一种宽叶独行菜的体外快速繁殖方法与流程

本发明涉及植物组织培养技术领域，特别是涉及一种宽叶独行菜的体外快速繁殖方法。

背景技术：

宽叶独行菜为多年生草本植物，分布于海拔1800～4250米的欧洲南部、非洲北部、亚洲西部及中部，具有耐盐碱、抗旱耐涝等多种抗逆性状。宽叶独行菜全草入药，中医认为可治菌痢、肠炎；其种子含有谷甾醇及强心甙成分，可以使心脏收缩加强，心率减慢，对衰竭的心脏可以增加血液的输出量，降低静脉压。

根据中国植物志的记载，宽叶独行菜分为原产于青海的宽叶独行菜(原变种)(lepidiumlatifoliuml.var.latifolium)和原产于华北的光果宽叶独行菜(变种)北独行菜(lepidiumlatifoliuml.var.affine)。随着对宽叶独行菜食用价值的不断开发，人们逐渐发现原产于青海的宽叶独行菜(原变种)(lepidiumlatifoliuml.var.latifolium)富含维生素a、c，以及铜、钙、钾等多种微量元素，是一种营养价值极高的新型保健蔬菜。其作为饲料可饲喂猪、羊，是我国西北盐碱地较普遍的饲用植物。此外，独行菜种子富含丰富脂肪酸，产量比冬油菜平均水平高出30％左右，是一种新型油料作物。

鉴于宽叶独行菜抗逆性强，且在食用、药用、饲用等方面有较高的应用价值，因此具有很好的推广开发前景。然而原产于青海的宽叶独行菜(原变种)(lepidiumlatifoliuml.var.latifolium)在国内分布于西北地区，在东部地区虽然能够正常生长结实，但其所结种子多数胚胎发育不良难以获得正常的幼苗，使得宽叶独行菜的栽培推广受到极大限制。

因此，开发一种针对于原产于青海的宽叶独行菜(原变种)(lepidiumlatifoliuml.var.latifolium)的体外快繁技术，对于宽叶独行菜的栽培推广具有十分重要的意义。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明的目的在于提供一种宽叶独行菜的体外快速繁殖方法。本发明克服了宽叶独行菜在我国东部地区繁殖效率低的问题，极大的促进了宽叶独行菜的栽培推广。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种宽叶独行菜的体外快速繁殖方法，步骤如下：

(1)制备宽叶独行菜的无菌外植体；

(2)将无菌外植体接种到快繁培养基上，进行再生苗的诱导以及快速扩增繁殖；

(3)将诱导生成的再生苗转入ms基本培养基中进行生根诱导；

(4)将生根后的宽叶独行菜完整再生植株移栽入栽培基质中正常生长。

所述宽叶独行菜为原产于青海的宽叶独行菜(原变种)(lepidiumlatifoliuml.var.latifolium)。

步骤(1)中，无菌外植体的制备方法为：挑选成熟饱满的独行菜种子，灭菌，然后播种于ms基本培养基上，将萌发后10～14天苗龄独行菜幼苗整株切碎作为体外快速繁殖的无菌外植体。

优选的，灭菌的方法为：用质量浓度为2％次氯酸钠灭菌25min，然后用无菌水冲洗。

步骤(2)中，所述快繁培养基是在ms基本培养基中添加30g/l的蔗糖、1mg/l的6-ba、0.25mg/l的naa，6～8g/l的琼脂，调节ph为5.8。

步骤(2)中，再生苗的诱导以及快速扩增繁殖采用的条件为23～25℃培养，每日14小时光照，10小时黑暗，14～21天继代一次，共诱导培养28～42天。

步骤(3)中，生根诱导采用的条件为：23～25℃培养，每日14小时光照，10小时黑暗，共诱导培养20天。

本发明的有益效果：

(1)本发明针对原产于青海的宽叶独行菜(原变种)(lepidiumlatifoliuml.var.latifolium)首次提供了一种快速繁殖的方法，为宽叶独行菜在我国东部(特别是华北、华东地区)的推广应用提供了技术保障。

(2)本发明的快繁技术采用的是组培条件下萌发幼苗整株切碎作为外植体，结构不完整的幼苗也能利用，因此不受胚发育不良的影响，降低了外植体取材难度，扩大了外植体来源范围。

(3)本发明中，扩繁系数为8.54～11.04，即每棵无菌幼苗最终形成再生植株的平均数目。上述各步骤是一个有机的整体，互为条件，有效提高了宽叶独行菜的繁殖效率。

综上，本发明为国内外首个针对原产于青海的宽叶独行菜体外快繁技术，有效扩大了宽叶独行菜的繁殖系数，克服了宽叶独行菜种子繁殖的地域限制问题。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1：采自青海的宽叶独行菜无菌播种；

图2：再生苗的诱导及快速繁殖；

图3：生根培养；

图4：移栽后的植株。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，开发宽叶独行菜的体外快繁技术对于宽叶独行菜的栽培推广具有十分重要的意义。基于此，本申请提出了一种宽叶独行菜的体外快速繁殖方法。

在本申请的一种实施方案中，提供了一种宽叶独行菜的体外快速繁殖方法，步骤如下：

(1)无菌外植体的制备：挑选成熟饱满的独行菜种子，用质量浓度为2％次氯酸钠灭菌25min，无菌水冲洗4次后，播种于ms基本培养基上，将萌发后10～14天苗龄独行菜幼苗整株切碎作为体外快速繁殖的无菌外植体。

(2)将无菌外植体接种到快繁培养基上，进行再生苗的诱导以及快速扩增繁殖；快速扩增繁殖采用的条件为23～25℃培养，每日14小时光照，10小时黑暗，14～21天继代一次，共诱导培养28～42天。

(3)将诱导生成的再生苗转入ms基本培养基中进行生根诱导；生根诱导采用的条件为：23～25℃培养，每日14小时光照，10小时黑暗，共诱导培养20天。

(4)将生根后的独行菜完整再生植株移栽入栽培基质中正常生长。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

本发明实施例中所用的培养基，具体如下：

ms培养基：市售产品。

快繁培养基：在ms基本培养基中添加30g/l的蔗糖，1mg/l的6-ba，0.25mg/l的naa，6g/l的琼脂，调节ph为5.8；配制后用121℃高压湿热灭菌20min。

栽培基质为现有技术中常规的栽培基质。

实施例1：采收于青海的宽叶独行菜正常幼苗快繁

具体方法如下：

(1)无菌外植体的获得：从采收于青海地区的宽叶独行菜种子中选取成熟饱满者，用2％次氯酸钠灭菌25min，无菌水冲洗4次后，播种于ms基本培养基上，待无菌苗萌发后10天，将整株幼苗均匀切成10块作为体外快速繁殖的无菌外植体。

(2)将无菌外植体接种到快繁培养基上，培养条件为23～25℃培养，每天14小时光照，10小时黑暗，14天继代一次，共诱导培养28天，获得体外扩繁的再生宽叶独行菜离体苗，此步骤中每块外植体形成离体再生苗的平均数目为1.104株；

(3)将上述诱导生成的离体再生苗转入ms基本培养基中，以步骤(2)中的条件继续进行生根诱导，生根率为100％。

(4)将生根后的独行菜完整再生植株移栽入栽培基质中，按照常规栽培方式使其进入正常生长，此步骤移栽成活率为100％。

综上，采收于青海的宽叶独行菜每棵无菌幼苗最终形成再生植株的平均植株数目，即扩繁系数为11.04。

宽叶独行菜无菌播种、再生苗的诱导及快速繁殖、生根培养以及栽培后的植株分别如图1-4所示。

实施例2：采收于山东的宽叶独行菜胚根缺失幼苗快繁

具体方法如下：

(1)无菌外植体的获得：从采收于山东地区的宽叶独行菜种子中选取成熟饱满者，用2％次氯酸钠灭菌25min，无菌水冲洗4次后，播种于ms基本培养基上，待无菌苗萌发后14天，将缺失胚根的整株幼苗均匀切成10块作为体外快速繁殖的无菌外植体。

(2)将无菌外植体接种到快繁培养基上，培养条件为23～25℃培养，每天14小时光照，10小时黑暗，21天继代一次，共诱导培养42天，获得体外扩繁的再生宽叶独行菜离体苗，此步骤中每块外植体形成离体再生苗的平均数目为0.854株；

(3)将上述诱导生成的离体再生苗转入ms基本培养基中，以步骤(2)中的条件继续进行生根诱导，生根率为100％。

(4)将生根后的独行菜完整再生植株移栽入栽培基质中，按照常规栽培方式使其进入正常生长，此步骤移栽成活率为100％。

综上，采收于山东的宽叶独行菜每棵无菌幼苗最终形成再生植株的平均植株数目，即扩繁系数为8.54。

对比例1：

采集产于青海的宽叶独行菜的幼叶和嫩茎，消毒处理，将消毒处理后的宽叶独行菜幼叶切成0.5cm²大小的片段，嫩茎切成0.5-1.0cm的小段，作为愈伤组织诱导的外植体接种于盛有无菌培养基的三角瓶中，培养基的组成为：ms培养基中添加1.5mg/l2,4-d+1.0mg/liaa+0.5mg/l6-ba。

将接种有外植体的三角瓶置于25摄氏度、1800-2000lx光照强度下进行培养。将生根后的独行菜完整再生植株移栽入栽培基质中，按照常规栽培方式使其进入正常生长。

本对比例中，移栽的成活率为82％，扩繁系数为5.02。

对比例2：

将所用的材料替换为采自唐山地区的宽叶独行菜的幼叶和嫩茎，其余处理方法同对比例1。

本对比例中，移栽的成活率为86％，扩繁系数为6.13。

由上述实施例和对比例可以看出，将具有不同遗传背景(分别采自青海、山东和唐山的宽叶独行菜)的材料进行组织培养，其所需的组培体系不同，在组培体系上没有可比性和可参考性。另外，对于产自青海的宽叶独行菜而言，其组培体系的选择对于扩繁的效果具有十分关键的影响，经试验研究发现，本发明的宽叶独行菜的体外快速繁殖方法，通过再生苗的诱导以及快速扩增繁殖、生根诱导等步骤的优选与结合，非常好的实现了对采集于青海的宽叶独行菜的快速繁殖。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。