一种黄精叶色突变体材料的创制方法与流程

本发明涉及植物育种和生物技术领域，具体涉及一种黄精叶色突变体材料的创制方法。

背景技术：

黄精（polygonatumcyrtonemahua）系百合科黄精属药食两用多年生植物。随着人们对黄精药理、药化研究的逐步深入，黄精在临床应用、保健品、食品、化妆品及观赏方面等方面的应用越来越广泛。《中国植物志》记载全世界约40种,我国有31种,2015年版《中国药典》规定黄精、滇黄精、多花黄精的干燥根茎为黄精药材原生药。而其他的黄精属植物虽不做药材，但加以合理的开发和利用，可以作为观赏花卉的新资源。黄精具有发达的贮存养分的根状茎，易于林下和盆栽观赏，将其作为地被植物种植于疏林草地、林下溪旁及建筑物阴面的绿地花坛、花境、花台及草坪周围来美化环境，无不适宜。

在植物的组织培养过程中，由于培养细胞一直处于不断的分生状态，因此容易受到培养条件的影响而产生突变，但没有特定的化学诱变剂诱变，突变率极低，且具有随机性。迄今在植物育种技术领域上，尚无利用植物生长调节剂诱导，能稳定得到突变体的报道。

技术实现要素：

本发明提供一种黄精叶色突变体材料的创制方法，以解决上述问题。

本发明采用如下技术方案：

一种黄精叶色突变体材料的创制方法，包括以下步骤：

ⅰ.外植体的选取以及预处理：外植体选取为取黄精地下根茎为外植体。外植体预处理包括外植体分切、清洗以及消毒，外植体分切为将外植体分切成带芽块状。

ⅱ.丛生芽诱导：将步骤ⅰ得到的外植体接入丛生芽诱导培养基上进行诱导培养，诱导出丛生芽。

ⅲ.增殖壮苗培养：将步骤ⅱ得到的丛生芽接入增殖壮苗培养基上进行培养，直至丛生芽块根膨大、芽体粗壮以及块茎颜色变暗。

ⅳ.分化培养与突变体筛选：将步骤ⅲ得到的丛生芽接入分化培养基培养，直至分化苗长出叶片后，对比原始表型植株，通过叶片表型性状筛选出叶片叶色突变为金黄色或者叶片部分绿色缺失的突变体。

其中：上述丛生芽诱导培养基为：ms+6-ba1.0mg/l+naa0.1mg/l+白糖30g/l+卡拉粉5.8g/l，ph值为5.8。上述增殖壮苗培养基为：ms+多效唑15～30mg/l+白糖60g/l+卡拉粉5.8g/l，ph值为5.8。上述分化培养基为：ms+6-ba2.0mg/l+naa0.1mg/l+白糖30g/l+卡拉粉5.8g/l，ph值为5.8。

进一步地：

上述步骤ⅱ中的丛生芽诱导、上述步骤ⅲ中的增殖壮苗培养以及上述步骤ⅳ中的分化培养的处理时间均为40d。

上述步骤ⅱ中的丛生芽诱导、上述步骤ⅲ中的增殖壮苗培养以及上述步骤ⅳ中的分化培养的处理条件均为：温度为25±2℃、光照为12h/d以及光照强度为2000lx。

更进一步地：

一种黄精叶色突变体材料的创制方法，还包括以下步骤：

ⅴ.突变体材料扩繁：将步骤ⅳ中筛选出的突变体转接到增殖培养基进行扩增，得到稳定的突变体材料。

ⅵ.突变体材料生根培养：将步骤ⅴ中得到的突变体材料接种至生根培养基进行生根培养。

ⅶ.炼苗移栽：将步骤ⅵ中得到的突变体植株洗掉培养基后，移栽到基质上。

其中：上述增殖培养基为：ms+6-ba0.5mg/l+naa0.1mg/l+白糖30g/l+卡拉粉5.8g/l，ph值为5.8。上述生根培养基为：ms+6-ba0.1mg/l+naa0.5mg/l+白糖30g/l+卡拉粉5.8g/l，ph值为5.8。上述基质为泥炭及珍珠岩基质。

上述步骤ⅴ中将突变体培养至4cm至5cm高度。

上述步骤ⅰ中的外植体预处理包括以下步骤：

ⅰ.将外植体分切成带芽块状后用洗衣粉溶液擦洗外植体，而后用流水冲洗外植体直至将其表面的洗衣粉溶液去除。

ⅱ.将步骤ⅰ处理后的外植体置于1/700浓度的甲基托布津中浸泡30min后取出，置于常温条件，将其晾干。

ⅲ.将步骤ⅱ处理后的外植体在超净工作台上用浓度为75%的乙醇处理30s后，用浓度为0.1%的升汞消毒8-10min。

ⅳ.将步骤ⅲ处理后的外植体用无菌水清洗后，用无菌滤纸将无菌水吸干。

上述步骤ⅰ中的上述外植体选取无病虫害及健壮的黄精地下根茎为外植体，外植体选取时间为每年9月份或者10月份。

上述步骤ⅰ中的上述外植体分切为将外植体分切成0.5cm*0.5cm的带芽块状。

由上述对本发明的描述可知，和现有技术相比，本发明具有如下优点：

第一，本发明的黄精叶色突变体材料的创制方法通过组织培养获得大量一致的黄精无菌丛生芽，利用一定浓度的植物生长调节剂配合处理，得到稳定的叶片表型性状突变的植物种质资源，方法简单易行，重复性好。

第二，本发明的黄精叶色突变体材料的创制方法所用到的植物生长调节剂为农业常用的植物生长调节剂，其本身不具备使植株突变的作用，但通过本发明的方法步骤，却可以得到稳定的突变体材料，相比当前常用的突变体创制化学诱变剂ems（甲基磺酸乙酯：一种严重的致癌物之一，使用中和废液处理时都必须十分注意防范，防治诱导癌症），具有无毒、使用安全、对环境无污染等优点。

第三，本发明的黄精叶色突变体材料的创制方法在特定的阶段，采取一定浓度的生长调节剂配合处理，得到稳定的叶色突变体材料，突变率可达0.65%以上。并且本发明的黄精叶色突变体材料的创制方法得到的叶色突变体黄精种质材料，为黄精育种提供新资源，为扩展黄精的用途，特别是观赏用途，促进黄精育种和产业的发展，都具有十分重要的意义。

附图说明

图1为本发明的黄精叶色突变体材料的创制方法创建的突变植株与正常植株对比。

图2为本发明的黄精叶色突变体材料的创制方法中大棚栽培的叶色突变驯化苗与正常苗对比。

图中，1为突变植株；2为正常植株；3为叶色突变为金黄色的驯化苗；4为叶片部分绿色缺失的驯化苗；5为正常驯化苗。

具体实施方式

本具体实施方式适用的材料包括：

多效唑，上海伊卡生物技术有限公司生产，一种农业常用的植物生长调节剂，具有延缓植物生长，抑制茎秆伸长，缩短节间、促进植物分蘖、增加植物抗逆性能，提高产量等效果。

6-ba（6-苄氨基嘌呤），国药集团化学试剂有限公司生产，一种组培常用的细胞分裂素，主要作用是促进芽的形成,也可以诱导愈伤组织发生,可抑制叶绿素的降解，提高氨基酸的含量，延缓叶片衰老等。

naa（萘乙酸），国药集团化学试剂有限公司生产，广谱型植物生长调节剂，主要作用是能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根等。

参考图1、图2，一种黄精叶色突变体材料的创制方法，包括以下步骤：

ⅰ.外植体的选取以及预处理：上述外植体选取为取无病虫害及健壮的黄精地下根茎为外植体，选取时间为每年9月份或者10月份。

上述外植体预处理包括以下步骤：

ⅰ.将外植体分切后用洗衣粉溶液擦洗外植体，而后用流水冲洗外植体直至将其表面的洗衣粉溶液去除。上述外植体分切为将外植体分切成0.5cm*0.5cm的带芽块状。

ⅱ.将步骤ⅰ处理后的外植体置于1/700浓度的甲基托布津中浸泡30min后取出，置于常温条件，将其晾干。

ⅲ.将步骤ⅱ处理后的外植体在超净工作台上用浓度为75%的乙醇处理30s后，用浓度为0.1%的升汞消毒8-10min。

ⅳ.将步骤ⅲ处理后的外植体用无菌水清洗3-4遍后，用无菌滤纸将无菌水吸干。

ⅱ.丛生芽诱导：将步骤ⅰ得到的外植体接入丛生芽诱导培养基上进行诱导，培养时间为40d。上述丛生芽诱导培养基为：ms+6-ba1.0mg/l+naa0.1mg/l+白糖30g/l+卡拉粉5.8g/l，ph值为5.8。

ⅲ.增殖壮苗培养：将步骤ⅱ得到的丛生芽接入增殖壮苗培养基上进行培养，直至丛生芽块根膨大、芽体粗壮以及块茎颜色变暗，培养时间为40d。上述增殖壮苗培养基为：ms+多效唑+白糖60g/l+卡拉粉5.8g/l，ph值为5.8。其中，多效唑浓度优选为15～30mg/l。本具体实施方式中优选通过4组多效唑浓度分别为0mg/l、15mg/l、30mg/l、50mg/l的该增殖壮苗培养基进行处理，每个处理丛生芽块数50个，重复3次取平均值。

ⅳ.分化培养与突变体筛选：将步骤ⅲ得到的丛生芽接入分化培养基培养，分化苗长出叶片后，对比原始表型植株，通过叶片表型性状筛选出突变体，培养时间40d。该叶片表型性状为叶片叶色突变为金黄色或者叶片部分绿色缺失。上述分化培养基为：ms+6-ba2.0mg/l+naa0.1mg/l+白糖30g/l+卡拉粉5.8g/l，ph值为5.8。

其中，不同多效唑浓度对黄精丛生芽诱变的影响参见以下表1：

ⅴ.突变体材料扩繁：将步骤ⅳ中筛选出的突变体转接到增殖培养基进行扩增，得到稳定的突变体材料，并培养至4cm至5cm高度。上述增殖培养基为：ms+6-ba0.5mg/l+naa0.1mg/l+白糖30g/l+卡拉粉5.8g/l，ph值为5.8。

ⅵ.突变体材料生根培养：将步骤ⅴ中得到的突变体材料接种至生根培养基进行生根培养。上述生根培养基为：ms+6-ba0.1mg/l+naa0.5mg/l+白糖30g/l+卡拉粉5.8g/l，ph值为5.8。

ⅶ.炼苗移栽：将步骤ⅵ中得到的突变体植株洗掉培养基后，移栽到泥炭及珍珠岩基质上，并置于温室大棚中，盖上薄膜和阴网，20～30d后掀开阴网和薄膜正常管理即可。

本具体实施方式采用的各组培阶段的培养条件是：温度25±2℃、光照12h/d以及光照强度2000lx。

本具体实施方式中，以多效唑浓度为15mg/l～50mg/l的上述增殖壮苗培养基处理黄精丛生芽,均能得到突变体材料。以多效唑浓度为30mg/l的增殖壮苗培养基处理黄精丛生芽，得到的突变率最高，为0.88%，突变体植株粗壮，生长正常。以多效唑浓度为50mg/l的增殖壮苗培养基处理黄精丛生芽，得到的突变率最低，为0.45%，且突变体植株出现矮化现象。以多效唑浓度为0mg/l的增殖壮苗培养基处理黄精丛生芽，未筛选到突变体。因此优选以多效唑浓度为15mg/l～30mg/l的增殖壮苗培养基处理黄精丛生芽。

上述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。