本发明涉及一种通过胚拯救技术快速培育百山祖冷杉幼苗的方法，从而达到扩大濒危物种数量的目的。
背景技术：
百山祖冷杉(Abiesbeshanzuensis)是松科(Pinaceae)冷杉属(Abies)植物，常绿乔木，高17米，胸径达80厘米。秋果圆柱形，有短梗，长7～12厘米，直径3.5～4厘米，成熟时淡褐色或淡褐黄色。5月开花，11月球果成熟。是浙江省特有的古老孑遗植物。在苏、浙、皖、闽等省第三纪时广泛分布，第四纪冰期后在局部地段唯一生存至今的珍稀物种。百山祖冷杉为国家一级重点保护植物，1987年被世界自然保护联盟物种生存委员会(SSC)公布列为世界最濒危的12种植物之一。百山祖冷杉自然分布于百山祖自然保护区海拔1740米左右的狭小避风谷地，是我国大陆东南部唯一的一种冷杉属植物，是第四纪冰川期保存下来的活化石，对于地理学和气候学等学科研究具有十分重要的意义。
自然条件下，百山祖冷杉球果发育时间长、结实率低。球果成熟时大量的胚存在败育的现象，导致正常发育的种子数量极少。同时，百山祖冷杉受到生态环境影响，造成天然更新困难、持续繁衍能力极弱等问题。因此，迫切需要建立一种简单的、快速的培育百山祖冷杉幼苗的方法。胚拯救技术是育种研究中克服胚败育或者发育不良，提高萌发率以及提早萌发，缩短植物发育时间的有效手段。运用胚拯救技术快速培育百山祖冷杉幼苗，可有效的防止濒危植物百山祖冷杉因在自然条件下繁殖困难而灭绝。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种通过胚拯救技术快速培育百山祖冷杉幼苗的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种通过胚拯救技术快速培育百山祖冷杉幼苗的方法，包括如下步骤：
(1)采集百山祖冷杉植株上的未成熟球果；
(2)剥取未成熟种子并进行表面灭菌；
(3)用解剖刀切开未成熟种子，剥取未成熟胚并接种到培养基上，将其水平放置。20±2℃黑暗条件下培养3d；
(4)暗培养后，在弱光条件下(光照强度为20μmol·m-2·s-1、光照时间为12h/d)培养，直到胚萌发；
(5)胚萌发后，在正常光照条件下(光照强度为80μmol·m-2·s-1、光照时间为12h/d)培养10d后，将幼苗从胚乳中分离并接种到培养基上进行保存，培养条件为温度20±2℃、光照强度为80μmol·m-2·s-1、光照时间为12h/d。
进一步地，在所述步骤(1)中，所述未成熟球果形态特征为球果呈现绿色。
进一步地，在所述步骤(2)中，所述表面灭菌程序为：将未成熟种子置于流水下冲洗3h，冲洗后在超净工作台上用体积分数为70％乙醇水溶液浸泡并振荡30s，无菌水冲洗3次，每次1min。再用质量分数为0.1％的氯化汞的水溶液浸泡并振荡10min后，用无菌水冲洗5次，每次1min。最后用无菌滤纸吸干种子表面多余的水分。
进一步地，在所述步骤(3)中，所述剥取未成熟胚的方法为左手用无菌镊子固定未成熟种子，右手用无菌解剖刀在距种皮边缘0.5mm，分别进行纵切和横切，用镊子将种皮从未成熟胚及其胚乳上分离。
进一步地，在所述步骤(3)和步骤(5)中，培养基以DCR(Gupta and Durzanmedium)为基本培养基，另外添加蔗糖、琼脂、水解酪蛋白等，蔗糖、琼脂、水解酪蛋白的浓度分别为20g/L、8g/L、500mg/L，培养基的pH为5.8。
进一步地，在所述步骤(4)中，所述胚萌发形态特征为胚根或者子叶从胚乳中伸出。
进一步地，在所述步骤(5)中，所述分离幼苗的方法为用灭菌的解剖刀将胚乳纵向切开后，将幼苗从胚乳中分离。
本发明的优点是：本发明采用的外植体为未成熟胚，利用胚拯救技术对其进行培养，克服自然条件下种子胚败育的缺陷，可在短期内快速获得较多的百山祖冷杉幼苗。该方法可操作性强，简单高效，污染率低，对世界濒危植物幼苗的快速培育具有重要意义。
附图说明
图1是百山祖冷杉野生植株上的未成熟球果
图2是用于培养的百山祖冷杉外植体—未成熟胚及胚乳图；
图3是百山祖冷杉未成熟胚培养后萌发图；
图4是萌发幼苗生长图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明。
实施例1：
材料：本实例以百山祖冷杉未成熟胚及胚乳为培养外植体。
步骤(1)：取材
7月下旬至8月上旬于百山祖自然保护区收集百山祖冷杉未成熟球果，颜色绿色，这种绿色的未成熟果子表面种鳞、苞鳞排列紧密。可放于密封袋中，4℃低温中贮藏备用。
步骤(2)：种子表面灭菌
用镊子分离种鳞和种子，将种子置于流水下冲洗3h，在超净工作台上用70％乙醇处理30s，无菌水冲洗3～5次。再用0.1wt％氯化汞处理10min后，用无菌水冲洗3～5次并用无菌滤纸吸干表面水分。
步骤(3)：未成熟胚分离与接种
将冲洗后的种子置于铺有灭菌滤纸的培养皿中，左手用无菌镊子固定未成熟种子，右手用无菌解剖刀在距种皮边缘0.5mm，分别进行纵切和横切，用镊子将种皮从未成熟胚及其胚乳上分离(图1)。剥取未成熟胚及其胚乳并接种到培养基上，将其水平放置。培养基以DCR(Gupta and Durzan medium)为基本培养基，另外添加蔗糖、琼脂、水解酪蛋白等，蔗糖、琼脂、水解酪蛋白的浓度分别为20g/L、8g/L、500mg/L，培养基的pH为5.8。
步骤(4)：暗培养与异养期培养
接种后的未成熟胚及其胚乳先于20±2℃黑暗条件下培养3d，再弱光光照条件下培养10天可见种子萌发，所述弱光光照条件为：光照强度为20μmol·m-2·s-1、光照时间为12h/d。
步骤(5)：自养期培养
未成熟胚培养后，萌发率可达95％以上(图2)。然后幼苗从胚乳中分离并接种到培养基上进行自养期培养与保存，培养基以DCR(Gupta and Durzanmedium)为基本培养基，另外添加蔗糖、琼脂、水解酪蛋白等，蔗糖、琼脂、水解酪蛋白的浓度分别为20g/L、8g/L、500mg/L，培养基的pH为5.8。培养条件为温度20±2℃、光照强度为80μmol·m-2·s-1、光照时间为12h/d。培养15天后的幼苗如图3所示，由此可见，通过本方法可在短期内获得数量比较多的百山祖冷杉无菌幼苗用于濒危植物百山祖冷杉的快速培育。