抗逆性入手开展抗病育种，提高猪的免疫应答能力和一般抗病力，可以更有效地解决猪很多疾病如呼吸道疾病与环境相互作用的问题，从根本上降低诸多疾病的发病率；
(2)传统的新品系培育技术，主要基于表型性状进行选择，存在周期长、遗传进展缓慢等缺点，本发明将免疫学原理、分子育种技术及常规育种手段相结合，提高大白猪的特殊抗病力(抗大肠杆菌引起的断奶仔猪腹泻)和一般抗病力，尤其是先前的一般抗病力评估还仅局限于研究少数几个参数进行判断，无法综合、准确地判断一般抗病力的强弱。本发明则很好地解决了如何从众多指标中选择最佳数量指标的难题，最终达到科学评价猪个体一般抗病力的目的；
(3)本发明培育的新品系猪不仅抗断奶仔猪腹泻病，还具有瘦肉率高、肉质优、饲料报酬高、产仔数多、抗应激、适应环境能力强的优点，可以直接用于种猪生产，还可以组成杂交配套系的母系；本发明还可以为其他猪品种的抗病育种和新品系选育提供技术支持和指导。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的技术方案是：对大白猪核心群采用饲料添加的方法进行大肠杆菌感染试验，根据表型鉴定的结果，组建大肠杆菌抗病育种基础群；同时基于主成分分析构建一般抗病力的评估模型，对大肠杆菌抗病育种基础群进行一般抗病力综合指数选育，结合生长速度、瘦肉率、胴体品质等性状进行检测和选择，运用最佳线性无偏预测(bestlinearunbiasedprediction,blup)模型进行种猪的遗传评估，运用群体继代选育和分子标记辅助选择的方法，通过4-5个世代的培育，最终培育出大白猪抗病新品系。
大白猪抗病新品系的培育方法包括以下步骤：
(1)对大白猪核心群断奶仔猪采用饲料添加的方法进行大肠杆菌感染试验，根据表型鉴定结果，组建大白猪大肠杆菌抗病育种基础群；
(2)对基础群中大肠杆菌抗性型群体细胞因子白介素1β、白介素4、白介素6、白介素8、白介素10、转化生长因子β、肿瘤坏死因子α、γ干扰素进行浓度测定；通过建立主成分综合评价模型，根据不同个体的综合得分来对大白猪一般抗病力进行综合指数选育，同时对繁殖性能、生长速度、瘦肉率、胴体品质等性状进行检测和选择，组建第一个世代；
(3)用群体继代选育和分子标记辅助选择的方法，经过4-5个世代，逐步实现既定育种目标，建立新品系核心群。
抗病新品系猪的性能指标为：
抗病力：抗断奶仔猪腹泻和水肿病，并具有很强的抗应激能力和抗逆性。
繁殖性能：新品系猪总产仔数达到22头以上，核心群经产母猪产仔在12.0头以上。
生长性能：达100kg日龄：公：155天，母：165天；30kg－100kg日增重：850g；30kg－100kg饲料转化率：2.4。
1、胴体性状：达100kg活体背膘：公：9.0mm，母：10.0mm。
实施例：
(一)对大白猪核心群采用饲料添加的方法进行f18大肠杆菌(由中国兽医药品监察所购买)感染试验，根据表型鉴定的结果，组建大白猪f18大肠杆菌抗病育种基础群；
1)细菌培养将f18大肠杆菌的单个菌落接种到3～5ml的lb培养基中，并37℃振荡培养过夜(约18h)，次日将细菌用pbs反复离心洗涤3次，并将大肠杆菌菌株与pbs按照1:20的比例进行稀释，调整细菌浓度为4.6×108cfu/l。
2)饲料配制按照断奶仔猪的营养需求饲喂含有21.7％粗蛋白的颗粒饲料，饲料中不含有任何抗生素和微生态制剂，配制不含有抗生素和微生态制剂的饲料，主要是为了避免饲料中抗生素等对试验产生的干扰和影响。
3)e.colif18菌株和轮状病毒的检测攻毒之前，检测所有个体粪便中是否含有f18大肠杆菌和轮状病毒，采用棉花棒在肛门处采集少量粪便，每个肛拭子中加入800ul高压双蒸水混匀，取其中的200ul到另外一个ep管中，取20ul涂布麦康凯平板，其余120℃变性10min，12000r/min×1min，取上清做dna模板，用于检测f18大肠杆菌；剩余的600ul反复冻融2次，用试剂盒提取rna，反转成cdna，-20℃冻存用于检测轮状病毒。粪便dna的pcr扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，只有粪便中均未发现f18大肠杆菌和轮状病毒时，排除了攻毒个体自身携带轮状病毒和大肠杆菌导致腹泻的可能性，才可以进行下一步的攻毒试验。
f18大肠杆菌检测：pcr反应体系：模板dna5.0μl，10×buffer5.0μl，mgcl22ul，dntp混合物3.0μl，f18大肠杆菌(sta和stx2)上下游引物各1.25μl(引物见表1)，taq酶(5u/μl)1.0μl，加双蒸水补足至50μl。pcr扩增条件为：94℃预变性2min，94℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸90s，共进行30个循环，然后72℃后延伸10min，最后放入4℃保存备用。pcr扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测。
轮状病毒检测：pcr反应体系：模板cdna3.0μl，10×buffer2.5μl，mgcl21.0ul，dntp混合物1.0μl，rav-vp7引物各1.0μl(引物见表1)，taq酶(5u/μl)0.5μl，加双蒸水补足至25μl。pcr扩增条件为：95℃预变性5min，95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共进行30个循环，然后72℃后延伸10min，最后放入4℃保存备用，pcr扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测。
表1f18大肠杆菌和轮状病毒检测引物
4)感染试验并选择f18大肠杆菌抗性型个体
试验猪为选取的健康、30日龄大白仔猪，自由饮水，每天喂料4次，一次饲料计量50g，连续饲喂3天。采用饲料添加的方法进行f18大肠杆菌感染试验，将f18大肠杆菌菌株与饲料混合饲喂，每头猪每天接受f18菌株的平均剂量是4.6×108cfu，利用连续进行10天或直至它们出现腹泻症状，在感染试验后，每天对猪的粪便采集进行检测，以“正常”、“糊状”、“水样”对粪便的粘稠度进行记录。只有一直为正常粪便的猪表现为对f18大肠杆菌具有较强的抗性，才可以鉴定e.colif18抗性型个体。
结合常规选种的标准以及初生重、断奶重指标，选留攻毒后表型一直为“正常”的个体，并且在相同饲养管理环境条件下按家系分开饲养，组建大白猪f18大肠杆菌抗病育种基础群。
(二)对基础群中f18大肠杆菌抗性型群体细胞因子(白介素1β、白介素4、白介素6、白介素8、白介素10、转化生长因子β、肿瘤坏死因子α、γ干扰素进行浓度测定；通过建立主成分综合评价模型，根据不同个体的综合得分来对大白猪一般抗病力进行综合指数选育，同时对繁殖性能、生长速度、瘦肉率、胴体品质性状进行检测和选择，组建第一个世代；
在实施本发明之前，课题组在苏太猪(具有50％中国地方猪品种血统的培育品种中)群体利用测定白介素2(il-2)、白介素4(il-4)、白介素6(il-6)、白介素10(il-10)、白介素12(il-12)和β干扰素(ifn-β)来评价群体的一般抗病力，但是在本发明的预备试验中，通过对断奶前后以及断奶时不同健康状况仔猪小样本量细胞因子的测定比较，发现白介素2(il-2)和白介素12(il-12)差异很小，因此不适宜作为评价大白猪的细胞因子，但是也不能推断出适用的指标；因此结合预备试验测定结果、细胞因子的生物学功能以及国内外关于大白猪细胞因子的相关报道，最终选择白介素1β(il-1β)、白介素4(il-4)、白介素6(il-6)、白介素8(il-8)、白介素10(il-10)、转化生长因子β(tgf-β)、肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactor,tnf-α)、γ干扰素(ifn-γ)进行测定，效果显著。
对78头30日龄健康仔猪前腔静脉采血，4℃放置30min，常规分离血清。依次使用对应缓冲液对标准样进行四倍八点浓度梯度稀释，建立标准曲线。同时使用对应缓冲液稀释样本血清，按照操作说明，利用猪多细胞因子检测试剂盒(affymetrix公司，美国)对样本血清进行处理，送入已校正的bio-plex悬液芯片系统中读出对应荧光值，然后通过标准曲线计算样品中细胞因子(il-1β、il-4、il-6、il-8、il-10、tgf-β、tnf-α和ifn-γ)的浓度。
1)主成分分析
利用spssl6.0统计软件的factor模块对上述免疫指标进行主成分分析。
1、原始数据的无量纲化
设有n个样本，p项指标：
2、计算相关系数(r)，建立相关矩阵(r)
3、求解相关矩阵r的特征根，确定主成分
利用spssl6.0factor模块求相关矩阵r的特征值，累计贡献率及特征向量。为了保留p维空间的信息量和简化计算，一般选择k个较大特征根，使累计贡献率
4主成分综合评估
采用加权算术平均来综合，并以各主成分的方差贡献率为权重。
2)综合选择指数的确定
18个细胞因子测定值间的相关分析
对78头大白猪8个细胞因子进行测定(见表2)，并将整理后的各指标值无量纲处理，相关矩阵见表3。从表3可以看出，8个测定变量之间均呈一定程度的正相关。
表2大白猪8个细胞因子的测定值
表3大白猪8个细胞因子的相关矩阵
2主成分分析
按照主成分分析中关于累积贡献率和特征向量的生物学含义，累积贡献率为各复合性状相对于所有复合性状对于遗传方差的贡献的百分率；负荷值(特征向量)表示对复合性状贡献的大小，其绝对值反映了各性状对该主成分作用的大小和性质。通过对8个指标的主成分分析，得到各主成分的特征根及方差贡献率。由表4可知前5个主成分对总方差的贡献率达到了87.721％>85％，基本上反映了原所有细胞因子包含的全部信息，可以用作大白猪细胞因子综合评估模型的建立，且评价的可信度为87.721％。根据入选主成分的特征向量(表5)，5个入选主成分可分别表达为公式f1～f5，具体主成分表达式模型见表6。第一主成分的贡献率为39.963％，对总方差的影响最大，从公式f1可以看出，第一主成分主要结合了il-1β、il-4、tgf-β和tnf-α等的变异信息。
表4各主成分的特征根和贡献率
注：表中特征根代表各复合性状遗传方差大小，各特征根的累计贡献率代表各复合性状遗传方差贡献的百分率。
表5入选主成分的负荷值
3主成分综合评价
因为前5个主成分在总变异的方差中的贡献率超过85％，所以用各主成分的方差贡献率为权，计算前5个主成分的加权平均数，其公式如下，具体计算公式为：fi＝(39.963f1+21.722f2+10.612f3+9.269f4+6.154f5)/87.721。将f1～f5代入上式，简化后的综合主成分计算公式如下：fi＝0.164zx1+0.209zx2+0.223zx3+0.446zx4+0.412zx5+0.232zx6+0.396zx7+0.303zx8，其中zx1、zx2、zx3、zx4、zx5、zx6、zx7、zx8分别为il-1β、il-4、il-6、il-8、il-10、tgf-β、tnf-α和ifn-γ测定值的标准化数据。
从综合评估公式fi中不难发现il-8、il-10、tnf-α和ifn-γ对大白猪的一般抗病力影响较大。
表6主成分表达式(模型)
注：il-1β(zx1),il-4(zx2),il-6(zx3),il-8(zx4),il-10(zx5),tgf-β(zx6),tnf-α(zx7),ifn-γ(zx8)。
本试验选取的8个免疫指标间均呈正相关，如果这种相关性较高的指标直接进行分析，可能会带来严重的共线性问题，这也充分说明主成分分析适用于本研究。本试验选取了5个主成分来反映大白猪一般抗病力的综合水平，其中第一主成分能够最大限度地结合原始信息，是概括指标差异信息的最佳线性函数；此外，所有主成分加权综合会提高评价函数区分的有效度，从而提高评估的准确性。在主成分负荷矩阵中，负荷值实际上就是变量与因子的相关系数，它的平方就表示该因子解释该变量的方差比例。因此当负荷值小于0.3时，说明该因子对该变量变异的解释度小于10％，从实用的角度看可以忽略。
从综合评估公式来看，il-8、il-10、tnf-α和ifn-γ的负荷值均大于0.3，对评估模型的影响最大，可以解释综合主成分。白细胞介素10(interleukin-10，il-10)是一种重要的免疫调节性细胞因子，其生物学功能主要是限制炎症反应，调节免疫细胞的分化和增殖，大量研究证实il-10对炎症、恶性肿瘤、自身免疫性疾病起重要作用。肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,tnf)主要作用是调节免疫细胞的功能，通过诱导产生il-1、il-2和il-6引发炎症，促使细胞凋亡，阻止肿瘤发生、病毒复制及病原菌的增殖等。作为tnf的重要组成部分，tnf-α是维持内稳态和抵御病菌至关重要的细胞因子。干扰素γ(interferongamma，ifn-γ)主要由活化的t细胞和nk细胞产生，对机体免疫系统具有强大的调节作用，是机体发挥免疫功能、清除体内病原体不可缺少的成分；大量研究表明，猪干扰素对生产有重大威胁的传染病病毒(如prrsv、tgev、hcv等)均具有防御和抑制作用。作为多功能因子，il-8虽然在肿瘤免疫方面具有双重性作用，但据报道多种微生物及其产物可刺激机体产生il-8，表明il-8在抗微生物感染中发挥重要作用；发生炎性疾病时，炎症灶内存在的白细胞与il-8有关，il-8对白细胞具有化学激动和趋化效应，使白细胞游走能力加强，并增进白细胞产生抗感染免疫应答。根据上述4个细胞因子的生物学功能，其测定值越大则标准化数值也越大，即其一般抗病力越强。
3)大白猪一般抗病力的评估模型的验证
在全场30日龄断奶仔猪中，选取15头出现腹泻症状的断奶仔猪和15头健康的断奶仔猪作为验证一般抗病力模型的个体，同样按照上述方法采血制备血清，获得血清样品后利用猪多细胞因子检测试剂盒(affymetrix公司，美国)对白介素1β(il-1β)、白介素4(il-4)、白介素6(il-6)、白介素8(il-8)、白介素10(il-10)、转化生长因子β(tgf-β)、肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactor,tnf-α)、γ干扰素(ifn-γ)进行浓度测定。分别对大白猪健康组(15头健康的断奶仔猪)和腹泻组(15头出现腹泻症状的断奶仔猪)第一主成分(f1)至第五主成分(f5)以及主成分综合(fi)得分进行计算，健康组和腹泻组大白猪的综合得分分别为0.080和-0.009(表7)。
表7健康组和腹泻组大白猪细胞因子主成分及综合得分
仔猪在断奶时，在外界病原、环境因素以及断奶应激等因素的作用下，部分个体可能会出现腹泻症状，对腹泻抗性和易感性也在一定程度上反映了断奶仔猪的一般抗病力和免疫应答能力，因此选取15头出现腹泻症状的断奶仔猪和15头健康的断奶仔猪作为验证一般抗病力模型的个体，在综合得分方面，健康组和腹泻组大白猪的综合得分分别为0.080和-0.009，初步验证了本发明建立的一般抗病力模型可以为大白猪一般抗病力的早期选育提供了一定的指导和依据。
(三)组建第一世代
按照育种规划，采用高选择差法以及个体与家系相结合的选择方法组建基础群，根据组建基础群的要求，首先将后备猪按照家系分组，在每个家系内选择fi值高的个体，选择个体的数目按照每个世代需要选留的后备猪数量来确定。也就是在考虑家系亲缘关系的前提下，选择家系内fi值高的个体。
对一般抗病力强的个体实行选择，运用blup模型进行种猪的遗传评估：测定的主要项目有繁殖性状(总产仔数、活产仔数(主选性状、初生重、21日龄窝重、产仔间隔)、肥育性状(达100kg日龄、30kg－100kg日增重、30kg－100kg饲料转化率)、胴体性状(达100kg活体背膘)、体型外貌，同时剔除出现遗传损征的个体；通过测定和评定，选留符合育种目标的个体；
断奶阶段选择：此阶段许多性状还没有表现出来,因此主要是以多留为原则，剔除不合格的整窝及生长发育差的个别猪只，原则是：剔除出现遗传缺陷的整窝猪，所有公猪去势处理；根据亲代成绩，剔除繁殖指数过低的整窝猪，所有公猪去势处理；在保证每窝至少有3头公猪的前提下，将体重低、外形差、生活力弱的所有公猪去势处理。
75日龄阶段(保育结束时)选择：此阶段的选择主要依据个体本身生长发育进行选择，仅淘汰生长发育差，或有遗传缺陷，的猪只。因采用的是“全进全出”的饲养模式，在断奶阶段选择剔除的猪只是在此时进行剔除出群的，原则是：剔除出现遗传缺陷的整窝猪，所有公猪去势处理；在保证每窝至少有2头公猪的前提下，将体重低、生长发育差、生活力弱的所有公猪去势处理；在保育出猪时，将在断奶阶段和此阶段选择剔除的猪只剔除至育肥舍，剩下的种猪转入后备舍或种猪测定舍。
5－6月龄阶段选择：5－6月龄时，猪只重要的生产性状(除繁殖性能外)都基本表现出来。因此，这一阶段是选种的关键时期，应该精选。原则是剔除体质衰弱、肢蹄存在明显疾患、有内翻乳头、体型有严重损征、外阴部特别小、同窝出现遗传缺陷、体形外貌不符合选育目标要求的猪只；其余猪只均进行测定，按照综合选择指数进行选留或淘汰。
母猪繁殖配种阶段选择：此阶段主要是依据猪只本身的繁殖性能进行选择。原则是同批次的后备母猪应在1个月内集中配种完毕，1个月后淘汰未能发情配种的后备母猪；集中配种后，淘汰流脓、非正常返情的个体；正常返情的个体转入生产群中再次配种，若再次返情者淘汰；初产时，淘汰母性太差的个体；对进入生产群繁殖了3胎的母猪，发现其繁殖性能特别优秀者，可再次纯繁1胎；对于其繁殖性能较差的，则后代不留种。
(四)用群体继代选育和分子标记辅助选择的方法，经过4-5个世代，逐步实现既定育种目标，建立新品系核心群。
1)统一场内测定性状、测定方法及数据库结构，将统计的各项测定数据输入gbs遗传评估软件，采用多性状动物模型blup法对种猪进行遗传评估，估算单性状的育种值和多性状综合选择指数(如生长指数、繁殖指数、父系指数、母系指数等)，根据测定评估数据并结合现场观察来严格选择，只有最优秀者才被入选为核心群。
2)世代选育，结合分子标记辅助选择(mas)，实施分子育种与常规育种相结合，对个体繁殖性能进行早期选择，提高选择准确性，缩短世代间隔，从而加大年遗传进展。对特别优秀的个体允许适当的世代重叠，提高群体中高产基因频率，通过不断合理调整、优化核心群的结构来进一步选育提高大白猪抗病新品系种猪的各项生产繁殖性能。
在组建大白猪抗大肠杆菌病群体的基础上，测定不同发育时期干扰素、白介素等细胞因子及主要抗体水平等免疫应答指标，在分析免疫应答指标及其与生长发育关系的基础上，确定免疫应答和一般抗病力的评价指标并纳入常规选种选育体系，筛选有效的一般抗病力分子标记并进行育种效率评估，选留一般抗病力强的个体，同时对繁殖性能、生长速度、瘦肉率、胴体品质等性状进行检测和选择，组建第一个世代；用群体继代选育和分子标记辅助选择的方法，经过4-5个世代，逐步实现既定育种目标，建立新品系核心群，有望降低仔猪腹泻疾病的发病率，培育具有抗大肠杆菌病和一般抗病力强、生长速度快的大白猪抗病新品系，从根本上为实现种猪的健康高效养殖奠定基础，取得可观的社会效益、经济效益和社会效益，该方法还可以为其他猪品种的抗病育种和新品系选育提供指导。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。