本发明涉及烟草品种青枯病抗性的鉴定方法。
背景技术：
：烟草是我国乃至全球的重要经济作物。由青枯劳尔氏菌(ralstoniasolanacearum)引起的烟草青枯病是烟草主要病害之一，常年造成的产量损失在20％左右，重者可达50％，甚至绝收，严重影响了烟叶的产量和品质。烟草青枯病的侵染源主要有带菌土壤、病残体，病原菌从烟草的伤口侵入。近年来由于烟草连作，青枯病等土传病害的发生程度和面积逐年上升。目前，生产上防治青枯病主要采取化学防治方法。但长期大量施用化学农药既容易使病菌产生抗药性，又容易造成严重的环境污染。如，闫芳芳等(2013年)报道采用在土壤中添加石灰和t-310可以减轻青枯病的发生，但t-310配料较为复杂且来源受限，石灰用量也必须严格控制，否则极易造成土壤板结。生产实践证明，选育和种植抗病品种是防治烟草青枯病最为经济、有效、安全的措施。而烟草品种的抗病性鉴定是选育抗病品种必不可少的关键技术：准确鉴定不同烟草品种的抗病性，有助于更好地利用现有烟草品种，更快速、准确的筛选出抗源材料，进而选育出优良的抗病品种。作物病害的品种抗性鉴定评价方法有自然感病鉴定和人工接种鉴定两种。自然感病鉴定具有操作简便的优点，但受环境因素影响大、发病不均匀、鉴定所需时间长；人工接种鉴定以其方法标准、发病快速、鉴定时间短、鉴定结果准确等特点，被育种者和植保工作者广泛采用。但现有的烟草青枯病人工接种鉴定方法，烟苗需在ms培养基培育，且在鉴定前，需将烟苗进行逐株剪刀伤根，接种后还需灭菌滤纸吸干多余菌液，并需将烟苗重新栽回培养基中。其鉴定成本仍然偏高、鉴定条件苛刻，难以大规模推广应用。技术实现要素：本发明的目的是提供一种苗期快速鉴定烟草品种青枯病抗性的方法，该方法操作简便、易于掌握、鉴定快速、结果更准确；可为抗病材料筛选和抗病品种选育提供更好的技术支撑。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是，一种苗期快速鉴定烟草品种青枯病抗性的方法，其步骤为：一种苗期快速鉴定烟草品种青枯病抗性的方法，其步骤为：a、供试烟苗培育：在营养钵内按漂浮育苗方法对供试烟草品种进行烟苗的培育，育苗过程中不使用杀菌剂；b、青枯病接种体的制备：将从田间采集到的烟草青枯病病株，采用ttc培养基进行分离纯化培养，即在25～28℃的温度下、用ttc培养基培养3-5天，得到纯化培养的青枯菌；所述的ttc培养基由8-12份重的蛋白胨、0.8-1.2份重的水解乳蛋白、7-13份重的葡萄糖、15-20份重的琼脂、45-55份重的氯化三苯基四氮唑、1000份重的蒸馏水配制而成；将ttc培养基中纯化培养的青枯菌，接种在na培养基上，在25～28℃的温度下，振荡培养12h；再加入蒸馏水得到青枯菌浓度为1.5×108cfu/ml～2×108cfu/ml的接种菌液；所述的na培养基由2.5-3份重的牛肉浸膏、4-6份重的蛋白胨、210-220份重的葡萄糖、14-18份重的琼脂、1000份重的蒸馏水配制而成；c、青枯病接种：用注射器吸取b步得到的接种菌液，选取a步营养钵内长到3～4片真叶的烟苗，在选取的每株烟苗的叶腋处往茎杆斜插注射2～4ul接种菌液；(4)青枯病的培养及发病情况调查：将c步接种后的烟苗放在日光培养室内培养10天，培养时的温度为28～30℃、相对湿度大于80％；在培养的第10天，观察记载烟苗的发病情况；并按照国家标准《烟草病虫害分级及调查方法(gb/t23222-2008)》的方法，得出烟苗的病情指数；抗性型免疫抗中抗中感感高感病情指数00.1-2020.1-4040.1-6060.1-8080.1-100再根据烟苗的病情指数和上表，鉴定出供试烟草品种的青枯病抗性。与现有技术相比，本发明的有益效果是：一、侵染效果好、发病充分：利用注射器进行针刺接种，既能造成病菌入侵的伤口，又能确保病菌能进入植株体内，且对植株伤害小，从而保证浸染效果，发病迅速、充分。二、鉴定结果准确可靠：试验烟苗选择的是在营养钵内培育到3～4片真叶的烟苗，烟苗大小和长势一致，且伤口采用的是逐株相同部位针刺、逐株注射进行接种，从而达到伤口程度和接菌量一致，确保了接菌后发病均匀，保证了鉴定结果的准确性和一致性。三、操作简便、易于掌握：烟苗的培育选择在营养钵内常规进行，烟苗的接菌侵染采用注射器，接种病原菌后的烟苗放入日光温室培育，整个过程均不需特殊设施设备，也不需特别工艺，操作简便、易于掌握。四、可进行大量材料的鉴定筛选：由于烟苗的培育选择在营养钵内进行，接种后的烟苗放入日光温室培育，占地面积小，且工序简单，适宜进行大量材料的鉴定筛选。测定试验证明，本发明方法的测定结果准确、误差小，重复性及一致性好：对已知青枯病抗性分别为中抗和高感的云烟87、红花大金元2个品种，采用本发明方法进行测定，测出的病情指数分别为28.97～39.73和48.44～89.67，确定出其青枯病抗性分别为中抗和高感，鉴定结果与两个品种的已知抗性完全一致。下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。具体实施方式实施例一一种苗期快速鉴定烟草品种青枯病抗性的方法，其步骤为：a、供试烟苗培育：在营养钵内按漂浮育苗方法对供试烟草品种进行烟苗的培育，育苗过程中不使用杀菌剂；b、青枯病接种体的制备：将从田间采集到的烟草青枯病病株，采用ttc培养基进行分离纯化培养，即在25℃的温度下、用ttc培养基培养3天，得到纯化培养的青枯菌；所述的ttc培养基由12份重的蛋白胨、0.8份重的水解乳蛋白、13份重的葡萄糖、20份重的琼脂、55份重的氯化三苯基四氮唑、1000份重的蒸馏水配制而成；将ttc培养基中纯化培养的青枯菌，接种在na培养基上，在25℃的温度下，振荡培养12h；再加入蒸馏培养水得到青枯菌浓度为1.5×108cfu/ml的接种菌液；所述的na培养基由2.5份重的牛肉浸膏、6份重的蛋白胨、210份重的葡萄糖、14份重的琼脂、1000份重的蒸馏水配制而成；c、青枯病接种：用注射器吸取b步得到的接种菌液，选取a步营养钵内长到4片真叶的烟苗，在选取的每株烟苗的叶腋处往茎杆斜插注射4ul接种菌液；(4)青枯病的培养及发病情况调查：将c步接种后的烟苗放在日光培养室内培养10天，培养时的温度为28℃、相对湿度为81％；在培养的第10天，观察记载烟苗的发病情况；并按照国家标准《烟草病虫害分级及调查方法(gb/t23222-2008)》的方法，得出烟苗的病情指数；抗性型免疫抗中抗中感感高感病情指数00.1-2020.1-4040.1-6060.1-8080.1-100再根据烟苗的病情指数和上表鉴定出供试烟草品种的青枯病抗性。用本例方法对烟草品种—红花大金元进行青枯病抗性鉴定，得出供试的红花大金元烟苗的病情指数为81.67，鉴定出其青枯病抗性为高感；与该品种的已知抗病性一致。实施例二一种苗期快速鉴定烟草品种青枯病抗性的方法，其步骤为：a、供试烟苗培育：在营养钵内按漂浮育苗方法对供试烟草品种进行烟苗的培育，育苗过程中不使用杀菌剂；b、青枯病接种体的制备：将从田间采集到的烟草青枯病病株，采用ttc培养基进行分离纯化培养，即在28℃的温度下、培养5天，得到纯化培养的青枯菌；所述的ttc培养基由8份重的蛋白胨、1.2份重的水解乳蛋白、7份重的葡萄糖、15份重的琼脂、45份重的氯化三苯基四氮唑、1000份重的蒸馏水配制而成；将ttc培养基中纯化培养的青枯菌，接种在na培养基上，在26℃的温度下，振荡培养12h；再加入蒸馏水得到青枯菌浓度为2×108cfu/ml的接种菌液；所述的na培养基由3份重的牛肉浸膏、4份重的蛋白胨、220份重的葡萄糖、18份重的琼脂、1000份重的蒸馏水配制而成；c、青枯病接种：用注射器吸取b步得到的接种菌液，选取a步营养钵内长到3片真叶的烟苗，在选取的每株烟苗的叶腋处往茎杆斜插注射2ul接种菌液；(4)青枯病的培养及发病情况调查：将c步接种后的烟苗放在日光培养室内培养10天，培养时的温度为30℃、相对湿度为85％；在培养的第10天，观察记载烟苗的发病情况；并按照国家标准《烟草病虫害分级及调查方法(gb/t23222-2008)》的方法，得出烟苗的病情指数；抗性型免疫抗中抗中感感高感病情指数00.1-2020.1-4040.1-6060.1-8080.1-100再根据烟苗的病情指数和上表鉴定出供试烟草品种的青枯病抗性。用本例方法对烟草品种—红花大金元进行青枯病抗性鉴定，得出红花大金元烟苗的病情指数为88.63，鉴定出其青枯病抗性为高感；与该品种的已知抗病性一致。实施例三一种苗期快速鉴定烟草品种青枯病抗性的方法，其步骤为：a、供试烟苗培育：在营养钵内按漂浮育苗方法对供试烟草品种进行烟苗的培育，育苗过程中不使用杀菌剂；b、青枯病接种体的制备：将从田间采集到的烟草青枯病病株，采用ttc培养基进行分离纯化培养，即在27℃的温度下、用ttc培养基培养4天，得到纯化培养的青枯菌；所述的ttc培养基由10份重的蛋白胨、1.0份重的水解乳蛋白、10份重的葡萄糖、18份重的琼脂、50份重的氯化三苯基四氮唑、1000份重的蒸馏水配制而成；将ttc培养基中纯化培养的青枯菌，接种在na培养基上，在26℃的温度下，振荡培养12h；再加入蒸馏水得到青枯菌浓度为1.7×108cfu/ml的接种菌液；所述的na培养基由2.8份重的牛肉浸膏、5份重的蛋白胨、215份重的葡萄糖、16份重的琼脂、1000份重的蒸馏水配制而成；c、青枯病接种：用注射器吸取b步得到的接种菌液，选取a步营养钵内长到3片真叶的烟苗，在选取的每株烟苗的叶腋处往茎杆斜插注射3ul接种菌液；(4)青枯病的培养及发病情况调查：将c步接种后的烟苗放在日光培养室内培养10天，培养时的温度为29℃、相对湿度为90％；在培养的第10天，观察记载烟苗的发病情况；并按照国家标准《烟草病虫害分级及调查方法(gb/t23222-2008)》的方法，得出烟苗的病情指数；抗性型免疫抗中抗中感感高感病情指数00.1-2020.1-4040.1-6060.1-8080.1-100再根据烟苗的病情指数和上表鉴定出供试烟草品种的青枯病抗性。用本例方法对烟草品种—红花大金元进行青枯病抗性鉴定，得出供试红花大金元烟苗的病情指数为84.41，鉴定出其青枯病抗性为高感；与该品种的已知抗病性一致。实施例四一种苗期快速鉴定烟草品种青枯病抗性的方法，其步骤为：a、供试烟苗培育：在营养钵内按漂浮育苗方法对供试烟草品种进行烟苗的培育，育苗过程中不使用杀菌剂；b、青枯病接种体的制备：将从田间采集到的烟草青枯病病株，采用ttc培养基进行分离纯化培养，即在25℃的温度下、用ttc培养基培养3天，得到纯化培养的青枯菌；所述的ttc培养基由8份重的蛋白胨、0.8份重的水解乳蛋白、7份重的葡萄糖、15份重的琼脂、45份重的氯化三苯基四氮唑、1000份重的蒸馏水配制而成；将ttc培养基中纯化培养的青枯菌，接种在na培养基上，在28℃的温度下，振荡培养12h；再加入蒸馏水得到青枯菌浓度为2×108cfu/ml的接种菌液；所述的na培养基由2.5份重的牛肉浸膏、4份重的蛋白胨、210份重的葡萄糖、14份重的琼脂、1000份重的蒸馏水配制而成；c、青枯病接种：用注射器吸取b步得到的接种菌液，选取a步营养钵内长到3片真叶的烟苗，在选取的每株烟苗的叶腋处往茎杆斜插注射4ul接种菌液；(4)青枯病的培养及发病情况调查：将c步接种后的烟苗放在日光培养室内培养10天，培养时的温度为28℃、相对湿度为82％；在培养的第10天，观察记载烟苗的发病情况；并按照国家标准《烟草病虫害分级及调查方法(gb/t23222-2008)》的方法，得出烟苗的病情指数；抗性型免疫抗中抗中感感高感病情指数00.1-2020.1-4040.1-6060.1-8080.1-100再根据烟苗的病情指数和上表鉴定出供试烟草品种的青枯病抗性。用本例方法对烟草品种—云烟87进行青枯病抗性鉴定，得出云烟87烟苗的病情指数为39.73鉴定出其青枯病抗性为中抗；与该品种已知的青枯病抗性一致。实施例五一种苗期快速鉴定烟草品种青枯病抗性的方法，其步骤为：a、供试烟苗培育：在营养钵内按漂浮育苗方法对供试烟草品种进行烟苗的培育，育苗过程中不使用杀菌剂；b、青枯病接种体的制备：将从田间采集到的烟草青枯病病株，采用ttc培养基进行分离纯化培养，即-在28℃的温度下、培养5天，得到纯化培养的青枯菌；所述的ttc培养基由12份重的蛋白胨、1.2份重的水解乳蛋白、13份重的葡萄糖、20份重的琼脂、55份重的氯化三苯基四氮唑、1000份重的蒸馏水配制而成；将ttc培养基中纯化培养的青枯菌，接种在na培养基上，在27℃的温度下，振荡培养12h；再加入蒸馏水得到青枯菌浓度为1.5×108cfu/ml的接种菌液；所述的na培养基由3份重的牛肉浸膏、6份重的蛋白胨、220份重的葡萄糖、18份重的琼脂、1000份重的蒸馏水配制而成；c、青枯病接种：用注射器吸取b步得到的接种菌液，选取a步营养钵内长到4片真叶的烟苗，在选取的每株烟苗的叶腋处往茎杆斜插注射2ul接种菌液；(4)青枯病的培养及发病情况调查：将c步接种后的烟苗放在日光培养室内培养10天，培养时的温度为30℃、相对湿度大于95％；在培养的第10天，观察记载烟苗的发病情况；并按照国家标准《烟草病虫害分级及调查方法(gb/t23222-2008)》的方法，得出烟苗的病情指数；抗性型免疫抗中抗中感感高感病情指数00.1-2020.1-4040.1-6060.1-8080.1-100再根据烟苗的病情指数和上表鉴定出供试烟草品种的青枯病抗性。用本例方法对烟草品种—云烟87进行青枯病抗性鉴定，得出云烟87烟苗的病情指数为38.22，鉴定出云烟87的青枯病抗性为中抗，与该品种的青枯病已知抗性一致。实施例六一种苗期快速鉴定烟草品种青枯病抗性的方法，其步骤为：a、供试烟苗培育：在营养钵内按漂浮育苗方法对供试烟草品种进行烟苗的培育，育苗过程中不使用杀菌剂；b、青枯病接种体的制备：将从田间采集到的烟草青枯病病株，采用ttc培养基进行分离纯化培养，即在27℃的温度下、培养4天，得到纯化培养的青枯菌；所述的ttc培养基由9份重的蛋白胨、1.1份重的水解乳蛋白、11份重的葡萄糖、17份重的琼脂、51份重的氯化三苯基四氮唑、1000份重的蒸馏水配制而成；将ttc培养基中纯化培养的青枯菌，接种在na培养基上，在27℃的温度下，振荡培养12h；再加入蒸馏水得到青枯菌浓度为1.8×108cfu/ml的接种菌液；所述的na培养基由2.7份重的牛肉浸膏、5份重的蛋白胨、216份重的葡萄糖、17份重的琼脂、1000份重的蒸馏水配制而成；c、青枯病接种：用注射器吸取b步得到的接种菌液，选取a步营养钵内长到3片真叶的烟苗，在选取的每株烟苗的叶腋处往茎杆斜插注射3ul接种菌液；(4)青枯病的培养及发病情况调查：将c步接种后的烟苗放在日光培养室内培养10天，培养时的温度为29℃、相对湿度大于80％；在培养的第10天，观察记载烟苗的发病情况；并按照国家标准《烟草病虫害分级及调查方法(gb/t23222-2008)》的方法，得出烟苗的病情指数；抗性型免疫抗中抗中感感高感病情指数00.1-2020.1-4040.1-6060.1-8080.1-100再根据烟苗的病情指数和上表鉴定出供试烟草品种的青枯病抗性。用本例方法对烟草品种—云烟87进行青枯病抗性鉴定，得出云烟87烟苗的病情指数为39.33，鉴定出云烟87的青枯病抗性为中抗，与该品种的青枯病已知抗性一致。当前第1页12