本发明涉及杀菌领域，尤其涉及一种复合杀菌微球及其制备方法和应用。
背景技术：
目前常用的饮用水及饮料常用的杀菌方法分别为：热杀菌和非热杀菌。其中，热杀菌主要有：湿热杀菌、干热杀菌、微波杀菌、电热杀菌和电场杀菌等；非热杀菌主要有：化学与生物杀菌、辐照杀菌、紫外线杀菌、脉冲杀菌、超高静压杀菌、脉冲电场(pef)杀菌以及振动磁场杀菌等。热杀菌又可分为高热杀菌和低热杀菌。高热杀菌是利用高温使微生物蛋白质变性以达到杀菌的目的。虽然高热杀菌的杀菌速度较快，杀菌也较为彻底，但往往会破坏液体饮料的营养及品质。低热杀菌最常见的是巴氏杀菌，也是目前最常用的液体食品杀菌技术，简单方便。但其设备较为庞大，而且相比常温杀菌还是需要较多的能耗。化学杀菌是非热杀菌中最常见的方法，也是目前饮用水杀菌的常规方法，其多利用氧化型杀菌剂产生的次氯酸、原子态氧等，使微生物体内一些与代谢有密切关系的酶发生氧化作用而杀灭微生物。但氧化性杀菌剂有它不可克服的缺点：当水源中有机物含量稍高，氯气杀菌将产生氯代有机物，可致癌；稳定性欠佳，易分解，运输贮藏成本高，并存在爆炸等潜在威胁。如果能开发一种价格经济、使用简单、高效、安全的新型杀菌剂，不破坏营养成分的同时，无有害物质残留，而且无需过多专业知识即会使用，非但能改善现做饮料的卫生状况，还可以提高罐装水和饮料的安全，成为提高水质的关键技术之一。
技术实现要素：
本发明提供一种复合杀菌微球及其制备方法，用来解决现有技术中可溶性杀菌剂残留水体的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
1)以氯甲基化聚苯乙烯珠球(俗称氯球)为母体，在n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中浸泡过夜，使载体充分溶胀；
2)在步骤1)的所得物中加入配体5-巯基-1-甲基四唑(mmt)，在90℃的条件下搅拌反应12h，并且全程通氮气保护；
3)将步骤2)所得到的微球滤出，然后用dmf浸泡洗涤直至洗涤液无色或微球表面无明显附着物，用蒸馏水洗涤后，再用naoh水溶液浸泡，经过一系列洗涤后过滤，将微球置于50℃下真空干燥备用；
4)功能基试剂接枝微球后的季铵化反应如下：步骤3)所得物与环氧丙烷在20℃下搅拌反应6h后，再加入苄氯，常温下搅拌反应6h后滤出，并用无水乙醇和蒸馏水反复洗涤数次至表面无环氧丙烷残留，过滤后将微球置于50℃下真空干燥，即得到不溶的固定化杀菌微球；
5)将步骤4)中所得物结合银离子，测定其杀菌效果。
较佳地，步骤1)dmf的用量为40.0ml，浸泡的氯球用量为60.0mg；
较佳地，步骤2)母体和配体的摩尔比为1:5；
较佳地，步骤3)洗涤所用试剂顺序依次为：蒸馏水、无水乙醇、丙酮、乙醚；
较佳地，步骤4)加入环氧丙烷的量为30.0ml，苄氯的用量为75.0ml。
复合杀菌微球在饮用水或饮料杀菌中的应用。能有效地杀灭饮用水中的微生物，避免水溶性杀菌剂带来的“二次污染”和水体残留问题。
本发明相对于现有技术，具有以下优点：
1.本发明所用的原材料是一种极易改性修饰的树脂氯球，它有较高的机械强度和物理稳定性，具有耐溶胀，耐氧化，耐磨损，耐温度变化，不易碎裂，再生方便等优点，来源广泛，价格低廉，同时由于其有较高的化学反应活性基团氯甲基(–ch2cl)，能固定更多不同类型的杀菌功能基，性能稳定，固载量大，杀菌效果也能够更高。本发明创造性地选用多元含氮杂环作为氯球固载的功能基因子，而且负载了具有杀菌性能的银离子。与目前常见的长链季铵盐杀菌剂相比，不仅具有功能基不易从母体上脱落，不会造成杀菌剂失效和“二次污染”的优点，而且还可以有效地克服直链季铵盐长期使用后会产生抗性影响其性能的缺点；与无机载银杀菌剂相比，银离子不易溶出，降低了环境污染，具有明显的经济效益。
2.本发明提供的新型固定化杀菌剂的反应路线简单，合成方法操作方便，只需要母体接枝功能基试剂、接枝后季铵化和吸附银离子三步反应即可完成，反应条件容易实现，无需大型仪器设备，所以容易实现批量生产及自动化控制，具有良好的应用前景。
3.本发明提供的新型杀菌微球主要有以下四点性能优势：1)用量少，杀菌效率高，且在杀菌过程中具有持续时间久，基团不易从载体中脱落，银离子不易溶出等优点，比小分子杀菌剂有更好的杀菌性能；2)杀菌微球较难进入动植物体内，可以有效避免由杀菌剂本身造成的“二次污染”；3)本发明提供的杀菌微球是水不溶性的，可有效克服可溶性杀菌剂残留水体的问题，且微球可回收，可重复使用，能够提高资源的利用率；4)本发明提供的有机载银杀菌剂不仅可以有效克服现行的无机载银杀菌剂制备技术复杂、难度大、成本高、难以大批量生产、用量多、使用过程中容易溶出等缺点，而且还可以回收环境中的银离子，减少资源浪费和环境污染，更能提高杀菌性能，达到一举多得的目的。
附图说明
图1是微球合成装置搭建示意图；
图2所示为氯球、mmtr、mmtr-ag的红外光谱图；
图3所示为mmtr-ag复合杀菌微球对大肠杆菌的杀菌率随时间变化曲线；
图4所示为mmtr-ag复合杀菌微球对金黄色葡萄球菌的杀菌率随时间变化曲线；
图5所示为浓度为mbc的mmtr-ag复合微球对大肠杆菌的平板作用效果；
图6所示为浓度为mbc的mmtr-ag复合微球对金黄色葡萄球菌的平板作用效果；
图7所示为浓度为mbc的mmtr-ag对矿泉水和生理盐水中e.coli的杀菌率变化曲线对比图；
图8所示为浓度为mbc的mmtr-ag对矿泉水和生理盐水中s.aureus的杀菌率变化曲线对比图；
图9所示为浓度为mbc的mmtr-ag在自来水中杀菌率变化曲线；
图10所示为复合微球mmtr-ag在自来水杀菌前后的扫描电镜图；
图1中，1-三颈瓶，2-冷凝管，3-搅拌棒，4-温度计，5-氮气管道。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
量取40ml反应溶剂至容积为100ml的三颈烧瓶中，并加入60.0mg母体(氯球)浸泡过夜。母体充分溶胀后，向三颈烧瓶内加入一定摩尔比的5-巯基-1-甲基四唑和催化剂金属钠，在一定的温度下搅拌反应，并且反应全程通氮气保护。反应12h后，将三颈烧瓶内微球滤出，然后用反应溶剂浸泡洗涤直至洗涤液无色或微球表面无明显附着物，用蒸馏水洗涤后，再用naoh水溶液浸泡，水洗，再依次用无水乙醇、丙酮、乙醚反复洗涤数次后，过滤微球置于50℃下真空干燥备用。
本发明用傅里叶红外光谱仪对所合成的新化合物mmtr-ag进行了结构表征：如图2所示为载体ps-cl、mmtr和mmt-ag的红外光谱图。由三种微球的红外图谱对比可知，在mmtr-ag中，原来mmtr中1311cm-1的c-n伸缩振动峰减弱，1047-1521cm-1的四唑谱带消失，1679cm-1的c＝n伸缩振动吸收峰。从红外图谱中可推断，ag+主要是由于mmtr中的五元杂环吸附，所以对环内的各个基团的振动均产生影响，从而反映在红外图谱中。
合成微球的季铵化：将按上述过程的所得物放入250ml的三颈烧瓶内，用氮气将瓶内空气排尽后加入30ml的环氧丙烷，20℃下搅拌反应6h后，留向瓶内加入75ml的苄氯，常温下搅拌反应6h后滤出，并用无水乙醇和蒸馏水反复洗涤数次至表面无环氧丙烷残留，过滤后将微球置于50℃下真空干燥，得到不溶的固定化杀菌微球(以下简称mmtr)。
载银复合杀菌微球的制备：准确称取15.0mg的mmtr于100ml的碘量瓶中，加入25.0ml不同ph的hac-naac缓冲液充分溶胀后，加入浓度为1.0mg·ml-1的ag+溶液5.0ml(由硝酸银配制而成)，不加入微球组为对照试验，常温下恒温振荡，转速100rpm·min-1，至吸附平衡后取上清液测定溶液中剩余ag+含量，根据以下公式推算吸附量q。负载ag+后的杀菌微球称之为复合杀菌微球(以下简称mmtr-ag)。
式中；co－吸附前金属离子浓度(mg·ml-1)，ce－吸附平衡后金属离子浓度(mg·ml-1)，q－树脂的静态饱和吸附量(mg·g-1)，v－溶液体积(ml)，m－树脂的干重(g)。
对比例1
将实施例1中的反应溶剂、反应温度、搅拌转速及反应摩尔比根据下表对应组合进行对比实验，从而获得不同转化率的mmtr。
表1不同转化率的mmtr合成条件
由表1可知，mmtr的最佳反应条件为：反应溶剂为dmf，反应温度为90℃，5-巯基-1-甲基四唑与氯球的反应摩尔比为5：1，mmtr的转化率为91.3％。
对比例2
将实施例一的配体5-巯基-1-甲基四唑(mmt)改为3-氨基-5-巯基-1,2,4-三氮唑(att)，腺嘌呤(at)，其余按实施例一操作，得到以下结果：
表3不同配体的转化率
由表3可得：mmt作配体时，杀菌微球的合成率最高。
对比例3
将实施例一的配体5-巯基-1-甲基四唑(mmt)改为2-氨基苯并咪唑(abm)，将ph值得范围控制在3.0-6.0之间，其余按实施例一操作，得到以下结果：
表4不同ph值下mmtr、abmr对ag+的负载量
由表4可知，mmtr对ag+有一定的吸附能力外，而abmr则对ag+几乎不吸附。当ph＝5时，mmtr对ag+的负载效果最佳，容量为52.01mg·g-1。ph低时，溶液中h+浓度大，干扰mmtr对ag+的吸附，随着ph增大，干扰作用减小，负载量不断提高。当ph＝6时，溶液中oh-含量增大，同微球竞争与ag+结合，造成吸附量的下降。
实验1:复合杀菌微球杀菌实验
本实验以革兰氏阴性代表细菌大肠杆菌(e.coli)cicc21524和革兰氏阳性代表细菌金黄色葡萄球菌(s.aureus)cicc10384作为受试菌，这两种菌种均购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。具体实验操作步骤及评价方法如下：
所有菌株均作为储备培养物辅以15％(v/v)甘油的营养肉体培养基中，保持于-20℃储存。菌株置于在lb培养基内，37℃恒温振荡器中培养18小时；活化后用移液枪取出一定量菌液，在4000rmp下离心洗涤。将所得菌斑用0.85％的生理盐水通过十倍稀释法稀释成浓度约为106cfu/ml的菌悬液备用。
杀菌活性测试
取若干无菌的100ml摇瓶，加入50ml上述制备的菌悬液；在样品组中加入一定量充分溶胀的杀菌微球mmtr、mmtr-ag，对照组不加入杀菌微球；振荡各混合液，接触不同时间后，根据gb/t4789.3-2010提供的方法，将不同接触时间上清液分别逐级稀释，稀释至适宜浓度后用玻璃涂布棒涂匀，倒置平板于37℃下培养进行平板活菌计数。通过以下公式计算微球杀菌率：
为提高杀菌率的准确性，杀菌率由同一时间点对照组和样品组取样进行平板计数后结果根据公式计算得到。
表5所示为杀菌微球mmtr和复合杀菌微球mmtr-ag对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度。其中，杀菌时间为6h。
表5mmtr、mmtr-ag+对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(mbc)
由表5可知，负载银离子后，复合杀菌微球的杀菌能力比负载前提高。
实验2:复合杀菌微球的重复使用
复合杀菌微球的解吸性能关系其ag+的回收效率，同时对探讨复合微球杀菌过程中ag+残留水体的情况显得尤为重要。选用hcl+5％硫脲作为洗脱剂，探讨不同浓度的洗脱剂剂对复合微球的洗脱效果。根据表6可知，1.5mol·l-1hcl+5％硫脲对复合杀菌微球有较好的洗脱效果，最佳洗脱率为98.04％，表明mmtr-ag具有良好的解吸性能，在回收水体中的ag+中有较好的应用前景，同时回收的量也说明复合微球在杀菌过程中几乎无ag+残留。
表6不同浓度解吸剂对复合杀菌微球的解吸率
银离子具有较好的杀菌性能，但是常用的制备银离子杀菌剂的方法都较为繁琐，需要高温、剧烈搅拌等条件，相比之下，本发明具有操作简单，条件温和的优势。大部分负载银离子的载体本身不具备杀菌性能；而本发明中，负载银离子后，mmtr-ag的mbc较mmtr低，表明其杀菌效率有所提高。一些负载银离子的杀菌剂，其杀菌主要依赖于银离子的缓释，而银离子进入环境，除造成水体污染，危害健康外，还会造成资源的浪费。而其他固载银离子的杀菌剂，鲜有考察其杀菌过程中银离子的脱落情况。本发明利用适当的洗脱剂，对杀菌后的复合杀菌微球进行洗脱，测定银离子的洗脱量，可以间接推断杀菌过程复合杀菌微球上银离子的变化情况。银作为一种贵金属，具有较高的经济价值，复合杀菌微球上银离子的洗脱回收量是评定复合杀菌微球性能的标准之一，有助于提高经济效益，提升资源利用率。
实验三：复合杀菌微球在自来水中的实际应用
(1)矿泉水
菌株活化后用移液枪取出一定量菌液，在4000rpm下离心洗涤。将所得菌斑用矿泉水调节浓度为106cfu·ml-1的菌悬液备用。
取若干无菌的100ml摇瓶，加入50.0ml上述制备的菌悬液；在样品组中加入上述杀菌实验的最低杀菌浓度的杀菌微球，空白组不加入微球。振荡各组溶液，接触不同时间后，将不同接触时间上清液分别逐级稀释，进行平板活菌计数。通过上述公式计算微球杀菌率，其中计算杀菌率所用的均为同一时间点样品组和对照组进行平板计数的结果。
利用平板计数法测试所购的矿泉水的本身的含菌情况，未有明显菌落检出。图7、8分别是浓度为mbc的复合杀菌微球作用于矿泉水和生理盐水中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌杀菌率曲线对比图。从图中可看出该微球在矿泉水中杀灭大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的时间均比在生理盐水中有所延长，但与大肠杆菌作用一定时间后还是能够达将活菌全部杀死，与金黄色葡萄球菌充分接触后，受试菌的数量下降程度也达到90％以上。
矿泉水是从地下深处自然涌出的或经人工揭露的、未受污染的地下矿水，含有一定量的矿物盐、微量元素或二氧化碳气体。mmtr-ag复合微球与矿物质作用的活性位点由ag+所占据，矿物质难以与复合微球结合，但复合微球作用受试菌在矿泉水中的杀菌率上升速度也慢于在生理盐水中，初步推断可能是由于矿物离子粘附于微球表面或某些离子与ag+存在相互作用，所以导致复合微球在矿泉水中的的杀菌效果较在生理盐水中差。
(2)自来水
自取的自来水经过平板计数法测定，其中菌落总数约为85cfu·ml-1，符合城市自来水的国家标准(gb5749-2006)。取若干无菌的100ml摇瓶，加入50.0ml的自来水；样品组中加入一定量充分溶胀的杀菌微球，对照组不加入杀菌微球；振荡各混合液，接触不同时间后，将不同接触时间上清液分别逐级稀释，进行平板活菌计数。仍然以公式计算杀菌率。
通过上述实验测得mmtr-ag作用于自来水时的最低杀菌浓度(mbc)为0.2mg·ml-1，图9为mmtr-ag在自来水中杀菌率与时间关系的曲线。结果显示该微球菌可将自来水的菌全部杀死，证明其具有良好的广谱抗菌性和应用前景。自来水中总菌数不多，但自来水中含有许多无机盐、金属离子或其他小分子物质。mmtr-ag由于ag+的存在，吸附金属离子的活性降低，但其他杂质仍然会粘附在其表面。而且自来水中含有多种不同类型的菌，微球与不同的菌作用时间不一样，所以复合微球需要与自来水接触足够的时间后才能将其中的活菌全部杀灭。
由图10电镜扫描图可以看出复合微球mmtr-ag并非光滑，其表面被ag+覆盖，且由于ag+在表面的吸附，也使得复合微球的颜色与mmtr存在差别。复合微球杀菌后表面出现部分片状物质，可能是由于杀菌微球作用于细菌活细胞时使其破裂，内容物流出后与细胞膜碎片共同覆于微球表面造成的。
上述实施例不以任何方式限制本发明，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。