本发明涉及一种用硝普钠(snp)与间歇浸没式生物反应器相结合使重楼种子快速萌发成苗的方法，属于珍稀药用植物繁殖技术领域。
背景技术：
重楼(paris)是百合科重楼属的多年生草本植物，是一种重要的中药材，其中滇重楼和七叶一枝花的干燥根茎组织在《中国药典》(2015版)中被认定为常用药材重楼的药源。现代药理学表明，重楼的根茎具有镇静镇痛、平喘、止血及抑菌消炎等作用，特别是近年来发现其在抗肿瘤方面疗效显著。因此，在经济利益驱动下，重楼野生资源被不断的掠夺式采挖，濒临灭绝。因此进行人工繁殖，不仅能保护滇重楼的野生资源，并且能满足不断增长的市场需求。
当前生产上常用的人工繁殖方式以根茎繁殖法为主。根茎切块繁殖虽然目前最为成功，但依然有缺点与不足之处。第一，根茎是经济器官，切割后会增加成本，且用种量大。第二，需大量留种，易发生腐烂，并遭受鼠害侵袭。第三，繁殖系数虽高，但周期长，无法满足生产需要。而利用种子进行人工繁育，具有繁殖系数大、生产成本低等优点，还可以避免根状茎繁殖对药用部分的消耗，大大提高繁殖系数，又能降低组织培养引起的遗传变异风险，是缓解重楼资源短缺的有效途径。然而，重楼生长繁殖缓慢，自然状态下，种子播种需要两冬一夏才能萌发，此后还要继续生长5-7年才能入药，这一缺点严重限制了重楼的来源。因此，人工打破种子休眠，提高发芽率，已成为大规模人工繁育重楼所要面临的重要课题。
目前变温层积促进重楼种子萌发是采用较多的方法，即将种子进行高温和低温交替处理，从而促进种子提早萌发，但是该过程的处理时间也较长，一般需要120-200天。此外，利用植物激素如ga3、ctk和化学药剂peg等对重楼种子进行处理，也能在不同程度上促进种子的萌发。虽然这些种子繁育技术均能一定程度上促进种子的萌发，但是在实际生产中发现，层积和激素处理所耗费的时间仍然较长。并且由于重楼种子萌发周期较长，在促萌过程中也常常需要进行人工补水、换气等工作，因此常常会出现水分和通气状况掌握不当而导致种子腐烂和发霉，所以有必要研究出更加高效快速的方法来促进种子萌发，从而在根本上解决重楼稀缺的现状。
一氧化氮是一种气体信号分子，它具有解除植物种子休眠的作用。硝普钠(snp)是一氧化氮的供体，其水溶液能够促进种子的萌发，本实验室的前期研究中发现，利用适当浓度的硝普钠水溶液浸泡处理重楼种子，能够快速促进种子萌发。然而硝普钠溶液在提供一氧化氮的同时，还会释放出有毒的氰化物，因此长时间浸泡处理会对种子产生毒害作用。相反，若浸泡时间过短则不能起到有效促进萌发的效果。
技术实现要素：
为克服现有的重楼种子萌发技术中种子处理操作麻烦且萌发时间长的缺点，本发明提供了一种用硝普钠与间歇浸没式生物反应器相结合的方法使重楼种子快速萌发的方法。
实现本发明上述目的所采用的技术方案为：
一种促使重楼种子快速萌发成苗的方法，包括以下步骤：(1)对采摘的重楼种子进行预处理：将采摘的成熟的重楼种子除去外种皮，冲洗干净后将种子放在室内阴干，然后放置于0～4℃下备用；
(2)检查间歇浸没式生物反应器的密闭性，然后对间歇浸没式生物反应器进行灭菌处理；
(3)取步骤(1)中的重楼种子，先用水浸泡过夜，使种子充分吸胀变得圆润饱满，然后在无菌条件下为种子灭菌，并确认灭菌彻底，无染菌现象；
(4)培养萌发：将上步骤中灭菌完全的种子置于间歇浸没式生物反应器内进行培养，在间歇浸没式生物反应器中加入灭菌蒸馏水，每升灭菌蒸馏水中含有50～150μmol的snp，每个间歇浸没式生物反应器中接种350～500粒重楼种子，间歇浸没式生物反应器中重楼种子的浸没频率为3～5分钟/6h，在阴暗环境下进行培养，培养过程中记录种子胚根突破的最初时间，并定期统计种子的萌发率，以及种子的胚根长度≥3cm的百分率。
步骤(1)中去除重楼外种皮的过程中，不能使种子表面破损，并且外种皮去除后，将重楼种子用清水冲洗2～5道，彻底去除外种皮残留物；同时种子冲洗干净后切忌暴晒和烘干，以免影响种子的萌发率。
步骤(2)中检查密闭性的方法如下：在间歇浸没式生物反应器内装入1l清水，观察它的密闭性并将加入清水的间歇浸没式生物反应器接到泵上，观察过滤嘴是否倒流。
步骤(2)中灭菌的方法如下：将清洗干净的间歇浸没式生物反应器放入到高压灭菌锅内灭菌，等其冷却后用纸张包起来，进行再次灭菌，纸张包裹反应器的时候先包住上层，用棉线锁紧，再包底座，用第二条棉线继续锁紧，将尖锐的部分用透明胶粘住，底座需全部用胶带粘上，防止灭菌后尖锐物体戳破底座。
步骤(3)中为种子灭菌的方法如下：在超净工作台内，用无菌水清洗种子3～5次，然后使用体积浓度75％的酒精消毒30～45s，消毒后立即用无菌水清洗3～5次，再使用为质量浓度0.1～0.2％的升汞浸泡10～15分钟，再用无菌水清洗5次；
将培养皿进行灭菌处理，灭菌后在培养皿底部铺2层滤纸，并在培养皿中滴加无菌水至刚好湿润滤纸；将灭菌后的种子分装入培养皿内进行培养，先小份单独培养5天，观察种子是否灭菌彻底，随后将未出现染菌的种子移入间歇浸没式生物反应器。
步骤(4)中，将灭菌彻底的种子移入间歇浸没式生物反应器中时，需在超净工作台操作，并且用酒精灯将间歇浸没式生物反应器的盖子四周灭菌后，方可打开反应器盖子。
步骤(4)中，每个间歇浸没式生物反应器中加入1l灭菌蒸馏水，且每升灭菌蒸馏水中含有150mg的卡那霉素和50mg的纳他霉素。
与现有的重楼的促萌、育苗技术相比较，本发明所提供的间歇式浸没方法，不仅能起到间隔浸没的目的，同时还能够自动的通风换气，因此既能够充分发挥snp的促萌作用，又不对种子产生毒害作用，同时在促萌期间不需要人工对种子补充水分、通风换气等工作。该方法操作简单、节省人力的同时更是有效降低了因水分和通气状况掌握不当而导致种子腐烂和发霉的几率。另外，该方法大大缩短了萌发时间，提高了萌发率。经试验证实，本发明中在75天就可以达到萌发率90％以上，种子萌发后的壮苗率(萌发后胚根长≥3cm的种子所占的比例——温室及田间实验表明胚根长≥3cm的种子更易于成活)也显著提高，并且生产成本显著降低。利用此方法使得重楼种子的萌发率和壮苗率达到了最佳的组合状态，更加经济有效。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下实施例。
实施例1
(1)将当年采摘的七叶一枝花成熟种子，去除颖壳，然后装入透气的纱网袋中，用手搓去红色外种皮，然后用流动的清水将七叶一枝花种子用清水冲洗3～4遍，彻底去除外种皮残留物。然后放置在报纸上，于室内阴干3～5天，放在4℃冰箱备用。
(2)将新型反应器用清水冲洗干净，然后在反应器内装入1l清水，观察它的密闭性并将加入清水的反应器接到泵上，观察过滤嘴是否倒流。将密闭好的反应器放入到高压灭菌锅内灭菌，121℃，20分钟，待反应器冷却后用将其用报纸包起来，再次进行灭菌。
(3)将阴干的七叶一枝花种子，先用清水浸泡24h，使种子充分吸胀变得圆润饱满。然后在超净工作台内，先用无菌水清洗种子3～5次；然后使用75％酒精消毒30s，无菌水洗3～5次；再使用0.1％升汞溶液浸泡10～15分钟，无菌水洗5次；最后在铺有2层滤纸的150mm培养皿内进行培养(培养皿预先灭菌)，滴加无菌水，以刚好湿润滤纸为宜，用封口膜将培养皿封好。放入人工气候培养箱25±2℃暗培养，培养5天后进行观察，若发现滤纸上长有霉菌，则将培养皿内发霉种子与培养皿则清洗掉，灭菌彻底的种子移至反应器内培养。
(4)用酒精灯将反应器的盖子四周灭菌后，打开反应器盖子。然后将含有50～150μmol/lsnp或者500mg/lga3l的灭菌蒸馏水(1l)倒入反应器。各个处理中需加入抗生素(150mg/l卡那霉素和50mg/l纳他霉素)。每个反应器中接种400粒重楼种子，接种完毕，拧紧螺丝后在缝隙处封一条封口膜。
(5)反应器放置在避光处，反应器浸没频率为3分钟/6h，培养条件为温度25±1℃，相对湿度60％，培养时间为105d。记录好种子初见胚根时间和每隔一段时间天统计一次萌发率，种子萌发的标志以胚根刚刚突破种皮作为标准，壮苗率以胚根长≥3cm的种子所占的比例为标准。
本实施例中以清水和本实验室前期验证过的最适合浓度的ga3(500mg/l)作为对照，设置了不同浓度的硝普钠溶液浸泡种子，发现使用100μmol/l的硝普钠溶液效果最好，在35天时即突破种皮，相比赤霉素和清水分别提前3天和9天。在75天时，100μmol/l的硝普钠溶液处理中种子的萌发率可高达90％，高于赤霉素处理，且远高于其他浓度和清水处理。在第105天时，壮苗率达到了73.2％，显著优于对照和500mg/lga3处理，说明使用100μmol/l硝普钠溶液浸泡种子能明显促进七叶一枝花种子的提早萌发，并能显著提高萌发种子的壮苗率。而且相比赤霉素的价格，硝普钠更加经济实惠，在生产上具有更大优势。
实施例2
选用当年采摘的滇重楼种子进行萌发实验，去除颖壳后，然后人工用手搓去红色外种皮，并用细孔筛慢慢筛去外种皮，然后用流动的清水将七叶一枝花种子用清水冲洗3-4遍，彻底去除外种皮残留物。接着放置在报纸上，于室内室内阴干3-5天，放在4℃冰箱备用。
将阴干的滇重楼种子，先用清水浸泡24h，使种子充分吸胀变得圆润饱满。然后在超净工作台内，对种子进行灭菌，放入人工气候培养箱20±2℃暗培养，培养5天后进行观察，若发现滤纸上长有霉菌，则将培养皿内发霉种子与培养皿则清洗掉，灭菌彻底的种子移至反应器内培养。
用酒精灯将反应器的盖子四周灭菌后，打开反应器盖子。然后加入1l含有100μmol/lsnp的灭菌蒸馏水，以1l的灭菌蒸馏水为对照，3次重复试验，每次100粒种子。结果：100μmol/lsnp处理中，45天时有20.33％的种子胚根突破种皮，75天时滇重楼种子的萌发率达到91.01％，第105天时壮苗率达到75.4％。
总结：由以上实施例能够看出，本发明提供的是一种操作简便、萌发时间短且能够用于大量重楼种子促萌的繁殖技术。经过实验室萌发统计，申请人发现，采用本发明提供的方法培养的种子在使用100μmol/l的硝普钠溶液效果最好，在35天时即突破种皮，相比赤霉素和清水分别提前3天和9天。在75天时，100μmol/l的硝普钠溶液处理中种子的萌发率可高达90％，高于赤霉素处理，且远高于其他浓度和清水处理。说明使用100μmol/l硝普钠溶液浸泡种子能明显促进重楼种子的提早萌发，并提高其萌发率。而且相比赤霉素处理，硝普钠的效果更好，且其价格更加经济实惠，在生产上具有更大优势。间歇浸没式生物反应器的容量为高270mm，直径270mm，下部容积为1.5l；其体积原大于常用的培养皿和烧杯等器具，一次处理的种子量远远超过传统的方法，能够真正实现对重楼种子的大量促萌，同时在种子促萌过程中不需要人为的补水和换气等，降低了种子霉烂和染菌的几率，操作简单且节约了生产成本。该组合方法不仅能够加快种子的萌发进程，同时能够提高种子的壮苗率，在萌发的105天100μmol/l的硝普钠溶液处理中，胚根≥3cm的种子百分率达到了73.2％，远高于对照组和赤霉素处理组。