用于马铃薯晚疫病的生物杀虫剂的制作方法

本申请是有关用于治疗、控制和/或预防马铃薯晚疫病的生物杀虫剂。更具体地说，本申请是有关适用于控制引起马铃薯晚疫病的病原体的细菌菌株。马铃薯晚疫病因其牵涉1840年代的爱尔兰马铃薯饥荒而声名狼藉，其由马铃薯植物(马铃薯(solanumtuberosuml.))以及如番茄和茄子的其它茄属农作物受病原性卵菌(水霉菌)致病疫霉(phytophthorainfestans(mont.)debary)感染而造成。感染的特征在于植物茎干和叶片上的黑色/棕色病变，其快速扩张并变为坏死。所采集的患病马铃薯块茎可能在储存时腐烂，或如果其在储存设施中或在土壤中越冬存活，那么可能将疾病扩散到来年的农作物中。目前的控制措施涉及整合的害虫控制方法，包括对病原体进行的群体监测；预防性措施，如轮种和消毒(从农场消除或排除感染的植物部分)；研发抗性农作物变种；和使用化学杀真菌剂，其可能要求每季度施用高达12-15次，花费数百万美元成本。然而，致病疫霉适应性极高，并且各种新基因型已发展出针对主要杀真菌剂(包括甲霜灵(metalaxyl)和精甲霜灵(mefenoxam))的耐药性或克服农作物抵抗性的能力。因此，马铃薯晚疫病是持续性问题并且是世界上对经济影响最显著的马铃薯和番茄疾病，估计全球每年产生超过67亿美元的农作物损失和其它控制措施成本。生物杀虫剂是含有天然存在的杀灭目标害虫、抑制或降低其活力的微生物的调配物，其是化学杀虫剂和其它害虫控制机制的合乎期望的替代方案。此类生物杀虫剂通常展示较低人类和哺乳动物毒性，不在其天然宿主之外存活或存留于环境中，并且一般被视为安全的。生物杀虫剂的微生物组分通常是呈在施用后可以传播并感染目标害虫的形式的细菌、真菌或病毒。微生物可以对特定害虫物种具有宿主特异性，或针对一系列害虫物种具有广谱活性。使用大规模发酵技术大批量生产此类微生物有助于生物杀虫剂生产和使用的商业可行性。因此，期望获得可用于控制马铃薯晚疫病的微生物和其生物杀虫性调配物。技术实现要素：在一个方面中，本发明提供一种在植物中有效控制、治疗或预防马铃薯晚疫病的细菌培养物。在至少一个实施例中，所述细菌培养物包含一或多种选自以下的细菌：绿针假单胞菌(pseudomonaschlororaphis)菌株189、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)菌株wausv36、荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)菌株uwo1、荧光假单胞菌菌株kengft3、节杆菌属(arthrobactersp.)菌株oy3wo11和泛菌属(pantoeasp.)菌株oxwo6b1。本发明的另一个方面提供一种来自如本文所描述的细菌培养物的提取物，其中所述提取物在植物中有效控制、治疗或预防马铃薯晚疫病。在另一个方面中，本发明提供一种在植物中有效控制、治疗或预防马铃薯晚疫病的生物杀虫性调配物，其包含如本文所描述的细菌培养物或其提取物，和载剂。本发明的另一个方面提供一种如本文所描述的细菌培养物或生物杀虫性调配物的用途，其用于在植物中控制、治疗和/或预防马铃薯晚疫病。本发明的又另一个方面提供一种在植物中控制、治疗或预防马铃薯晚疫病的方法，所述方法包括向受致病疫霉感染或具有受致病疫霉感染的风险的植物或其部分施用如本文所描述的细菌培养物或其提取物或其生物杀虫性调配物。附图说明本发明的其它特征将因以下书面描述和附图而变得显而易见，其中：图1的条形图展示各种细菌菌株对致病疫霉基因型us-08、us-23和ca-10生长的体外控制百分比；图2的条形图展示感染有致病疫霉基因型us-08的马铃薯叶片在存在各种细菌悬浮液和无细胞细菌滤液的情况下的疾病严重程度百分比；图3的条形图展示在存在各种细菌悬浮液的情况下，在感染之后10天时，马铃薯叶片中的致病疫霉基因型ca-09(a1)生长的控制百分比；图4的条形图展示在存在各种细菌悬浮液的情况下，在感染之后7天时，感染有致病疫霉基因型us-22(a2)的马铃薯叶片中的疾病严重程度百分比；图5的条形图展示在存在各种细菌悬浮液的情况下，在感染之后10天时，感染有致病疫霉基因型us-22(a2)的马铃薯叶片中的疾病严重程度百分比；图6的图展示如由阻抗量测所确定，在存在无细胞细菌培养物滤液或无菌培养基(阳性对照物)的情况下，致病疫霉在基本培养基(mm)中的生长。“ns”指示在p＝0.05水平下与对照物无明显不同；“**”指示在p＝0.01水平下与对照物明显不同。图7的图展示如由阻抗量测所确定，在存在无细胞细菌培养物滤液或无菌培养基(阳性对照物)的情况下，致病疫霉在马铃薯右旋糖培养液(pdb)中的生长。“ns”指示在p＝0.05水平下与对照物无明显不同；“*”指示在p＝0.05水平下与对照物明显不同，并且“**”指示在p＝0.01水平下与对照物明显不同。图8的条形图展示如由阻抗量测所确定，与在存在无菌培养基(阳性对照物)的情况下的生长相比，致病疫霉在存在无细胞细菌培养物滤液的情况下在120小时时生长减少的百分比。根据杜凯氏测试(tukey'stest)(杜凯(tukey),j.“在方差分析中比较个体平均值(comparingindividualmeansintheanalysisofvariance).”生物计量学(biometrics)(1949)5(2):99-114)，用相同字母(对pdb和mm培养基分别是a/a、b/b或c/c)指示的平均值在p＝0.05水平下无明显不同。具体实施方式本发明提供一或多种细菌菌株或其培养物，其适用作针对病原体致病疫霉的生物杀虫剂，所述致病疫霉是马铃薯晚疫病的致病因素。从由苏珊·博耶克(susanboyetchko)博士(加拿大农业与农业食品部(agricultureandagri-foodcanada))建立的培养物保藏中心获得细菌菌株用于初始筛选。保藏中心的细菌由从跨加拿大大草原采集的根际土壤、根或种子分离和纯化。在至少一个实施例中，细菌菌株选自绿针假单胞菌菌株189、枯草芽孢杆菌菌株wausv36、荧光假单胞菌菌株uwo1、荧光假单胞菌菌株kengft3、节杆菌属菌株oy3wo11和泛菌属菌株oxwo6b1。依据布达佩斯条约(budapesttreaty)，绿针假单胞菌菌株189寄存物于2016年11月17日由加拿大公众卫生局(publichealthagencyofcanada)国家微生物实验室(nationalmicrobiologylaboratory)加拿大国际保管机构(internationaldepositaryauthorityofcanada；idac)，加拿大曼尼托巴省温尼伯市阿林顿街1015号r3e3r2(1015arlingtonstreet,winnipeg,manitoba,canadar3e3r2)接收(登录号：151116-02)。绿针假单胞菌菌株189的完全基因组已经以登录号cp014867寄存在日本dna数据库(dnadatabankofjapan；ddbj)/欧洲分子生物学实验室(europeanmolecularbiologylaboratory；embl，欧洲核苷酸档案(europeannucleotidearchive；ena))/genbank(唐恩(town)等人,基因组通告(genomeannouncements)(2016年5月/6月)4(3):e00581-16)。枯草芽孢杆菌菌株wausv36寄存物由idac于2016年11月17日接收(登录号：151116-01)。枯草芽孢杆菌菌株wausv36的基因组序列草图已经以登录号lwlq00000000和lwlq01000000寄存在ddbj/embl/genbank(唐恩等人,基因组通告(2016年5月/6月)4(3):e00586-16)。荧光假单胞菌菌株uwo1寄存物由idac于2016年11月17日接收(登录号：151116-03)。荧光假单胞菌菌株kengft3寄存物由idac于2016年11月17日接收(登录号：151116-05)。荧光假单胞菌菌株kengft3的基因组序列草图已经以登录号cp014868寄存在ddbj/embl/genbank(唐恩等人,基因组通告(2016年5月/6月)4(3):e00428-16)。节杆菌属菌株oy3wo11寄存物由idac于2016年11月17日接收(登录号：151116-04)。节杆菌属菌株oy3wo11的基因组序列草图已经以登录号lwlp00000000和lwlp01000000寄存在ddbj/embl/genbank(唐恩等人,基因组通告(2016年5月/6月)4(3):e00585-16)。泛菌属菌株oxwo6b1寄存物由idac于2016年11月17日接收(登录号：151116-06)。泛菌属菌株oxwo6b1的基因组序列草图已经以登录号lwlr00000000和lwlr01000000寄存在ddbj/embl/genbank(唐恩等人,基因组通告(2016年5月/6月)4(3):e00582-16)。在至少一个实施例中，细菌菌株在一或多种茄属农作物中有效控制、治疗或预防马铃薯晚疫病。在至少一个实施例中，细菌菌株有效控制、治疗或预防致病疫霉对一或多种茄属农作物的感染。在至少一个实施例中，茄属农作物马铃薯。在至少一个实施例中，茄属农作物是番茄。本发明还提供一种来自一或多种如本文所描述的生物杀虫性细菌菌株的提取物。在至少一个实施例中，提取物是其中已生长一或多种生物杀虫性细菌菌株的培养基的提取物。在至少一个实施例中，提取物是无细胞提取物。在至少一个实施例中，无细胞提取物含有一或多种具有针对致病疫霉的抗真菌活性的化合物。在至少一个实施例中，一或多种具有针对致病疫霉的抗真菌活性的化合物是细菌次级代谢物。在至少一个实施例中，细菌菌株的提取物在一或多种茄属农作物中有效控制、治疗或预防马铃薯晚疫病，或有效控制、治疗或预防致病疫霉对一或多种茄属农作物的感染。在不受理论限制的情况下，预期细菌培养物或其提取物可以通过一或多种机制发挥针对致病疫霉的抗真菌活性。在至少一个实施例中，细菌可以用以诱导或防止致病疫霉中一或多种基因的表达，由此引起抗真菌作用。在至少一个实施例中，细菌可以产生一或多种可以发挥针对致病疫霉的抗真菌活性的化合物，包括(但不限于)次级代谢物。在至少一个实施例中，细菌可以用以在宿主植物中诱导针对致病疫霉感染的抵抗性。在至少一个实施例中，细菌可以用以诱导宿主植物中一或多种基因的表达，与在不存在细菌的情况下的宿主植物相比，所述基因使所述宿主植物对致病疫霉感染更具抵抗性。在至少一个实施例中，细菌可以用以防止宿主植物中一或多种基因的表达，与在不存在细菌的情况下的宿主植物相比，所述基因使所述宿主植物更易受致病疫霉感染。在至少一个实施例中，细菌菌株或其提取物(包括(但不限于)其无细胞提取物)可以被调配成用于向具有受致病疫霉感染危险或具有患马铃薯晚疫病危险的茄属农作物施用的生物杀虫性调配物。在至少一个实施例中，生物杀虫性调配物包含细菌菌株或其提取物，和一或多种农业上可接受的载剂。所属领域中已知的可以有益地改变调配物特性的其它添加剂也可以存在。此类添加剂例如改变或改善调配物的处置或施用的便利性或容易性、功效、安全性或成本效益中的一或多种。鉴于本文其它传授内容，技术人员将意识到用于制备此类调配物和测试所制备调配物的功效的方式。还涵盖在植物中控制、治疗或预防马铃薯晚疫病的方法。所述方法包括向受致病疫霉感染或具有受致病疫霉感染的风险的植物或其部分施用如本文所描述的细菌培养物或其提取物或其生物杀虫性调配物。如所属领域中已知的，细菌培养物、其提取物或其生物杀虫性调配物可以呈适用于此类施用的任何形式，并且可以通过任何已知方法来施用，并且可以在植物生命周期中施用细菌培养物、其提取物或其生物杀虫性调配物将有效控制、治疗或预防马铃薯晚疫病或致病疫霉感染的任何阶段施用。在至少一个实施例中，细菌培养物、其提取物或其生物杀虫性调配物通过喷雾来施用。在至少一个实施例中，将细菌培养物、其提取物或其生物杀虫性调配物施用于在田地中生长的植物。在至少一个实施例中，将细菌培养物、其提取物或其生物杀虫性调配物施用于栽培中的植物，包括(但限于)在温室或暖房中栽培的植物。在至少一个实施例中，在储存之前或期间将细菌培养物、其提取物或其生物杀虫性调配物施用于块茎。在至少一个实施例中，块茎是马铃薯块茎。在至少一个实施例中，在收获之前将细菌培养物、其提取物或其生物杀虫性调配物施用于果实。在至少一个实施例中，在收获之后将细菌培养物、其提取物或其生物杀虫性调配物施用于果实。在至少一个实施例中，果实是番茄果实。实例本发明的其它特征将由例如绘示本发明原理的以下非限制性实例而变得显而易见。实例1：微生物培养物细菌悬浮液：使维持在-80℃下的细菌培养物解冻，并且在假单胞菌属琼脂f培养基(含difcotm酪蛋白胰脏消化物(10.0g)、第3号朊间质蛋白胨(proteosepeptone)(10.0g)、k2hpo4(1.5g)、mgso4(1.5g)、琼脂(15.0g)和甘油(10g)的水(1l))上生长。将菌落接种到125ml酵母提取物葡萄糖培养基(ygm；含酵母提取物(2.0g)、右旋糖(2.5g)、缓冲溶液(10ml，kh2po4(25.0g/l)和k2hpo4(25.0g/l))和盐水溶液(10ml，mgso4·7h2o(10.0g/l)、mnso4·h2o(1.5g/l)、nacl(5.0g/l)和feso4·7h2o(0.5g/l))的水(1l总体积))中，并且在旋转振荡器(150rpm)上在500ml具有档板的烧瓶中于22℃下培育48小时，得到细菌悬浮液。无细胞细菌滤液：将细菌悬浮液以10,000rpm离心10分钟，并且使上清液真空过滤通过0.22μm非蛋白质结合性过滤器，得到无细胞细菌滤液。致病疫霉培养物致病疫霉分离株基因型ca-10(来自番茄的a1交配型)、us-08(来自马铃薯的a2交配型)和us-23(来自马铃薯的a1交配型)用于体外测试。致病疫霉分离株基因型ca-09(来自番茄的a1交配型)、ca-10(来自番茄的a1交配型)、us-08(来自马铃薯的a2交配型)和us-22(来自番茄的a2交配型)用于体内测试。所有致病疫霉分离株都维持在黑麦种子a琼脂(rsa)上(卡登(caten),c.e.和j.l.金克斯(jinks).“致病疫霉单个分离株的自发可变性.i.培养变化(spontaneousvariabilityofsingleisolatesofphytophthorainfestans.i.culturalvariation).”加拿大植物学杂志(can.j.bot.)(1968)46:329-348)。实例2：体外生物分析细菌悬浮液将致病疫霉(a1或a2交配型)的琼脂柱塞(0.5cm直径)放置在含有黑麦种子a琼脂(rsa)的皮氏培养皿(9cm直径)中心。将细菌悬浮液的等分试样(2μl)放置在接近培养板边缘处；在每一培养板上测试2-4个细菌菌株。在15℃下培育7天之后，测量抑制区。进行两次实验，每次使用四个复本。无细胞细菌滤液将无细胞细菌滤液或作为阴性对照物的无菌水分配在琼脂中(50％，v/v)。将病原体的菌丝柱塞放置在皮氏培养皿(9cm直径)中心，并且在于22℃下培育7和12天之后，测量菌丝生长。进行两次实验，每次使用四个复本。使用sastm软件来分析结果。控制百分比(％)计算如下：控制百分比(％)＝100-(b/cx100)其中b是在存在细菌滤液的情况下在第7天或第12天观察到的平均生长，并且c是在存在无菌水(对照物)的情况下在第7天或第12天观察到的平均生长。结果来自由苏珊·博耶克博士(加拿大农业与农业食品部)建立的培养物保藏中心的源自从加拿大大草原采集的多种土壤和植物根并代表不同分类学群组的细菌菌株作为细菌悬浮液在上文所描述的体外分析中进行测试。46种菌株在此分析中展示活性，并且选择其用于进一步测试。图1展示在第12天，这些所选细菌菌株中的20种的无细胞滤液针对致病疫霉基因型ca-10(a1，番茄)、us-08(a2，马铃薯)和us-23(a1，马铃薯)的控制百分比。如从图1可见，大部分所测试的细菌菌株无细胞提取物展示针对一或多种致病疫霉基因型的显著抑制活性。实例3：体内喂养离体叶片生物分析选择各自含有5个小叶的马铃薯叶片，并且使其在含有10％霍格兰氏溶液(hoagland'ssolution的50ml试管)中生长(霍格兰(hoagland),d.r.和艾侬(arnon),d.i.“用于在无土壤情况下使植物生长的水培方法(thewater-culturemethodforgrowingplantswithoutsoil)”加利福尼亚州伯克利的加州大学农业学院实验站通告(univ.calif.coll.agric.exp.sta.circ.berkeley,ca)(1938),347-353)。将叶片浸在所选择的如下文所描述的测试或对照处理中，在2小时后用致病疫霉悬浮液喷雾直到流走为止。将经过处理的叶片在22℃下在高湿度条件(86％-92％相对湿度)和每天16小时/每夜8小时的光照期下培育。在7和10天培育之后，通过估计受病原体影响的光合区域的比例来测量叶片上的疾病进展和严重程度(詹姆斯(james),1971:詹姆斯(james),w.c.植物疾病评定关键、其制备和使用图解丛书(anillustratedseriesofassessmentkeysforplantdiseases,theirpreparationandusage).加拿大植物疾病调查(canadianplantdiseasesurvey)(1971)51(2),39-65)。对五个小叶中的每一个的疾病覆盖面积进行单独评分(最大值为20)，并且将个别小叶的得分相加以得到每一叶片的总得分(最大值为100)。疾病严重程度百分比通过用经过处理的叶片的疾病严重程度等级除以叶片暴露于单独病原体中时的疾病严重程度等级并且将结果乘以100％来确定。结果在上文所描述的体内喂养离体叶片生物分析中，使用每个处理12个叶片来测试46种所选细菌菌株。重复实验两次。通过在暴露于致病疫霉(10,000个孢子囊/毫升；us-08分离株)中之前，浸渍在如实例1中所制备的细菌悬浮液、如实例1中所制备的无细胞细菌滤液、高压灭菌(20分钟，121psi)细菌悬浮液或单独ygm培养基(对照物)中来处理每一组12个叶片。图2展示在处理和用致病疫霉接种之后10天时，用来自46种测试细菌菌株的细菌悬浮液和无细胞细菌滤液处理的感染叶片的疾病严重程度百分比。以暴露于全培养物(细菌悬浮液)中的叶片的疾病严重程度从左到右增加的次序排列细菌菌株。因此，全培养物针对致病疫霉最有效的细菌菌株在图表左侧鉴别。基于全细菌培养物控制由致病疫霉造成的疾病严重程度的作用，选择六种细菌菌株用于进一步研究。在上文所描述的体内喂养离体叶片生物分析中，使用每个处理18个叶片来测试六种细菌菌株。重复实验四次。通过在暴露于致病疫霉(7,000个孢子囊/毫升)中之前，浸渍在如实例1中所制备的48小时细菌悬浮液或蒸馏水中来处理每一组18个叶片。在单独实验中测试致病疫霉基因型ca-09(a1)、ca-10(a1)、us-08(a2)和us-22(a2)中的每一个。暴露于致病疫霉(us-08(a2)分离株)中的叶片在存在六种所选细菌菌株的情况下的疾病严重程度百分比展示于表1中。表1：如从表1中数据可见，当以细菌悬浮液形式施用时，所有六种细菌菌株都保护马铃薯叶片不受致病疫霉基因型us-08(a2)感染影响。另外，菌株uwo1、kengft3、189和wausv3的无细胞分离株展示明显保护马铃薯叶片不受致病疫霉基因型us-08(a2)感染影响。如从图3可见，菌株189和wausv36展示对致病疫霉基因型ca-09(a1)生长的最佳控制百分比。同样，图4和5展示，菌株189比所测试的五种其它菌株更好地保护马铃薯叶片免于致病疫霉基因型us-22(a2)感染。表2展示与用蒸馏水(对照物)处理相比，用六种所测试细菌菌株中的每一种的细菌悬浮液处理针对四种致病疫霉基因型的功效比较。ss指示在p＝0.01水平下，来自用细菌处理的结果比来自用细菌处理的结果在统计学上明显更好；nss指示在p＝0.01水平下，用细菌与对照物处理之间的差不在统计学上显著。表2：实例4：细菌鉴别将细菌悬浮液(200μl，如实例1中所制备)煮沸5分钟，接着冷却到室温并离心。使上清液(2μl)经受pcr(聚合酶链反应)条件以使细菌基因组的内部转录间隔区(internaltranscribedspacer；its)和伴侣蛋白60通用目标(cpn60ut)区扩增。使its区扩增，并且确定条带大小以将类似菌株分成一组，以便避免对来自紧密相关菌株的高度类似或相同cpn60ut序列进行重复测序。用如舍伦贝格(schellenberg)等人,“来自加拿大和东非女性阴道样品的产酸并产过氧化氢细菌的选择、表型分型和鉴别(selection,phenotypingandidentificationofacidandhydrogenperoxideproducingbacteriafromvaginalsamplesofcanadianandeastafricanwomen).”公共科学图书馆·综合(plosone)(2012)7(7):e41217中所描述的引物its-f和its-r产生its扩增子。通过聚丙烯酰胺凝胶(4％-20％梯度凝胶，英杰公司(invitrogen))电泳来确定条带大小，并且使用sybrtm绿i染色剂(英杰公司)进行后染色。用伯乐公司(bio-rad)凝胶成像器使凝胶成像，并且通过与分子量标记物相比来确定条带大小。如古赫(goh)等人,“通过与伴侣蛋白60基因序列逆向棋盘式杂交来鉴别肠球菌属物种和表型类似的乳球菌属和漫游球菌属物种(identificationofenterococcusspeciesandphenotypicallysimilarlactococcusandvagococcusspeciesbyreversecheckerboardhybridizationtochaperonin60genesequences).”临床微生物学杂志(journalofclinicalmicrobiology)(2000)38:3953-3959中所描述，通过对使用经过m13调适的通用引物h729/h730产生的扩增子进行直接测序来确定细菌分离株的cpn60ut序列。使用经过m13调适的cpn60ut“魔法”引物h1594：(5'-cgccagggttttcccagtcacgacgacgtcgccggtgacggcaccaccac-3'(seqidno:1)和h1595：5'-agcggataacaatttcacacaggacgacggtcgccgaagcccggggcctt-3'(seqidno:2)(加拿大国家研究院(nationalresearchcouncilofcanada)的肖恩·赫明森(seanhemmingsen)博士好意提供的引物)使具有较高g/c含量的样品(例如假单胞菌属)成功地扩增。pcr条件包括1utaqdna聚合酶(英杰公司)、2.5mmmgcl2、500nm每一dntp以及400nm正向和反向引物组中的每一个，对于一个循环在95℃下持续3分钟并且对于40个循环在95℃下持续30秒，50℃持续30秒并且72℃持续30秒。在一些情况下，如希尔(hill)等人,“通过应用特定pcr引物混合物由复合模板产生的cpn60聚合酶链反应(pcr)产物文库中的模板表示改善(improvedtemplaterepresentationincpn60polymerasechainreaction(pcr)productlibrariesgeneratedfromcomplextemplatesbyapplicationofaspecificmixtureofpcrprimers).”环境微生物学(environmentalmicrobiology)(2005)8:741-746中所描述，用摩尔比为3:1的引物h1612-h1613和h279-h280产生扩增子，并且在测序之前将其克隆到pgemtm-t简单载体(普洛麦格公司(promega))中。使用qiaquicktmpcr纯化试剂盒(凯杰公司(qiagen))或使用amicontmym-30超过滤膜(费舍尔公司(fisher))来纯化扩增子，并且对其进行测序。在测序之前用quicklysetm质粒试剂盒(凯杰公司)制备质粒。结果被发现有效控制致病疫霉感染的一些细菌菌株通过以下来鉴别：将细菌基因组的伴侣蛋白60通用目标(cpn60ut)区的序列与来自已知细菌菌株的对应序列相比。通过与通过构筑系统发生树补充的参考数据库相比来进行初始鉴别，所述参考数据库包括(但不限于)伴侣蛋白数据库(希尔(hill)j.e.等人,“cpndb：伴侣蛋白序列数据库(cpndb:achaperoninsequencedatabase)”基因组研究(genomeres.)(2004)14:1669-1675)和美国国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation；ncbi)数据库。基于此比较，选择用于进一步研究的六种细菌菌株鉴别如下：实例5：细菌基因组测序绿针假单胞菌菌株189使用wizard基因组dna(gdna)提取试剂盒(美国威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(promega,madison,wi,usa))从1ml的绿针假单胞菌菌株189于ygm中的隔夜培养物(实例1)纯化基因组dna，并且在miseq平台上使用配偶对方案(启迪公司(illumina))来测序，产生2.8mb配偶对读段。基于具有如所描述修改(希尔等人,方案交换(protocolexchange)(2014)doi:10.1038/protex.2014.028)的用于titanium化学(罗氏公司(roche)，2012年3月)的成对端快速文库制备方案来执行另一个8-kb插入物成对端测序操作，产生配对距离估计为5,641±1,410bp的166,514个成对端读段。使用soapdenovo22.01版(罗(luo)等人:soapdenovo2：一种凭经验改进的内存高效的短段读取从头组装器(soapdenovo2:anempiricallyimprovedmemory-efficientshort-readdenovoassembler).大数据科学(gigascience)(2012)1:18)用k聚体大小127和定位长度34来对启迪公司读段进行组装。使用emboss分割器将所得957个重叠群(n5033,267bp)分割成具有200bp重叠的500bp片段，与罗氏成对端读段组合，并且使用newbler3.0版(454生命科学公司(454lifesciences))对其进行重新组装。使用用于soapdenovo2的gapcloser工具以及pcr和桑格(sanger)测序来填充序列中的空隙。所有测序数据组装在一起产生具有152x覆盖度的成品6.8mbp基因组序列(seqidno:3)，其具有无空隙并且无任何质粒证据的单个架构。使用原核基因组标注渠道(prokaryoticgenomeannotationpipeline)3.1版(ncbi)对序列数据进行标注。绿针假单胞菌菌株189的基因组含有6,837,781bp(62.74％g/c)；观察到6,025个基因和5,934个编码蛋白质的基因，以及6个编码5srrna的基因、5个编码16srrna的基因、5个编码23srrna的基因和71个编码trna的基因。此外，通过使用整合式微生物基因组端口标注来鉴别2,075个直系同源群组集群。对绿针假单胞菌菌株189cpn60序列的检查表明，此菌株与绿针假单胞菌亚种金黄假单胞菌(pseudomonaschlororaphissubsp.aureofaciens)30-84(nz_cm001559.1)最紧密相关，其核苷酸一致性为99.6％。与此观察结果一致，用来自此物种的14个其它基因组确定基因组水平平均核苷酸一致性揭露，绿针假单胞菌菌株189与此菌株共有最高基因组序列一致性(98.36％)。绿针假单胞菌的展现生物控制表型(包括pa23)的若干其它菌株的基因组类似性度量将其置放在与绿针假单胞菌菌株189相同的物种中。如同pa23，绿针假单胞菌菌株189含有能够产生参与生物控制的代谢物的生物合成路径阵列，所述代谢物包括氰化氢、吩嗪、脓菌素(pyocin)、吡咯并喹啉醌和细胞壁降解酶。还发现赋予产生界面活性剂并且形成生物膜的能力的基因。此全基因组的序列数据已经以登录号cp014867寄存在ddbj/embl/genbank(唐恩等人,基因组通告(2016年5月/6月)4(3):e00581-16)。荧光假单胞菌菌株kengft3使用wizard基因组dna(gdna)提取试剂盒(美国威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司)从1ml的荧光假单胞菌菌株kengft3于ygm中的隔夜培养物(实例1)纯化基因组dna，并且在gsjunior上使用titaniumplus化学(加拿大魁北克拉维尔的罗氏诊断学公司(rochediagnostics,laval,quebec,canada))来测序。使用newbler3.0版(454生命科学公司)来组装来自两个鸟枪法测序操作的平均读段长度为548和534bp的读段。通过过滤器的读段的总数是128,460，并且所组装碱基的总数是69,421,957。将这些读段组装成97个较大重叠群，其中n50重叠群大小为131,172kbp。基于具有如所描述修改(希尔等人,方案交换(2014)doi:10.1038/protex.2014.028)的用于titanium化学(罗氏公司)的成对端快速文库制备方案来执行另一个8-kb插入物成对端测序操作。产生总计105,459个成对端读段，其配对距离估计为6,361±1,590bp。所有测序操作组装在一起产生具有16x基因组覆盖度的改善的高品质序列草图，其为具有9个架构重叠群(seqidno:4到seqidno:12，表3)的单个架构。使用原核基因组标注渠道2.0版(ncbi)对序列数据进行标注。表3：重叠群基因组中的位置碱基对的数目序列11到11275851127585seqidno:421132047到11348572811seqidno:531135358到118708251725seqidno:641187731到1902001714271seqidno:751902220到29520011048002seqidno:862950759到45026241551866seqidno:974502688到452260319916seqidno:1084522629到5334906812278seqidno:1195335136到6183292848157seqidno:12荧光假单胞菌菌株kengft3的基因组含有6,183,292bp(59.95％g+c含量)。观察到总计5,791个基因和5,549个编码蛋白质的基因，以及6个编码5srrna的基因、5个编码16srrna的基因、5个编码23srrna的基因和64个编码trna的基因。大部分(77.76％)编码蛋白质的基因具有所预测的功能，并且鉴别出2,053个cog集群。物种鉴别工具speci(门迪(mende)等人,自然·方法(natmethods)(2013),10:881-884)无法将假单胞菌属菌株kengft3指定为物种集群(与荧光假单胞菌菌株sbw25；genbank登录号nc_012660.1的平均核苷酸一致性为95.1％)。jspecies(黎克特(richter)等人,美国国家科学院院刊(procnatlacadsciusa)(2009)106:19126-19131)也揭露，假单胞菌属菌株kengft3的基因组比较度量使其低于用于包括在与荧光假单胞菌sbw25相同的物种中的鉴别截止值。然而，与菌株kengft3共有某些表型属性的荧光假单胞菌菌株lbum223的基因组比较度量使这两种菌株处于相同物种内(平均核苷酸一致性(ani)，99.39％)。使用在整合式微生物基因组端口中标注的60个荧光假单胞菌菌株计算系统发生距离树揭露，荧光假单胞菌菌株kengft3和lbum223与荧光假单胞菌菌株gcm5-1a和uk4形成集群。荧光假单胞菌菌株kengft3具有已经与生物控制表型相关联的基因阵列，所述生物控制表型尤其包括吩嗪甲酸合成、甲壳质酶和纤维素酶以及吡咯并喹啉醌生物合成。还发现十个编码推定β-内酰胺酶的基因。此全基因组的序列数据已经以登录号cp014868寄存在ddbj/embl/genbank(唐恩等人,基因组通告(2016年5月/6月)4(3):e00428-16)。泛菌属菌株oxwo6b1使用wizard基因组dna(gdna)提取试剂盒(美国威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司)从1ml的泛菌属菌株oxwo6b1于ygm中的隔夜培养物(实例1)纯化基因组dna。在miseq平台(启迪公司)上执行基因组鸟枪法测序，产生2.9m成对端读段。通过使用具有如先前所描述修改(希尔等人,方案交换(2014)doi:10.1038/protex.2014.028)的用于titanium化学(罗氏公司，2012年3月)的成对端快速文库制备方案进行的8-kb插入物成对端测序操作来补充这些数据。此过程产生配对距离估计为6,310±1,577bp的187,389个成对端读段。使用soapdenovo2(2.01版)用k聚体大小127和定位长度34来对启迪公司读段进行组装。使用emboss分割器将所得690个重叠群(n50，44,093bp)分割成具有200bp重叠的500bp片段，与罗氏成对端读段组合，并且使用newbler(3.0版)对其进行重新组装。使用用于soapdenovo2的gapcloser工具以及pcr和桑格测序来填充序列中的空隙。所有测序数据组装在一起产生具有201x覆盖度的高质量基因组序列草图，其具有2个架构，分别为4,677,766bp(2个架构重叠群；第一个含有残基1到200112(seqidno:13)并且第二个含有残基200566到4677766(seqidno:14))和118,792bp(单个重叠群；seqidno:15)。使用pcr确认三个质粒，253,747bp(seqidno:16)、181,185bp(seqidno:17)和4650bp(seqidno:18)。使用原核基因组标注渠道3.1版(ncbi)和整合式微生物基因组端口对序列数据进行标注。泛菌属菌株oxwo6b1的基因组是5,236,140bp(52.74％g+c含量)。鉴别出总计5,030个基因和4,868个编码蛋白质的基因，以及10个编码5srrna的基因、7个编码16srrna的基因、7个编码23srrna的基因和78个编码trna的基因。分类学标记物16srrna和rpob的序列表明菌株oxwo6b1与凤梨泛菌(pantoeaananatis)最紧密相关，其与凤梨泛菌具有99％(16s)和>97％(rpob)一致性。然而，细菌条码标记物cpn60与任何泛菌属的序列一致性较低，最接近相邻者是斯氏泛菌(pantoeastewartii)，具有93.7％序列一致性)。与此一致，菌株oxwo6b1的基因组平均核苷酸一致性(ani)低于用于与任何所报导泛菌属物种的物种一致性的指定截止值，其中最大值为与凤梨泛菌的88.9％ani。此外，使用speci(门迪等人,自然·方法(2013),10:881-884)对40个直系同源群组集群(clusteroforthologousgroups；cog)进行比较揭露，泛菌属菌株oxwo6b1无法指定为物种集群(与凤梨泛菌的平均核苷酸一致性为95.0％)。泛菌属菌株oxwo6b1含有已经与生物控制表型相关联的基因，所述生物控制表型包括吩嗪甲酸合成和细胞壁降解酶。还观察到两个编码推定β-内酰胺酶的基因。此全基因组鸟枪法项目已经以登录号lwlr00000000和lwlr01000000寄存在ddbj/ena/genbank(唐恩等人,基因组通告(2016年5月/6月)4(3):e00582-16)。节杆菌属菌株oy3wo11使用wizard基因组dna(gdna)提取试剂盒(美国威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司)从1ml的节杆菌属菌株oy3wo11于ygm中的隔夜培养物(实例1)纯化基因组dna，并且在gsjunior上使用titaniumplus化学(加拿大魁北克拉维尔的罗氏诊断学公司)来测序。产生平均长度644bp的总计142,372个鸟枪法读段。另外，基于具有如先前所描述修改(希尔等人,方案交换(2014)doi:10.1038/protex.2014.028)的用于titanium化学(罗氏公司，2012年3月)的成对端快速文库制备方案来执行8-kb插入物成对端测序操作。产生总计170,435个成对端读段，其配对距离估计为6,383±1,595bp。所有测序操作组装在一起产生产生具有35x基因组覆盖度的改善的高品质序列草图。使用newbler3.0版(454生命科学公司)来组装数据，产生3个架构，分别为4,253,622bp(含有19个重叠群；seqidno:19到seqidno:37，表4)、258,581bp(1个重叠群；seqidno:38)和4,841bp(1个重叠群seqidno:39)。使用原核基因组标注渠道3.1版(ncbi)对序列数据进行标注。表4：节杆菌属菌株oy3wo11的总基因组大小为4,517,044bp，其g+c含量为65.29％。基因组标注揭露4,225个基因和4,163个编码蛋白质的基因。基因组具有1个编码5srrna的基因、2个编码16srrna的基因、1个编码23srrna的基因和50个编码trna的基因。节杆菌属菌株oy3wo11的基因组含有已经与生物控制表型相关联的基因，所述生物控制表型包括吩嗪甲酸合成和细胞壁降解酶。观察到两个编码推定β-内酰胺酶的基因。包括编码16srrna的基因和rpob的分类学标记物的序列与在嗜菲节杆菌(arthrobacterphenanthrenivorans)中所发现的对应基因sphe3共有97％到99％一致性。类似地，鉴别细菌条码标记物cpn60的两个拷贝，通过系统发生分析，其中的每一个都与来自嗜菲节杆菌sphe3的对应拷贝形成集群，并且具有93％到96％的序列一致性。节杆菌属菌株oy3wo11的基因组序列与在整合式微生物基因组端口中标注的来自节杆菌属的85个基因组序列进行的比较揭露，菌株oy3wo11的基因组平均核苷酸一致性(ani)低于用于包括在所述分析中所包括的任一物种中的指定截止值(最接近的ani是嗜菲节杆菌sphe3，为85.25％)。另外，speci(门迪等人,自然·方法(2013),10:881-884)无法将菌株oy3wo11指定为物种集群；在40个直系同源群组集群(cog)内最接近的匹配是嗜菲节杆菌sphe3，其平均ani为93.9％。综合而言，这些观察结果表明菌株oy3wo11可以表示先前未表征的或未测序的节杆菌菌株。此全基因组鸟枪法项目已经以登录号lwlp00000000和lwlp01000000寄存在ddbj/ena/genbank(唐恩等人,基因组通告(2016年5月/6月)4(3):e00585-16)。枯草芽孢杆菌菌株wausv36使用wizard基因组dna(gdna)提取试剂盒(美国威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司)从1ml的枯草芽孢杆菌菌株wausv36于ygm中的隔夜培养物(实例1)纯化基因组dna，并且在gsjunior上使用具有如先前所描述修改(希尔等人,方案交换(2014)doi:10.1038/protex.2014.028)的用于titanium化学(罗氏公司，2012年3月)的成对端快速文库制备方案来测序。使用newbler3.0版(454生命科学公司)来组装来自两个成对端测序操作的读段(平均读段长度为418和419bp)。通过过滤器的读段的总数是309,047。将这些读段组装成2个架构，分别为4,179,279bp(19个重叠群；seqidno:40到seqidno:58，表5)和59,592bp(1个重叠群；seqidno:59)。n50重叠群大小为1,049,070bp。组装所有测序数据产生具有25x基因组覆盖度的改善的高品质序列草图。使用原核基因组标注渠道3.1版(ncbi)对序列数据进行标注。表5：重叠群架构中的位置碱基对的数目序列11到5534555345seqidno:40255436到584012966seqidno:41358427到599531527seqidno:42459979到7542115443seqidno:43575447到784122966seqidno:44678829到803551527seqidno:45780474到11295431049070seqidno:4681130965到11339292965seqidno:4791134574到1341361206788seqidno:48101341387到1487681146295seqidno:49111487707到153726949563seqidno:50121537295到1915605378311seqidno:51131915842到201443298591seqidno:52142014495到2177840163346seqidno:53152177866到34023221224457seqidno:54163402456到34054212966seqidno:55173407164到3715576308413seqidno:56183715749到37187142966seqidno:57193720140到4179279459140seqidno:58枯草芽孢杆菌菌株wausv36的基因组大小是4,238,871bp，并且由43.32％g+c含量组成。观察到总计4,510个基因和4,404个编码蛋白质的基因，以及2个编码5srrna的基因、3个编码16srrna的基因、5个编码23srrna的基因和60个编码trna的基因。通过使用整合式微生物基因组(img)端口标注来鉴别总计1,688个直系同源群组集群(cog)集群。如编码16srrna的基因和rpob的分类学标记物的序列与枯草芽孢杆菌许多菌株的对应序列>99％一致。类似地，单拷贝细菌条码标记物cpn60的序列与枯草芽孢杆菌的若干菌株一致。在全基因组水平，菌株wausv36与在img端口可获得的25种枯草芽孢杆菌菌株的成对平均核苷酸一致性为99.96％，并且低于芽孢杆菌属其它物种的指定核苷酸一致性截止值。最终，speci(门迪等人,自然·方法(2013),10:881-884)将菌株wausv36指定为物种集群枯草芽孢杆菌，其在40个cog内的平均一致性为98.93％。这些观察结果表明菌株wausv36是枯草芽孢杆菌菌株。类似于与生物控制表型相关联的其它枯草芽孢杆菌菌株，菌株wausv36的基因组具有参与生物膜形成的基因，但未观察到与表面活性素产生相关联的基因。还发现五个编码推定β-内酰胺酶的基因和三个纤维素酶基因。此全基因组鸟枪法项目已经以登录号lwlq00000000和lwlq01000000寄存在ddbj/ena/genbank(唐恩等人,基因组通告(2016年5月/6月)4(3):e00586-16)。实例6：通过使用间接阻抗分析测量真菌生长来确定抗真菌活性用于评估细菌分离株针对致病疫霉的抗真菌活性的方法与由何(he),j.等人“用于在小麦中微生物抑制禾谷镰孢菌、穗疫镰孢菌和脱氧雪腐镰孢菌的并行选择(concurrentselectionformicrobialsuppressionoffusariumgraminearum,fusariumheadblightanddeoxynivalenolinwheat)”应用微生物学杂志(journalofappliedmicrobiology)(2009),106(6),1805-1817所描述类似。致病疫霉在液体培养基中在存在或不存在待测试细菌分离株无细胞培养物滤液的情况下的生长通过微生物阻抗分析器(bactractm4300，奥地利合成实验室仪器有限公司(sy-labinstrumentsgmbh,austria))来测量。基于随着微生物生长继续进行由小型带电化合物产生而引起的培养基阻抗降低来测量微生物生长。无细胞细菌培养物滤液：将储存在-80℃下的细菌分离株(oy3wo11、189、wausv36、kengft3、oxwo6b1和uwo1)悬浮于马铃薯右旋糖培养液(pdb(difcotm)，美国bd公司(becton,dickinsonandcompany))或基本培养基(mm，邵(shao),s.,周(zhou),t.,和麦加维(mcgarvey),b.d.“使用气相色谱法-质谱在展青霉素降解期间对酿酒酵母的比较性代谢体学分析(comparativemetabolomicanalysisofsaccharomycescerevisiaeduringthedegradationofpatulinusinggaschromatography-massspectrometry).”,应用微生物学和生物技术(appliedmicrobiologyandbiotechnology),(2012)94(3),第789-797页)中，并且调整到光学密度(od)读数为1.0(620μm)。对50mlfalcontm试管中的培养基(pdb或mm；24ml)接种1ml细菌悬浮液。将经过接种的试管在室温(23±2℃)下在150rpm旋转振荡器上培育6天。使所得细菌培养物以2,650g离心10分钟，并且使上清液通过0.22μm针筒过滤器(混合纤维素酯；mce)过滤到新试管中，得到无细胞细菌培养物滤液。分析条件：对于每一实验，将从在黑麦b琼脂上生长2-3周的致病疫霉培养物(卡登,c.e.和j.l.金克斯.“致病疫霉单个分离株的自发可变性.i.培养变化(spontaneousvariabilityofsingleisolatesofphytophthorainfestans.i.culturalvariation.)”加拿大植物学杂志(1968)46:329-348)切割的五个样品(直径9mm的圆盘)各自放置到微生物阻抗分析器的测量试管中，后接添加2ml无细胞细菌培养物滤液。使用无菌培养基作为对照物。在22℃下以20分钟时间间隔监测真菌生长(通过阻抗变化来测量)持续120小时。重复每一实验三次。数据分析：使用bacevaltm电脑程序(sy-lab仪器有限公司(2002)：bactractm4000系列微生物操作手册v1.05e)来分析阻抗变化曲线。对阻抗测量的数据进行逆变换，并且用作真菌生长的指示物。使用sas/stattm9.2(sas)，一般线性模型(glm)程序来在统计学上分析数据。使用contrasts(sas)来比较真菌生长曲线；使用杜凯氏测试来比较每一时间点时真菌生长的平均值。结果对所有6种细菌分离株的统计分析指示，致病疫霉在所用两种培养基mm和pdb中的生长曲线明显不同(p<0.001)，并且单独加以分析。如图6中所见，致病疫霉的生长在mm中在不存在无细胞细菌培养物滤液的情况下(阳性对照物)最快。在所测试的6种细菌当中，来自4种细菌菌株(189、wausv36、oxwo6b1和uwo1)的无细胞滤液展示明显抑制真菌生长(p<0.01)。然而，用来自细菌分离株oy3wo11和kengft3的无细胞滤液处理的致病疫霉的生长在统计学上与对照物的生长无明显不同(p>0.05)。如图7中所见，四种无细胞细菌培养物滤液(来自菌株189、wausv36、oxwo6b1和kengft3)抑制致病疫霉在pdb中的生长。来自分离株oxwo6b1的无细胞滤液展示统计学上显著的生长抑制(p＝0.05)，并且来自分离株wausv36、189和kengft3的无细胞滤液展示甚至更强的生长抑制(p＝0.01)。来自分离株oy3wo11的无细胞滤液不展示对病原体生长的显著影响，并且来自分离株uwo1的无细胞滤液显著刺激致病疫霉生长(p＝0.01)。图8展示，与在存在无菌培养基(阳性对照物)的情况下的生长相比，致病疫霉在于存在无细胞细菌培养物滤液的情况下培育120小时之后的生长抑制百分比。根据杜凯氏测试(杜凯,j.“在方差分析中比较个体平均值(comparingindividualmeansintheanalysisofvariance).”生物计量学(biometrics)(1949)5(2):99-114)，用相同字母(对pdb和mm培养基分别是a/a、b/b或c/c)指示的平均值在p＝0.05水平下无明显不同。在mm中，与对照物相比较，来自分离株wausv36、oxwo6b1和189的无细胞滤液显著减少真菌生长，并且分别使致病疫霉生长抑制72.8％、50.4％和49.0％。来自分离株uwo1的无细胞滤液在mm中展示明显较弱的活性，使致病疫霉生长减少21.7％。在pdb中，与对照物相比，来自分离株wausv36和189的无细胞滤液使致病疫霉的生长分别抑制77.8％和64.7％，显著地超过来自分离株kengft3的无细胞滤液，其在pdb中使真菌生长减少29.2％。本文所描述的实施例打算说明本发明组合物和方法，并且并不打算限制本发明的范围。打算包括与描述整体一致并且对于所属领域的技术人员容易地显而易见的各种修改和变化。所附权利要求书不应受实例中所阐述的具体实施例限制，而应给予与描述整体一致的最广泛解释。当前第1页12