本发明涉及梨的育苗扩繁
技术领域：
，特别是涉及一种梨不定芽嫁接快速繁育方法。
背景技术：
：我国是梨的初生中心之一，栽培历史悠久，现在我国梨产量和面积均是世界第一位，经济地位和社会地位显著。组织培养是整个生命科学的基础，特别是随着脱毒快繁技术和功能基因组学的发展，对组织培养高效再生体系的要求也越来越高。相比其它作物，梨组织培养技术发展较晚，其外植体再生通常分为两个阶段：第一阶段是不定芽的再生，不定芽通过初代培养即可获得，不定芽获得后通过增殖可以获得大量的无性系材料，该阶段再生、增殖问题基本已经解决；第二阶段是不定根的诱导和再生，该阶段相对较难，不定再生根诱导中存在再生率低，再生后根发育或吸收不正常，炼苗后难以成活或成活后生长慢等问题，因此限制了组织培养技术在梨属植物上的广泛应用。所以如何解决不定芽增殖后不定芽根再生难、再生率低和根发育不正常等问题已经成为梨组织培养亟待解决的问题。为解决以上问题，前人进行了大量研究，包括利用激素直接诱导、试管嫁接等，但或者效果不理想，或者操作比较繁琐。例如陈蕾等“梨组织培养及器内嫁接技术的研究”一文，其中主要研究了梨的器内(试管内)嫁接，后期需要经历较长的炼苗期才可以移栽到瓶外，操作繁琐，且嫁接后生长慢。技术实现要素：本发明主要解决的技术问题是提供一种梨不定芽嫁接快速繁育方法，在大棚或温室内培育，操作简单，培育期短，成活率高，平均成活率可达到90％，可有效解决梨不定根再生难的问题，为梨组织培养再生、工厂化育苗和功能基因组学研究提供了技术支撑。为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：一种梨不定芽嫁接快速繁育方法，包括以下步骤：s1：砧木和接穗的选取砧木：选用1～2年生杜梨或豆梨实木苗，所述实木苗要求健壮，无病虫害，茎干部位光滑便于嫁接；接穗：选用由秋子梨或黄金梨组织培养继代增殖获得的不定芽，要求不定芽长度为1.5～3.0cm，粗度约0.15cm；s2：砧木和接穗的预处理砧木：嫁接时提前1w对砧木进行浇水，便于离皮并增加树液的流动性；接穗：嫁接前活化处理，所述活化处理为暗培养1w后，光照培养13d；s3：嫁接嫁接在可控温度和湿度的大棚或温室中进行，温度为20～30℃，相对湿度50～80％；嫁接方法采用“t”字形芽接，首先在砧木茎干中上部选择较为光滑的地方，用手术刀开“t”字形切口，要求深达木质部，接着用刀开韧皮部；然后取不定芽接穗，在不定芽茎基部斜切，要求手术刀与不定芽茎夹角为30°，之后将斜切后的不定芽茎基部快速浸蘸激素混合液，所述激素混合液组成为：0.1mg/liaa+0.5mg/ltdz；将浸蘸后的不定芽嫁接入砧木茎干的“t”字形切口中，嫁接口用封口膜绑缚封严，然后用塑料袋套在嫁接的不定芽上，并用封口膜绑扎在砧木主干上，以保持嫁接口微环境的湿度，用针在塑料袋上打3～4个小孔用于透气；s4：嫁接后管理嫁接后应保持环境的阴凉湿润，避免阳光照射，定期进行浇水和病虫害防控，20d后进行摘袋，摘袋时首先用剪刀剪开塑料袋顶部进行炼苗，待到接穗增长1～2cm时，摘除塑料袋，正常培养。其中，步骤s1中，由秋子梨组织培养继代增殖获得不定芽时，秋子梨增殖培养基为：nn69+tdz3.0mg/l+iba0.3mg/l+蔗糖25g/l+琼脂7g/l，培养基ph值为5.8，增殖环境条件为温度25±1℃，光照3000lx，光照时长16h/d。其中，步骤s1中，由黄金梨组织培养继代增殖获得不定芽时，黄金梨增殖培养基为：ms+6-ba1.0mg/l+iba0.10mg/l+蔗糖25g/l+琼脂7g/l，培养基ph值为5.8，增殖环境条件为温度25±1℃，光照3000lx，光照时长16h/d。优选地，步骤s3中，将浸蘸后的不定芽嫁接入砧木茎干的“t”字形切口中，要求不定芽切面朝外紧贴砧木茎的韧皮部。优选地，步骤s1中，砧木选用1年生杜梨实木苗。优选地，步骤s1中，接穗选用由秋子梨组织培养继代增殖获得的不定芽。优选地，嫁接在冬暖式大棚中进行，温度为20～30℃，相对湿度约80％。影响嫁接成活的主要因素除了接穗和砧木的亲和力外，嫁接的技术也是主要因素。本发明提供的梨不定芽嫁接快速繁育方法，主要在于优化了嫁接技术，首先确定了对嫁接成活率影响显著的以下因素：嫁接环境、砧木株龄、接穗木质化程度、不同生长激素以及砧木和接穗预处理方式，然后在研究过程中分别考察了嫁接环境、砧木株龄、接穗木质化程度、不同生长激素以及砧木和接穗预处理方式对嫁接后植株成活率的影响，在此基础上，本发明提供的梨不定芽嫁接快速繁育方法，通过在嫁接之前对砧木和接穗进行预处理，即砧木嫁接时提前1w进行浇水，接穗嫁接前活化处理，活化处理为暗培养1w后，光照培养13d，可以促进其分裂和进行半木质化处理，提高了成活率；嫁接在可控温度和湿度的大棚或温室中进行，通过控制合适的温度和湿度，成活率也得到了提高；斜切后的不定芽茎基部快速浸蘸激素混合液，激素混合液组成为：0.1mg/liaa+0.5mg/ltdz，能促进形成层的活动，从而促进伤口愈合，最终稳定获得了高的嫁接成活率，平均成活率达90％。本发明的有益效果是：本发明提供的梨不定芽嫁接快速繁育方法，操作简单，培育期短，成活率高，可有效解决梨不定根再生难的问题，为梨组织培养再生、工厂化育苗和功能基因组学研究提供了技术支撑。附图说明图1是本发明以1年生杜梨实木苗为砧木、秋子梨不定芽为接穗，在不同的嫁接环境中得到的嫁接成活率示意图；图2是本发明以1年生豆梨实木苗为砧木、秋子梨不定芽为接穗，在不同的嫁接环境中得到的嫁接成活率示意图；图3是本发明以1年生杜梨实木苗为砧木、黄金梨不定芽为接穗，在不同的嫁接环境中得到的嫁接成活率示意图；图4是本发明以1年生豆梨实木苗为砧木、黄金梨不定芽为接穗，在不同的嫁接环境中得到的嫁接成活率示意图；图5是本发明以杜梨实木苗为砧木、秋子梨不定芽为接穗，不同的砧木株龄得到的嫁接成活率示意图；图6是本发明以杜梨实木苗为砧木、黄金梨不定芽为接穗，不同的砧木株龄得到的嫁接成活率示意图；图7是本发明以杜梨实木苗为砧木、秋子梨不定芽不同木质化程度得到的嫁接成活率示意图；图8是本发明以杜梨实木苗为砧木、秋子梨不定芽为接穗，不同预处理得到的嫁接成活率示意图；图9是本发明实施例中用手术刀开“t”字形切口的示意图；图10是本发明实施例中将不定芽嫁接入“t”字形切口的示意图；图11是本发明实施例中用parafilm封口膜绑缚封严嫁接口的示意图；图12是本发明实施例中用塑料袋套在嫁接的不定芽上、并用parafilm封口膜绑扎在砧木主干上的示意图；图13是本发明实施例培育成功的梨苗照片。具体实施方式下面对本发明的技术方案进行详细说明。首先考察了以下因素对嫁接成活率的影响。一、嫁接环境、砧木和接穗对嫁接成活率的影响嫁接分别选择以下3种环境条件：室内(温度20～25℃，相对湿度≈50％)；冬暖式大棚(温度20～30℃，相对湿度≥80％)；田间(温度20～30℃，相对湿度≈65％)。分别在1w(1周)、2w和3w进行成活率统计。结果见图1-图4所示。分别在室内、大棚和田间进行了不定芽嫁接，结果表明嫁接环境条件对嫁接成活率影响较大，田间嫁接成活率较低，与大棚和室内差异极显著，其最高嫁接成活率仅为8.30％；大棚和室内嫁接成活率较高，均达到70％以上，最高为秋子梨/杜梨组合在大棚中嫁接，成活率达80.00％，大棚中嫁接成活率整体水平较高，但和室内无显著性差异。二、砧木株龄对嫁接成活率的影响嫁接时砧木要求健壮，茎部光滑，无病虫害，选择苗龄分别为：4月、1年和多年生(3年以上)的杜梨砧木，室外评价砧木株龄对嫁接的影响。选择优良无病虫害的杜梨实木苗为砧木，分别以秋子梨不定芽和黄金梨不定芽为接穗评价了砧木株龄对不定芽嫁接成活率的影响，结果见图5、图6所示。结果表明，在田间嫁接时，嫁接成活率均较低，均低于10％，4月生、1年生和多年生(3年以上)砧木嫁接后接穗成活率差异不显著，但均以1年生为最高。三、接穗木质化程度对嫁接成活率的影响接穗要求不定芽长度约1.5～3.0cm，粗度约0.15cm，分别选择非木质化(暗培养3d)、半木质化(暗培养1w后，光照培养13d)和木质化(光照培养30d)的秋子梨不定芽，在大棚内1年生杜梨上进行嫁接，评价接穗木质化程度对嫁接的影响。结果见图7所示。以杜梨实木苗为砧木，秋子梨不定芽为接穗，结果表明，半木质化的不定芽接穗嫁接后具有较高的成活率，达到80％，较非木质化(黄化)和木质化不定芽接穗嫁接后成活率差异显著。四、砧木和接穗预处理对嫁接成活率的影响嫁接选择在砧木的生长季进行，砧木和接穗的预处理方式为以下4种：砧木接穗直接嫁接；砧木提前1w浇水后嫁接(h)+接穗不处理(c)；砧木不处理(c)+接穗活化(增殖)20d后嫁接(r)；砧木提前1w浇水(h)+接穗活化(增殖)20d后嫁接(r)。接穗活化(增殖)20d后嫁接是指不定芽接穗在嫁接前活化处理，即暗培养1w后，再光照培养13d(13天)，共计20天，然后再嫁接。结果见图8所示。砧木和接穗进行预处理主要为增加砧木和接穗的分裂旺盛程度，研究发现砧木和接穗进行预处理可以促进秋子梨不定芽嫁接杜梨砧木成活率，均进行预处理后(h+r)，嫁接成活率为73.33％，显著高于接穗预处理(c+r)，但和砧木预处理(h+c)差异不大，但整体水平较高。五、不同激素种类和组合对嫁接成活率的影响以1年生杜梨实木苗为砧木，秋子梨不定芽为接穗，在大棚中评价不同激素种类和组合对嫁接成活率的影响，处理方式为浸蘸处理，时间约2s，激素种类和组合分别为：naa(0、0.1、0.5mg/l)；iaa(0、0.1、0.5mg/l)+6-ba(0、0.1、0.5mg/l)；iaa(0、0.1、0.5mg/l)+tdz(0、0.1、0.5mg/l)。结果分别如表1-表3所示。表1naa浓度对嫁接成活率的影响单独使用生长素类激素浸蘸接穗对嫁接成活率影响不大，结果显示，在0.1mg/l和0.5mg/lnaa或iaa溶液浸蘸后，秋子梨接穗在杜梨上的嫁接虽然平均成活率提高，但和未使用之前无显著性差异；同时研究发现naa和iaa之间也没有显著性差异，但iaa效果稍好。为优化嫁接技术，提高不定芽嫁接成活率，以iaa和6-ba、iaa和tdz的激素组合为浸蘸液进行了嫁接效果研究。见表2和表3。结果表明，iaa和6-ba组合效果不明显，浸蘸嫁接后成活率提高不明显，无显著性差异，最高仅为80％。iaa和tdz组合后，浸蘸后嫁接较好，成活率达到90％，其中最佳浓度组合为iaa0.1mg/l+tdz0.5mg/l，与对照差异极显著。优选激素混合液组成为：0.1mg/liaa+0.5mg/ltdz。表2iaa和6-ba对嫁接成活率的影响表3iaa和tdz对嫁接成活率的影响编号iaa浓度tdz浓度嫁接成活率(％)10068.33±3.07dc200.175.00±2.24cdbc300.585.00±2.24abab40.1076.67±2.11cbc50.10.176.67±2.11cbc60.10.590.00±2.58aa70.5076.67±3.33cbc80.50.180.00±2.58bcab90.50.578.33±3.07bcbc其中，nn69：nn69培养基；iaa：吲哚乙酸；naa：萘乙酸；6-ba：6-苄基腺嘌呤；tdz：噻苯隆；iba：吲哚丁酸。通过以上条件的筛选，本发明提供的一种梨不定芽嫁接快速繁育方法，包括以下步骤：s1：砧木和接穗的选取砧木：选用1～2年生杜梨或豆梨实木苗，所述实木苗要求健壮，无病虫害，茎干部位光滑便于嫁接；接穗：选用由秋子梨或黄金梨组织培养继代增殖获得的不定芽，要求不定芽长度为1.5～3.0cm，粗度约0.15cm；s2：砧木和接穗的预处理砧木：嫁接时提前1w对砧木进行浇水，便于离皮；接穗：嫁接前活化处理，所述活化处理为暗培养1w后，光照培养13d；s3：嫁接嫁接在可控温度和湿度的大棚或温室中进行，温度为20～30℃，相对湿度50～80％；嫁接方法采用“t”字形芽接，首先在砧木茎干中上部选择较为光滑的地方，用手术刀开“t”字形切口，要求深达木质部，接着用刀开韧皮部；然后取不定芽接穗，在不定芽茎基部斜切，要求手术刀与不定芽茎夹角为30°，之后将斜切后的不定芽茎基部快速浸蘸激素混合液，所述激素混合液组成为：0.1mg/liaa+0.5mg/ltdz；将浸蘸后的不定芽嫁接入砧木茎干的“t”字形切口中，要求不定芽切面朝外紧贴砧木茎的韧皮部，嫁接口用封口膜绑缚封严，然后用塑料袋套在嫁接的不定芽上，并用封口膜绑扎在砧木主干上，以保持嫁接口微环境的湿度，用针在塑料袋上打3～4个小孔用于透气；s4：嫁接后管理嫁接后应保持环境的阴凉湿润，避免阳光照射，定期进行浇水和病虫害防控，20d后进行摘袋，摘袋时首先用剪刀剪开塑料袋顶部进行炼苗，待到接穗增长1～2cm时，摘除塑料袋，正常培养。其中，步骤s1中，由秋子梨组织培养继代增殖获得不定芽时，秋子梨增殖培养基为：nn69+tdz3.0mg/l+iba0.3mg/l+蔗糖25g/l+琼脂7g/l，培养基ph值为5.8，增殖环境条件为温度25±1℃，光照3000lx，光照时长16h/d。步骤s1中，由黄金梨组织培养继代增殖获得不定芽时，黄金梨增殖培养基为：ms+6-ba1.0mg/l+iba0.10mg/l+蔗糖25g/l+琼脂7g/l，培养基ph值为5.8，增殖环境条件为温度25±1℃，光照3000lx，光照时长16h/d。实施例砧木选用1年生杜梨实木苗。接穗选用由秋子梨组织培养继代增殖获得的不定芽。嫁接在冬暖式大棚中进行，温度为20～30℃，相对湿度约80％。具体如下：砧木采用1年生杜梨实木苗，要求健壮，无病虫害，茎干部位光滑便于嫁接，嫁接时提前1w进行浇水，便于离皮；接穗的培养和预处理：不定芽接穗可以是野生种，也可以是栽培种，要求不定芽长度约1.5～3.0cm，粗度约0.15cm，本实施例采用由秋子梨组织培养继代增殖获得的不定芽，嫁接前活化，主要促进其分裂和进行半木质化处理，活化即暗培养1w后，光照培养13d；嫁接：嫁接选择在可控温度和湿度的大棚中进行，要求温度不高于30℃，相对湿度不低于80％；嫁接方法采用“t”字形芽接，首先在砧木茎干中上部选择比较光滑的地方，用手术刀开“t”字形切口，见图9所示，要求深达木质部，接着用刀开韧皮部；其次取不定芽接穗，在不定芽茎基部斜切，要求手术刀与茎夹角为30°，并将不定芽基部快速浸蘸激素混合液(0.1mg/liaa+0.5mg/ltdz)；接着利用手术刀撬开“t”接口，将不定芽基部迅速插入，见图10所示，要求不定芽切面朝外紧贴砧木茎的韧皮部，并马上将嫁接口用parafilm封口膜绑缚封严，见图11所示，要求松紧合适，防止过紧压伤不定芽基部；最后用塑料袋(5cm×7cm)套在嫁接的不定芽上，并用parafilm封口膜绑扎在砧木主干上保持嫁接口微环境的湿度，见图12所示，绑缚过程不要碰到已嫁接的不定芽，同时用针在塑料袋上打3～4个小孔，透气；嫁接后的管理，嫁接后应尽量保持环境的阴凉湿润，避免阳光照射，同时定期进行浇水和病虫害防控，约20d后查看和统计成活率，成活后可以进行摘袋，摘袋时首先用剪刀剪开塑料袋顶部进行炼苗，防止袋子影响接穗生长和保持一定的湿度，待到接穗增长1～2cm以上时，摘除袋子，正常培养即可。图13所示为培育成功的梨苗，生长状况良好。采用本实施例方法共培养300株，成活率为90％，成活率显著提高。以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围。当前第1页12