本发明涉及生物细胞保藏领域，具体而言，涉及一种精子干燥液以及精子保存的方法。
背景技术：
：精液的保存是为了延长精子在体外的存活时间并维持其受精能力，使精子可以不受时间与地域的限制，进行长时间、远距离的运输。便于开展省际、国际间的交流合作，有利于提高优良公畜的利用率和遗传资源的长期保存，在保种、品种改良、引种和人类生殖医学等方面都具有重要意义。在自然状态下，精子离体后寿命只有几个小时，必须经过一定的处理之后才能实现长途运输。传统的精子保存方法是将精液冷冻后保存在液氮或干冰中，这种低温冷冻保存技术需要液氮或干冰，液氮不仅要特殊的钢质罐，而且还有很大的危险性，这给运输带来了很大的不便，干冰则在室温下容易融化，不利于精子在室温下的长时间运输。自从胞浆内单精子注射技术(ICSI)得以应用，许多更简单的保存精液的方法得以研究，包括冷冻干燥法和蒸发干燥法。精液干燥后不仅可以在4℃条件下长时间保存，而且可以在室温条件下运输和短期保存，同时干燥保存法不需要液氮，贮存空间小，运输成本低，所以它比常规低温冷冻保存更经济，更实用。虽然干燥的精子已失去运动能力和自然受精能力，但是它们有很高的染色体完整率，通过胞浆内单精子注射技术，仍然可以与卵子结合并发育成胚胎。与冷冻干燥法相比，蒸发干燥法具有在干燥过程中不需要冷冻干燥所需要的冻干机器，精液采集处理过程方便等优势。然而精子遗传物质的完整性是实现受精和胚胎发育的前提，现有技术中，应用蒸发干燥法干燥后精子的完整性和胞浆内注射后受精率和胚胎发育率都要低于冷冻干燥法。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种精子干燥液，其具有高效、方便、对细胞无毒性等优点，可以有效保护精子并降低在干燥过程中对精子造成的物理损伤和化学损伤，显著提高精子完整率，使得胞浆内注射精子后能有效的激活卵子，提高胚胎的发育率。本发明的另一目的在于提供一种精子保存的方法，该方法简单易操作、廉价且不需要用到制冷设备，特别适合野外采集、收集野生动物精液。其处理过的精子便于保存和进行长时间、远距离的运输。用该方法长期保存后的精子仍能保持较高的完整率和胚胎发育率。本发明的实施例是这样实现的：一种精子干燥液，每升精子干燥液包括：氯化钠6～7g、氯化钾0.2～0.3g、氯化钙0.3～0.6g、氯化镁0.05～0.1g、碳酸氢钠2～3g、磷酸钠0.03～0.05g、葡萄糖1～1.2g、4-羟乙基哌嗪乙磺酸2.5～3g、棉籽糖10～50mmol和余量的水。一种精子保存的方法，包括：将稀释后的精液离心去除精清后与精子干燥液混合，得到精子悬浮液；将精子悬浮液蒸发干燥后保存。本发明实施例的有益效果是：本发明所提供的一种精子干燥液，能够模拟精子生长状态下的环境状态，具有维持渗透压、控制酸碱平衡、供给细胞生存代谢所必需的能量和无机盐成分等作用，可提供精子在体外生存并维持一定代谢活动的基本需要。在本发明中，在该精子干燥液中加入了一定量的棉籽糖，棉籽糖不但是主要非电解质，可缓和精浆的电离程度，而且是精子离体后的主要能源物质，也是稀释液中调节渗透压的重要物质之一。同时，棉籽糖的分子量较大，较之小分子的糖能够更好地对精子进行保护，提高精子的完整性。本发明所提供的一种精子保存的方法，其采用离心法去除精液中的精清，再与上述精子干燥液混合，最后采用蒸发干燥法进行干燥。整个过程操作简单，不需要复杂的冷冻、干燥设备，其处理后的精子可以进行长时间保存，而依然保持较高的完整性，特别适合野外采集、收集野生动物精液。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本发明实施例的一种精子干燥液以及精子保存的方法进行具体说明。一种精子干燥液，每升精子干燥液包括：氯化钠6～7g、氯化钾0.2～0.3g、氯化钙0.3～0.6g、氯化镁0.05～0.1g、碳酸氢钠2～3g、磷酸钠0.03～0.05g、葡萄糖1～1.2g、4-羟乙基哌嗪乙磺酸2.5～3g、棉籽糖10～50mmol和余量的水。该精子干燥液中富含多种无机盐类成分，具有维持渗透压、控制酸碱平衡的作用。同时，该精子干燥液还含有葡萄糖、棉籽糖等糖类成分，可以供给细胞生存代谢所必需的能量。在无机盐类成分和糖类成分的共同存在下，该精子干燥液能够模拟出生物体内精子生长状态下的环境状态，提供精子在体外生存并维持一定代谢活动的基本需要。本发明中，在该精子干燥液中加入了一定量的棉籽糖。棉籽糖(Raffinose)是自然界中最知名的一种三糖，由半乳糖、果糖和葡萄糖结合而成。其有较好的溶解性，易溶于水，微溶于乙醇等极性溶剂，不溶于石油醚等非极性溶剂。同时，其具有较好的热稳定性和酸稳定性，能够在一定的高温和强酸性下不发生分解。与其他低聚糖不同，棉籽糖晶体粉末含有5分子结晶水，即使在相对湿度90％的环境下也不会吸湿结块，相比其他低聚糖粉末较强的吸湿性。在保存精子的过程中，棉籽糖不但是主要非电解质，可缓和精浆的电离程度，而且是精子离体后的主要能源物质，也是稀释液中调节渗透压的重要物质之一。同时，棉籽糖的分子量较大，较之小分子的糖能够更有效稳定精子质膜的蛋白－脂质复合物，保护精子质膜免受氧化，从而提高精子的完整性。优选地，每升上述精子干燥液包括：氯化钠6.5～7g、氯化钾0.25～0.3g、氯化钙0.35～0.5g、氯化镁0.07～0.1g、碳酸氢钠2.4～2.8g、磷酸钠0.04～0.05g、葡萄糖1～1.1g、4-羟乙基哌嗪乙磺酸2.6～2.9g、棉籽糖10～50mmol和余量的水。在该优选值下的精子干燥液，对精子的保存效果更佳，能有效保持精子的完整性。该精子干燥液的pH值为7.2～7.6，优选为7.4。该pH范围是生物体内精子生长状态下的pH值，能够有效增加精子在体外存活的时间，利于保证精子的保存。一种精子保存的方法，包括：将稀释后的精液离心去除精清后与上述精子干燥液混合，得到精子悬浮液。所用精液最好为新采集的新鲜精液，其精子的活力大概在75～98％，随着时间的推移，精子活力逐渐下降，并逐渐死亡。新采集的精液需要用稀释液进行稀释，其中，稀释液按重量份数计，包括：葡萄糖5～10份，柠檬酸钠0.5～1份，水80～100份。在本发明中，将精液与稀释液按质量比1：0.8～1.2进行混合，该比例为发明人结合自身经验与创造性劳动得到的优选值，在该比例范围内对精液进行稀释，可以使稀释后的精液中精子的浓度在1×106～1.2×106个/mL的范围内，从而获得最佳的稀释效果。对精液进行稀释可以降低精子的新陈代谢速率，同时，稀释液中的糖分也可以为精子提供营养。除了提供营养之外，糖分还能够在亲水组织中替代水分子，而这一特性就可以对细胞在经历快速的温度变化过程中起到保护细胞膜的作用。糖分还可以通过增加稀释液的黏性来改变稀释液的有效性，这样能够防止冰晶的形成且易于形成玻璃体化。并且，糖分还可以阻止由极度脱水所伴随的体积、渗透压变化而引起的膜破坏。进一步地，离体后的精液通过离心的方法去除精清。精清成分非常适合精子生存，对精子起营养和支持作用，但有研究认为精清中同时存在着许多尚未被人类所了解清楚的蛋白质成分，在多种动物的精清中已发现许多抗生育因子，如去能因子、人类抗生育因子、兔顶体稳定因子、牛精浆素和山羊卵黄凝结酶等，这些因素通过抑制精子的获能、顶体反应的发生、诱导顶体酶的提前释放等机制影响精子活力。多数研究认为精液保存需要进行去精清处理，主要是精清中的磷脂酶或类磷脂酶等物质对精子的品质十分不利。去除精清的方式有很多，其中，离心是最简单、最直接的去除精清的方法，其需要的设备简单，操作方便，去除效果佳。优选地，将稀释后的所述精液在分离因数为600～800g的条件下离心2～5min。在该条件下离心可以在保证不对精子造成过度损伤的情况下达到最好的分离效果。离心时间过长或转速过高，都会使精子因相互积压而造成损伤，从而影响精子活力。去除精清后的精液需要与精子干燥液进行混合，并形成精子悬浮液。精子干燥液中所包含的盐分和糖分可以模拟精子在体内的生存环境，维持精子生存环境的渗透压和pH值，可以有效提高精子的完整性。同时，精子干燥液中所包含的糖分，与稀释液中的糖分类似，同样可以起到提供能量和保护精子细胞膜的作用。其中，精子悬浮液中精子的浓度为1×106～2×106个/mL。该范围值是发明基于自身经验结合创造性劳动得到的优选值，在该范围内的精子悬浮液，后续干燥过程中，干燥效果佳，且盐分和糖分含量合适，能最大限度的保证精子的完整性。本发明提供的一种精子保存的方法，还包括：将精子悬浮液蒸发干燥后保存。优选地，精子悬浮液的蒸发干燥条件选择在室温下自然蒸发干燥20～40min。自然蒸发的过程操作简单，无需任何复杂设备，成本低、效率高，具有即时性且不受地域条件的限制，特别适合野外采集、收集野生动物精液情况。进一步地，可以先将精子悬浮液分散成体积为10～30μL悬浮液滴，再进行自然蒸发干燥。分散后的精子悬浮液与空气的接触面积增大，可以增加干燥效果。悬浮液滴的体积大小是发明人结合自身经验与创造性劳动得到优选值，在体积范围内悬浮液滴的干燥速度快，干燥效果好，且干燥后的精子密度适中，适合精子的长期保存。实际操作中，可以采用移液枪从精子悬浮液中抽取10～30μL，并滴到载玻片上形成悬浮液滴，然后让悬浮液滴自然蒸发干燥，再将载玻片放到载玻片盒内进行统一保存即可。用该保存精子的方法，在室温下，可以进行一个月的短期保存，而保证精子有较高的完整度。在4℃的条件下，可以达到半年至一年的保存时间，而将温度降至-80℃或液氮中，更是可以实现精子的长期保存。进一步地，保存过程最好进行避光处理。若条件允许的情况下，进行真空保存，得到的保存效果更佳。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。值得注意的是，为了实验数据的可比性，如无特殊说明，以下实施例中所使用的精液来源于吉林省农业科学院，18～22个月龄性成熟的杜洛克公猪，但不能以此认为本发明的精子保存的方法仅限于此。在本发明的其它较佳实施例中，该精子保存的方法对其它生物的精子同样能起到很好的保存效果。实施例1本实施例提供一种精子干燥液，每升上述精子干燥液包括：氯化钠6.82g、氯化钾0.28g、无水氯化钙0.35g、六水氯化镁0.09g、碳酸氢钠2.51g、磷酸钠0.048g、葡萄糖1.08g、4-羟乙基哌嗪乙磺酸2.76g、棉籽糖10mmol和余量的水。本实施例还提供一种精子保存的方法，包括：S1.将采集到的新鲜精液用稀释液进行稀释，直至精液中精子的密度为1×106个/mL。S2.将上述稀释后的精液用离心机离心除去精清，离心机的离心因数为700g，离心时间3min。S3.将离心后的精液与上述精子干燥液混合，得到精子悬浮液，精子悬浮液中精子的密度为1～2×106个/mL。S4.将精子悬浮液用移液枪每20μL一小滴滴到载玻片形成悬浮液滴，并于室温下自然蒸发干燥30min。S5.将载玻片放到载玻片盒中进行保存。实施例2本实施例提供一种精子干燥液，其与实施例1中所提供的一种精子干燥液的成分基本相同，其区别在于，每升精子干燥液中包含棉籽糖的量为20mmol。本实施例还提供一种精子保存的方法，其与实施例1中所提供的一种精子保存的方法相同，具体细节可参照实施例1。实施例3本实施例提供一种精子干燥液，其与实施例1中所提供的一种精子干燥液的成分基本相同，其区别在于，每升精子干燥液中包含棉籽糖的量为50mmol。本实施例还提供一种精子保存的方法，其与实施例1中所提供的一种精子保存的方法相同，具体细节可参照实施例1。实施例4本实施例提供一种精子干燥液，每升上述精子干燥液包括：氯化钠6g、氯化钾0.25g、无水氯化钙0.5g、六水氯化镁0.1g、碳酸氢钠2g、磷酸钠0.05g、葡萄糖1g、4-羟乙基哌嗪乙磺酸2.5g、棉籽糖20mmol和余量的水。本实施例还提供一种精子保存的方法，包括：S1.将采集到的新鲜精液用稀释液进行稀释，直至精液中精子的密度为1.2×106个/mL。S2.将上述稀释后的精液用离心机离心除去精清，离心机的离心因数为600g，离心时间5min。S3.将离心后的精液与上述精子干燥液混合，得到精子悬浮液，精子悬浮液中精子的密度为1～2×106个/mL。S4.将精子悬浮液用移液枪每30μL一小滴滴到载玻片形成悬浮液滴，并于室温下自然蒸发干燥40min。S5.将载玻片放到载玻片盒中进行保存。实施例5本实施例提供一种精子干燥液，每升上述精子干燥液包括：氯化钠6.5g、氯化钾0.3g、无水氯化钙0.6g、六水氯化镁0.05g、碳酸氢钠2.4g、磷酸钠0.03g、葡萄糖1.2g、4-羟乙基哌嗪乙磺酸3g、棉籽糖20mmol和余量的水。本实施例还提供一种精子保存的方法，包括：S1.将采集到的新鲜精液用稀释液进行稀释，直至精液中精子的密度为1.2×106个/mL。S2.将上述稀释后的精液用离心机离心除去精清，离心机的离心因数为800g，离心时间2min。S3.将离心后的精液与上述精子干燥液混合，得到精子悬浮液，精子悬浮液中精子的密度为1～2×106个/mL。S4.将精子悬浮液用移液枪每10μL一小滴滴到载玻片形成悬浮液滴，并于室温下自然蒸发干燥20min。S5.将载玻片放到载玻片盒中进行保存。实施例6本实施例提供一种精子干燥液，每升上述精子干燥液包括：氯化钠7g、氯化钾0.2g、无水氯化钙0.3g、六水氯化镁0.1g、碳酸氢钠3g、磷酸钠0.05g、葡萄糖1g、4-羟乙基哌嗪乙磺酸2.9g、棉籽糖20mmol和余量的水。本实施例还提供一种精子保存的方法，包括：S1.将采集到的新鲜精液用稀释液进行稀释，直至精液中精子的密度为1×106个/mL。S2.将上述稀释后的精液用离心机离心除去精清，离心机的离心因数为700g，离心时间3min。S3.将离心后的精液与上述精子干燥液混合，得到精子悬浮液，精子悬浮液中精子的密度为1～2×106个/mL。S4.将精子悬浮液用移液枪每20μL一小滴滴到载玻片形成悬浮液滴，并于室温下自然蒸发干燥30min。S5.将载玻片放到载玻片盒中进行保存。实施例7本实施例提供一种精子干燥液，每升上述精子干燥液包括：氯化钠6.5g、氯化钾0.25g、无水氯化钙0.35g、六水氯化镁0.07g、碳酸氢钠2.8g、磷酸钠0.04g、葡萄糖1.1g、4-羟乙基哌嗪乙磺酸2.6g、棉籽糖20mmol和余量的水。本实施例还提供一种精子保存的方法，其与实施例6中所提供的一种精子保存的方法相同，具体细节可参考实施例6。对比例本对比例提供一种精子干燥液，每升上述精子干燥液包括：氯化钠6.82g、氯化钾0.28g、无水氯化钙0.35g、六水氯化镁0.09g、碳酸氢钠2.51g、磷酸钠0.048g、葡萄糖1.08g、4-羟乙基哌嗪乙磺酸2.76g和余量的水。本对比例还提供一种精子保存的方法，其与实施例1中所提供的一种精子保存的方法相同，具体细节可参照实施例1。试验例1取实施例1～3和对比例所提供的精子干燥液，并按照实施例1所提供的一种精子保存的方法对精液进行处理得到干燥精液样本，将上述干燥精液样本于室温下保存1个月，并对其做如下测试。1.采用TUNEL法(DNA断裂的原位末端标记法)对各干燥精液样本进行测试，用流式细胞计数仪来检测出凋亡精子的量，供试精子的量为10000个。计算测试结果为阳性的细胞，也即DNA断裂的细胞所占的百分比，计算结果如表1所示。2.采用ICSI(卵胞浆内单精子显微注射技术)将各干燥精液样本与卵细胞结合，并将得到的胚胎进行体外培养，在培养至48h时观察卵裂率，卵裂率＝卵裂胚胎数/供试卵数×100％，在培养至168h时观察囊胚率，囊胚率＝囊胚数/供试卵数×100％。每一个干燥精液样本重复试验8次，计算结果如表2所示。表1TUNEL测试阳性细胞比率阳性细胞比率/％实施例174实施例240实施例369对比例78新鲜精液8表2卵裂率以及囊胚发育率由表1可以看出，在1个月的室温保存后，精子干燥液中添加有棉籽糖的情况(实施例1～3)，较之精子干燥液中未添加有棉籽糖的情况(对比例)，干燥精子样本中DNA断裂的细胞所占比例均有降低，细胞的完整性更高；其中，当棉籽糖的含量为20mmol/L的时候，效果最为显著，DNA断裂的细胞所占比例仅为40％。同时，实施例1～3的干燥精子样本较之对比例的干燥精子样本，在与卵细胞结合后，卵裂率和囊胚发育率均有提高，这种提升效果，同样是在棉籽糖的含量为20mmol/L的时候达到最佳。说明本发明所提供的一种精子干燥液对精子细胞有较为明显的保护作用，且在棉籽糖的含量为20mmol/L的时候，能得到最优的保护效果。试验例2取实施例2所提供的精子干燥液，并按照实施例1所提供的一种精子保存的方法对精液进行处理得到干燥精液样本，将上述干燥精液样本分别于室温、4℃、-20℃以及-80摄氏度下保存，且分别在1个月、3个月、1年和2年的时间对个干燥精液样本取样，并对其做如下测试。1.采用TUNEL法(DNA断裂的原位末端标记法)对干燥精液样本进行测试，用流式细胞计数仪来检测出凋亡精子的量，供试精子的量为10000个。计算测试结果为阳性的细胞，也即DNA断裂的细胞所占的百分比，计算结果如表3所示。2.采用ICSI(卵胞浆内单精子显微注射技术)将干燥精液样本与卵细胞结合，并将得到的胚胎进行体外培养，在培养至48h时观察卵裂率，卵裂率＝卵裂胚胎数/供试卵数×100％，在培养至168h时观察囊胚率，囊胚率＝囊胚数/供试卵数×100％。每一个干燥精液样本重复试验8次，计算结果如表4所示。表3TUNEL测试阳性细胞比率表4卵裂率以及囊胚发育率由表3可以看出，实施例2所提供的干燥精子样本室温下可以进行短期保存，在1个月甚至3个月的时间内，仍能保持较高的完整性。而当温度降低到4℃时，该干燥精子样本可以在保存1年时，仍保持较高的完整性。而当温度继续降低到-20℃甚至是-80℃时，更是能进行长期保存。同时，由表4可以看出，实施例2所提供的干燥精子样本室温下短期保存，仍能与卵细胞结合，并维持较高的卵裂率和囊胚发育率。当温度降低到4℃时，该干燥精子样本在保存1年后，仍能达到75％以上的卵裂率和30％以上的囊胚发育率。而当温度继续降低到-20℃甚至是-80℃时，更是可以实现长期保存后仍保持良好的活性。综上所述，本发明所提供的一种精子干燥液，能够模拟精子生长状态下的环境状态，具有维持渗透压、控制酸碱平衡、供给细胞生存代谢所必需的能量和无机盐成分等作用，可提供精子在体外生存并维持一定代谢活动的基本需要。在本发明中，在该精子干燥液中加入了一定量的棉籽糖，棉籽糖不但是主要非电解质，可缓和精浆的电离程度，而且是精子离体后的主要能源物质，也是稀释液中调节渗透压的重要物质之一。同时，棉籽糖的分子量较大，较之小分子的糖能够更好地对精子进行保护，提高精子的完整性。本发明所提供的一种精子保存的方法，其采用离心法去除精液中的精清，再与上述精子干燥液混合，最后采用蒸发干燥法进行干燥。整个过程操作简单，不需要复杂的冷冻、干燥设备，其处理后的精子可以进行长时间保存，而依然保持较高的完整性，特别适合野外采集、收集野生动物精液。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 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