本发明涉及生物技术，特别涉及一种酒精性心肌病c57bl/6小鼠模型的建立方法。
背景技术：
长期大量摄入酒精会患上一种非缺血性的扩张性心肌病，根据世界卫生组织国际心脏病学特别工作组协会联盟(worldhealthorganization/internationalsocietyandfederationofcardiologytaskforce)1995年关于心肌病的定义和分类的报告，将其定义为酒精性心肌病(alcoholiccardiomyopathy,acm)。目前酒精性心肌病的发病机制尚未明确，有研究表明大量的酒精可使左心室心肌细胞丢失，进而引起心功能不全，线粒体损害，钙稳态失衡，心肌收缩蛋白变化等。由于酒精性心肌病严重威胁人类健康，需要进一步探讨研究，因此建立稳定有效的酒精性心肌病c57bl/6小鼠模型对其发病机制的研究具有重要意义。
在酒精性心肌病的发病机制研究过程中，其动物模型是一种必需的工具。目前已有研究采用酒精灌胃建立酒精性心肌病大鼠模型，然而这种一次性大量灌胃酒精的模型不符合日常生活中正常人长期每日少量摄入酒精的生理过程，且灌胃操作会对动物造成不同程度的应激反应或者死亡，从而影响试验结果稳定性，病理表现不一，使模型的应用受到限制。而本发明采用高脂肪型酒精液体饲料过渡式喂养方式，更符合正常人日常饮酒习惯，还可排除人为操作对动物的影响，避免动物死亡，且c57bl/6小鼠较大鼠具有较强的酒精敏感性，其试验结果精度高，可比性好，应激反应均一。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服上述现有技术存在的缺陷，提供一种酒精性心肌病c57bl/6小鼠模型的建立方法，通过该方法建立小鼠模型，可使动物的死亡率降低为零，但小鼠模型的病理表现相同。
本发明的目的是这样实现的：一种酒精性心肌病c57bl/6小鼠模型的建立方法，包括以下步骤：
a、动物选择
选择25克左右体重的雄性c57bl/6小鼠作为建立小鼠模型的对象。
b、制备高脂肪型酒精液体饲料
将酒精按热量比换算后，量取对应体积的制药级95％的酒精与高脂肪型酒精液体饲料混合，不同喂养阶段酒精所占热量比分变为5.5％、11％、22、27％、32％，每日按每只鼠15ml体积液体饲料计算，现配现用。
c、模型的建立
将选择的c57bl/6小鼠饲养在spf级动物房，模型组(af)按照对照液体饲料适应性喂养2天、酒精占5.5％热量比喂养2天、酒精占11％热量比喂养2天、酒精占22％热量比喂养1周、酒精占27％热量比喂养1周、酒精占32％热量比喂养1周，对照组(pf)持续喂养对照液体饲料4周，使得对照组与模型组等热量摄入饲料，从而建立酒精性心肌病c57bl/6小鼠模型。
实验结果表明：与对照组小鼠相比，模型组小鼠心脏体积重量均明显增大，模型组小鼠血清中ck-mb(肌酸激酶同工酶，一种心肌损伤标志)水平显著升高；心肌组织he染色结果表明模型组心肌细胞较对照组有明显的肥大、肌纤维增粗；心超结果表明模型组小鼠心脏室间隔厚度和左室后壁厚度较对照组显著增加，模型组左心室室内径和室容积较对照组显著降低；心肌组织油红o结果表明模型组的心肌细胞较对照组有明显的脂质沉积，tunnel染色结果表明模型组的心肌细胞较对照组有明显的细胞凋亡；模型组心脏组织中抗凋亡相关基因bcl-xl表达明显降低，且模型组心脏组织中凋亡相关基因caspase-9表达明显升高；模型组心肌组织中vldlr基因和蛋白表达水平均明显高于对照组。
本发明酒精性心肌病c57bl/6小鼠模型的建立方法，所述的对照组与模型组等热量摄入饲料是将制药级95％的酒精按热量比换算后与高脂肪型酒精液体饲料混合，现配现用，使得对照组与模型组小鼠摄入热量相等。另外，c57bl/6小鼠是一种近交系小鼠，其试验结果精度高，可比性好，应激反映均一，嗜酒精性高即对酒精敏感度高，故本发明采用此类小鼠作为动物模型。
本发明酒精性心肌病c57bl/6小鼠模型的建立方法与现有技术相比，本方法使动物的死亡率降低为零，但病理表现相同，从而使模型变得稳定而可靠，并具有可重复性。
附图说明
图1长期饮酒会对小鼠心脏重量及心脏体重比值影响结果图。
图2长期饮酒的小鼠血清中肌酸激酶同工酶(ck-mb)含量柱状图。
图3为通过he染色和油红o染色分析长期饮酒对小鼠心肌组织学的影响的结果图。
图4为通过心脏彩超分析长期饮酒对小鼠心脏功能学的影响。
图5为通过rt-pcr和westrenblot分析长期饮酒对心肌组织中脂质代谢的影响。
图6通过tunnel染色和rt-pcr分析长期饮酒对小鼠心肌细胞凋亡的影响。
图7通过rt-pcr和westrenblot分析长期饮酒对心肌组织中脂质代谢的影响。
具体实施方法
实施例1
酒精性心肌病c57bl/6小鼠模型的建立方法，包括以下步骤：
a、动物选择
选择25克左右(25(+2)克)体重的胸性c57bl/6小鼠(上海斯莱克公司，c57bl/6)作为建立小鼠模型的对象。
b、制备脂肪型酒精液体饲料
将酒精(lichrosolvethanol纯度大于等于99.9％)按热量比换算后，量取对应体积的酒精与高脂肪型酒精液体饲料(来源南通特洛菲饲料科技有限公司)混合，不同喂养阶段酒精所占热量比分变为5.5％、11％、22、27％、32％，每日按每只鼠15ml体积液体饲料计算，现配现用。
c、模型的建立
将选择的c57bl/6小鼠饲养在spf级动物房，模型组(af)按照对照液体饲料(pf)适应性喂养2天、酒精占5.5％热量比喂养2天、酒精占11％热量比喂养2天、酒精占22％热量比喂养1周、酒精占27％热量比喂养1周、酒精占32％热量比喂养1周，对照组(pf)持续喂养对照液体饲料4周，使得对照组与模型组等热量摄入饲料，从而建立酒精性心肌病c57bl/6小鼠模型。
d、实验对比
前期动物实验发现，图1可知，af组小鼠心脏重量较pf组有显著增加(*p<0.05)，即长期饮酒会引起小鼠心脏重量及心脏体重比值均显著增加；图2可以发现：长期饮酒的小鼠血清中肌酸激酶同工酶(ck-mb)含量较对照组小鼠明显升高，af组有明显的心肌损伤，即说明长期饮酒会引起心肌损伤(*p<0.05)。
图3为通过he染色和油红o染色分析长期饮酒对小鼠心肌组织学的影响的结果图，其中图3a、3b：通过he染色发现，af组心肌细胞纵切面内径增粗，这表明长期饮酒会引起心肌细胞肥大(放大倍数40x10)；图3c、3d：通过he染色发现，af组心肌细胞横切面较pf组有明显肥大(放大倍数40x10)；图3e、3f：油红o染色发现，af组心脏组织中存在明显的脂质沉积，说明长期饮酒会造成心肌细胞脂肪变性(放大倍数20x10)。
图4为通过心脏彩超分析长期饮酒对小鼠心脏功能学的影响。图a、b：af组心脏舒张期和收缩期室间隔厚度较pf组明显增加；图c、d：af组心脏左心室舒张期和收缩期室内径较pf组明显减小；图e、f：af组心脏舒张期和收缩期左室后壁厚度较pf组明显增加；图g、h：af组心脏左室舒张期和收缩期容积较pf组明显降低；以上结果表明长期饮酒会引起小鼠心脏心肌增厚，影响心肌舒缩功能，进而引起心肌损伤。(*p<0.05)
图5：通过tunnel染色分析长期饮酒对小鼠心肌细胞凋亡的影响，发现图a、b、c(a的局部放大图)、d(b的局部放大图)：af组的心肌细胞较pf组有明显的细胞凋亡(染棕色的部分为凋亡小体)。
图6：rt-pcr检测小鼠心脏组织中抗凋亡相关基因bcl-xl表达量，发现af组显著低于pf组(*p<0.05)；图g：rt-pcr检测小鼠心脏组织中凋亡相关基因caspase-9表达量，发现af组显著高于pf组(**p<0.01)；以上结果表明长期饮酒会诱导心肌细胞凋亡相关基因的表达，从而引起细胞凋亡。
图7：通过rt-pcr和westrenblot分析长期饮酒对心肌组织中脂质代谢的影响。其中，图a：rt-pcr结果显示，af组心脏组织中vldlr基因表达明显升高(**p<0.01)；图b、c：westrenblot结果显示，af组心脏组织中vldlr蛋白表达明显升高(*p<0.05)；这些结果提示长期饮酒可能影响心肌组织的脂质代谢过程。
即实验结果表明：
(1)与对照组小鼠相比，模型组小鼠心脏体积重量均明显增大，模型组小鼠血清中ck-mb(肌酸激酶同工酶，一种心肌损伤标志)水平显著升高，说明长期饮酒会引起心肌损伤；
(2)心肌组织he染色结果表明模型组心肌细胞较对照组有明显的肥大、肌纤维增粗；心肌组织油红o结果表明模型组的心肌细胞较对照组有明显的脂质沉积，心肌细胞发生脂肪变性；
(3)心超功能学结果表明模型组小鼠心脏室间隔厚度和左室后壁厚度较对照组显著增加，模型组左心室室内径和室容积较对照组显著降低，说明长期饮酒会引起小鼠心脏心肌增厚，影响心肌舒缩功能，进而引起心肌损伤；
(4)tunnel染色结果表明模型组的心肌细胞较对照组有明显的细胞凋亡；模型组心脏组织中抗凋亡相关基因bcl-xl表达明显降低，且模型组心脏组织中凋亡相关基因caspase-9表达明显升高，以上结果表明长期饮酒会诱导心肌细胞凋亡相关基因的表达，从而引起细胞凋亡；
(5)模型组心肌组织中vldlr基因和蛋白表达水平均明显高于对照组，这些结果提示长期饮酒可能影响心肌组织的脂质代谢过程。