间充质干细胞冻存液、制备方法及其冻存方法与流程

本发明涉及细胞冻存
技术领域：
，尤其涉及一种间充质干细胞冻存液、制备方法及其冻存方法。
背景技术：
：间充质干细胞是一群中胚层来源的具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，其在骨髓、胎盘、脐带、羊膜、肌肉、脐血等组织中广泛存在。由于这种间充质干细胞具有取材方便、体外扩增简单迅速等优点，在临床细胞治疗中具有广阔的应用前景，可用于治疗红斑狼疮和硬皮病等自身免疫性疾病，降低细胞或器官移植后的免疫排斥反应，提高细胞或器官移植的成功率等。国内外已将间充质干细胞应用于大量的动物试验及临床研究中。间充质干细胞从生物体组织块中取材以后，可以通过简单的细胞培养方法进行大量扩增。在实际的使用过程中，扩增后获得的间充质干细胞有时需要被冻存起来，以备于科研及临床时随时复苏使用。一般的细胞冻存过程为：将需要冻存的细胞加入冻存液后分装到冻存管中，封口后逐渐阶梯式降温后，移动至液氮罐中进行低温长期保存。在需要重新使用这些细胞时，则将冻存管从液氮罐中取出并进行细胞复苏。在实现本发明的过程中，申请人发现现有技术中存在如下问题：在进行细胞冻存时，需要向细胞加入冻存液以保护细胞。现有的细胞冻存液是通用的冻存液，通常是由10％dmso、10％胎牛血清以及80％基础培养基组成。但是这种配方和方法冻存脐带间充质干细胞均效果不理想，复苏后的细胞得率和活率均较低，不利于冻存后细胞的使用。技术实现要素：鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种间充质干细胞冻存液、制备方法及其冻存方法，旨在解决现有技术中细胞冻存液冻存效果不理想，细胞复苏效果不佳的问题。为了达到上述目的，本发明实施例第一方面提供一种间充质干细胞冻存液。所述冻存液由配合使用的a液和b液组成；所述a液按照体积百分比计算，包括如下成分：所述b液按照体积百分比计算，包括如下成分：dmem培养基78-80％psg1-2％dmso20％。可选地，所述a液按照体积百分比计算，包括如下成分：所述b液按照体积百分比计算，包括如下成分：dmem培养基79％psg1％dmso20％。本发明实施例第二方面提供一种间充质干细胞冻存液的制备方法，其特征在于，包括：按体积百分比计算，将70-80％的dmem培养基、1-2％的psg，20-30％的fbs以及0.1-0.3％的β-疏基乙醇混合均匀，制备a液；按体积百分比计算，将78-80％的dmem培养基、1-2％psg以及20％的dmso混合均匀，制备b液：将所述a液和所述b液放置在4℃中保存备用。可选地，按体积百分比计算，所述a液由如下成分混合均匀形成：78.8％的dmem培养基、1％的psg，20％的fbs以及0.2％的β-疏基乙醇；按体积百分比计算，所述b液由如下成分混合均匀形成：79％的dmem培养基、1％psg以及20％的dmso。本发明实施例第三方面提供应用如上所述的间充质干细胞冻存液的细胞冻存方法。所述细胞冻存方法包括如下步骤：收集间充质干细胞；按照预定的比例，先向所述间充质干细胞加入a液，将间充质干细胞沉淀充分混匀，获得第一细胞悬液；然后向第一细胞悬液中加入与a液等体积b液并充分混匀后，获得第二细胞悬液；将所述第二细胞悬液分装至若干根冻存管并封口；按预定降温程序对所述冻存管进行降温后，将冻存管移入液氮罐保存。可选地，所述预定的比例为：每5×106个间充质干细胞加入1ml细胞冻存液。可选地，所述预定降温程序为：依次在4℃下降温30分钟；-20℃下降温2小时；-80℃下降温16至18小时。可选地，所述将所述第二细胞悬液分装至若干根冻存管并封口，具体包括：向每根冻存管中装入1ml的第二细胞悬液。可选地，所述按照预定的比例，向所述间充质干细胞依次加入a液和b液并充分混匀后，获得第二细胞悬液，具体包括：对收集的间充质干细胞进行细胞计数；向5×106间充质干细胞中，加入0.5ml的a液并充分混匀；继续加入0.5ml的b液并充分混匀，获得所述第二细胞悬液。可选地，所述收集间充质干细胞，具体包括：待传代培养后的间充质干细胞的细胞融合度达70－80％时，加入胰蛋白酶消化液进行细胞消化；静置消化3分钟后，加入生理盐水停止消化，并收集第二细胞悬液；将所述第二细胞悬液进行离心，收集获得所述间充质干细胞。本发明实施例提供的冻存液，分为搭配使用的a液和b液，通过这样的方式，可以减少吹打混匀细胞的次数并且缩短二甲基亚砜与细胞的接触时间，降低其对于细胞的毒性，从而有效的提高细胞冻存后，细胞复苏时的得率和存活率。附图说明一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定，附图中具有相同参考数字标号的元件表示为类似的元件，除非有特别申明，附图中的图不构成比例限制图1为本发明具体实施例的冻存液制备方法的方法流程图；图2为本发明具体实施例的冻存方法的方法流程图。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明实施例中揭露的数值及其数值范围是近似值，而并非确定值。在误差或者实验条件允许的情况下，可以包括在误差范围内的所有值。本发明实施例中提供的数值范围用于表示在混合物中的组分的相对量以及其他方法实施例中列举的温度或者其他参数的范围。本发明实施例中表述的术语“冻存”是指通过程序性降温的方式，在超低温环境(通常为液氮)中保存细胞或者组织，确保细胞或者组织在保存过程中的生物活性或者繁殖能力不丧失。在冻存过程中，需要在冻存管中加入相应的冻存液以确保细胞或者组织在冻存过程中不受到损伤，在复苏后可以重新进行传代培养并保持生物特性不改变。如何配置合适的冻存液配方，用以保持相关的组织或者细胞是干细胞在组织工程学及再生医学中广泛应用的基础和前提。为了满足间充质干细胞的低温冻存需求，在本实施例中，可以应用本发明提供的冻存液，确保冻存过程中间充质干细胞的生物活性不会丧失，复苏后具有足够的细胞得率和活率。图1为本发明实施例提供的间充质干细胞冻存液的制备方法。如图1所示，所述制备方法包括如下步骤：110、按体积百分比计算，将70-80％的dmem培养基、1-2％的psg，20-30％的fbs以及0.1-0.3％的β-疏基乙醇混合均匀，制备a液。120、按体积百分比计算，将78-80％的dmem培养基、1-2％psg以及20％的dmso混合均匀，制备b液。其中，psg是指青霉素-链霉素双抗及谷氨酰胺的混合物，fbs是指胎牛血清，dmso是二甲基亚砜。在本实施例中，该间充质干细胞由a液和b液两个独立的混合液组成。所述a液和b液需要配合使用，以发挥冻存液的效果。具体的，所述a液可以由78.8％的dmem培养基、1％的psg，20％的fbs以及0.2％的β-疏基乙醇混合均匀形成，所述b液可以由79％的dmem培养基、1％psg以及20％的dmso混合均匀形成。在实际使用时，a液和b液1比1配合使用，从而确保dmso在冻存液中的比例为10％(按体积比计算)。130、将所述a液和所述b液放置在4℃中保存备用。所述4℃的低温环境具体可以是由常规的冰箱所提供的，可以通过将所述a液和b液放置在冰箱中来完成预冷的过程。在本实施例中，所述预冷的时间具体可以是1小时。由于dmso(二甲基亚砜)在常温下对于细胞的毒性较大，通过上述分为双组份的冻存液的方式，可以有效的降低二甲基亚砜与细胞的接触时间。另外，在4℃预冷的情况下，也可以降低二甲基亚砜对于细胞的毒性。上述制备方法制备的冻存液可以用作间充质细胞的长期冻存中，作为保护液使用，在低温冻存时，保护间充质干细胞。应当说明的是，该冻存液需要在4℃时使用。亦即，该冻存液的a液和b液在加入间充质干细胞时，液体的温度均为4℃左右。以下结合具体实例，详细描述应用上述任一方法实施例公开的冻存液，对间充质干细胞的低温冻存方法。图2为本发明实施例提供的间充质干细胞的低温冻存方法的方法流程图。如图2所示，所述方法可以包括如下步骤：210、收集间充质干细胞。所述间充质干细胞具体可以是来自任何合适来源的间充质干细胞。针对不同来源的间充质干细胞可以使用不同的方法进行干细胞的收集或者获取。这些间充质干细胞还可以经过传代培养，扩增后获得的干细胞。例如，所述间充质干细胞可以是来自第二代传代培养后的间充质干细胞。所述间充质干细胞的收集方法如下：首先，待传代培养后的间充质干细胞的细胞融合度达70－80％时，加入胰蛋白酶消化液进行细胞消化。然后，待贴壁培养的间充质干细胞静置消化3分钟后，加入生理盐水停止消化并收集第二细胞悬液；最后，将所述第二细胞悬液进行离心分离，收集位于底层的沉淀物即可获得所述间充质干细胞。220、按照预定的比例，先向所述间充质干细胞加入a液，将间充质干细胞沉淀充分混匀，获得第一细胞悬液；然后向第一细胞悬液中加入与a液等体积b液并充分混匀后，获得第二细胞悬液。冻存时，加入的冻存液的量应当与细胞数量相匹配，加入过多的冻存液或者过少的冻存液均会对细胞的冻存过程产生影响。较佳的是，所述预定的比例为每5×106个间充质干细胞加入1ml细胞冻存液。这样的冻存液加入比例可以很好的满足细胞冻存的需求。由于上述实施例提供的是一种双组份的细胞冻存液。在实际使用过程中，首先加入的是a液，然后在加入b液，两者充分混匀后获得间充质干细胞在细胞冻存液中悬浮分散的细胞悬液。230、将所述第二细胞悬液分装至若干根冻存管并封口。该冻存管是在冻存过程中常用的，用于容纳冻存的生物体的容器。其具体可以根据实际情况的需求，采用现有技术中任何合适类型的冻存管。240、按预定降温程序对所述冻存管进行降温后，将冻存管移入液氮罐保存。在将细胞悬液封装在冻存管以后，可以通过阶梯式降温的方式，将冻存管逐渐降到较低的温度后，移入液氮罐中进行保存。所述液氮罐用于提供低温冻存的超低温环境。在一些实施例中，也可以使用其他合适的超低温设备来长期保存所述间充质干细胞。在一些实施例中，为了确保获得更好的低温冻存效果，所述预定降温程序可以包括如下三个不同降温阶段：首先，在4℃下降温30分钟。然后，在-20℃下降温2小时。最后，在-80℃下降温16至18小时。在一些实施例中，所述步骤220具体可以包括如下步骤：首先，对收集的间充质干细胞进行细胞计数，确定需要加入的冻存液体积。在本实施例中，假设间充质干细胞的数量为5×106，需要加入的冻存液体积为1ml。然后，向收集获得间充质干细胞中，加入0.5ml的a液并充分混匀，获得第一细胞悬液。最后，向第一细胞悬液快速的加入0.5ml的b液并充分混匀，获得所述第二细胞悬液。在本实施例中，a液和b液的使用体积配比可以为1比1。亦即加入的冻存液总量中，a液和b液各占一半。这样的细胞冻存液使用方式，由于是双组份形式，dmso只存在于后加入的b液，可以缩短dmso与细胞的接触时间，降低其毒性作用。另外，含有dmso的冻存液也不需要进行反复吹打混匀，也可以进一步的降低其对细胞的损伤。为了进一步的验证本发明实施例提供的冻存液和冻存方法对于间充质干细胞的冻存效果，以下提供相应的复苏以及鉴定的具体结果来说明。在本实施例中，所述复苏和传代培养的方法包括如下步骤：1)从液氮罐中取出冻存1年以上的，保存有间充质干细胞的冻存管并放入40℃恒温水浴锅中，迅速摇晃至完全溶解。其中，为了进行鉴定和对比，选取使用本发明实施例提供的冻存液进行冻存的冻存管1、冻存管2以及冻存管3以及使用惯常的冻存液进行冻存的冻存管4、冻存管5以及冻存管6进行复苏和鉴定实验。所述冻存管1至冻存管6冻存的细胞均来自于同一代传代培养的间充质干细胞。2)转入30ml，37℃余热的间充质干细胞完全培养基中混匀。然后，离心弃上清。3)用间充质干细胞完全培养基重悬沉淀后，使用台盼蓝染色法计数。4)将6组冻存管中复苏后的细胞以fitc标记的cd45、cd90，pe标记的cd34、cd73、cd105、hla-dr进行流式细胞仪检测。5)根据细胞计数结果计算获得的6组冻存管的细胞得率和细胞活率具体如下表格所示：组别冻存管1冻存管2冻存管3冻存管4冻存管5冻存管6细胞得率93.49％93.66％93.38％87.30％87.19％86.99％细胞活率96.45％96.73％96.53％95.13％94.89％95.26％其中，细胞得率和细胞活率的计算方式分别为：细胞得率＝复苏细胞数/冻存时细胞数×100％细胞活率＝(细胞总数-着色细胞数)/细胞总数×100％根据以上表格中的细胞得率和细胞活率数据可以看出：冻存管1至冻存管3的细胞得率明显高于冻存管4至冻存管6。冻存管1至冻存管3的细胞活率也略高于冻存管4至冻存管6。因此，使用本发明实施例提供的冻存液的冻存效果较好，最终复苏后获得的活细胞比例显著提高。6)冻存管1至冻存管3的流式细胞仪检测的检测结果具体如下表格所示：根据上述流式细胞学检测结果显示：冻存管1至冻存管3复苏后的间充质干细胞均能够高表达阳性标记物cd73、cd90、cd105，不表达阴性标记物cd34、cd45、hla-dr，符合间充质干细胞的表型特征。该鉴定结果说明：应用本发明实施例提供的冻存液及冻存方法冻存后的间充质干细胞能保持它原有的活性，具有较高的细胞得率和细胞活率。经过冻存后复苏的充质干细胞与新鲜的，未经过冻存的组织培养获得的脐带间充质干细胞之间并无差异。可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。当前第1页12