本发明属于食用菌菌丝的培养方法，具体涉及富硒食用菌液体深层发酵菌丝的方法，还涉及富硒食用菌发酵培养基的制备。
背景技术：
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食用菌的生产途径主要有三种：一、人工栽培，其优点是简单易行，成本低。其缺点是栽培周期长，整个生产周期从1到12个月不等。二、固体发酵，用固体培养基培养食用菌菌丝体，以获得次生代谢产物，菌丝长满培养基约需30天，挖出菌质，晒干供提取用。它的优点：①培养基简单且来源广泛，价格便宜；②发酵过程一般不需要严格的无菌操作；③培养过程供氧和温度可以采用直接空气强制通风来控制；④发酵残渣的处理简单，可直接作为饲料或肥料。但其缺点明显：①培养基水分活度低，培养基不均匀且不易搅拌，菌体的生长、对营养物质的吸收和代谢产物的分泌都不均匀，使得发酵参数的检测和控制困难，也使得连续操作和自动化很困难；②微生物呼吸和代谢所产生热量的温度控制非常困难，因为固体培养基的热传导性差；③由于对影响固态的因素了解不够，培养方法大多基于经验数据和操作的经验，与液体深层发酵相比，劳动强度大，占地面积大，易污染杂菌。三、液体深层发酵，最早报道于20世纪80年代末，研究内容包括营养需要、环境因子、发酵工艺等，以获得最佳操作条件在较短时间内生产大量的菌丝体与代谢产物。优点：①可以进行工业化连续生产，通过控制最佳条件来培养菌丝体，生产工艺规范；②培养原料来源广泛，价格便宜；③通过控制发酵罐的通气搅拌系统、温度调节系统、pH值调节系统和培养基补给系统等装置，培养条件最佳，发酵周期短，生产效率高。(杨海龙等。药用真菌深层发酵生产技术，化学工业出版社，2009年，p14-17，p212)。但是目前的液体深层发酵方法(富硒秀珍菇菌粉的制备方法，申请号：200610135227.2；一种富硒安洛小皮伞菌提取物制剂及其制备方法，申请号：201210014153.2)的原材料来源很大依赖葡萄糖，蛋白胨，等终端产品，而且要适量添加微量元素和维生素，运营成本比较高。
硒是一种化学元素，化学符号是Se，在化学元素周期表中位于第四周期VI A族，是一种非金属。可以用作光敏材料、电解锰行业催化剂、动物体必需的营养元素和植物有益的营养元素等。硒的存在方式分为三种：硒无机化合物、有机硒和单质硒。无机硒一般指业硒酸钠和硒酸钠，有较大的毒性，且不易被吸收，不适合人和动物使用。有机硒通过生物转化与氨基酸结合而成，一般以硒蛋氨酸的形式存在，生物活性硒是人类和动物允许使用的硒源。
因此，开发一种廉价的食用菌液体发酵培养基，培养基中补充硒源生产食用菌菌丝是有必要的。
技术实现要素：
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本发明食用菌液体培养基的原料主要为农作物初级加工产品及副产物，主要包括碎大米、碎玉米、碎小麦、麸皮、菜籽饼、米糠、黄豆粉、土豆及相应的酶制剂，包括淀粉酶和蛋白酶，淀粉酶可以是α-淀粉酶、β-淀粉酶，蛋白酶可以是木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶。
本发明的目的在于制备富硒食用菌液体培养基及富硒食用菌菌丝。
为了实现上述目的本发明包括菌种的富硒诱变和纯化、菌种的耐硒驯化及筛选、摇瓶种子培养、发酵培养基的制备、接种培养及发酵液后期处理五个步骤，为了理解这五个步骤现说明如下：
1菌种的富硒诱变和纯化
在无菌条件下，刮取菌种制成均质液，经蜗牛酶水解去除细胞壁，取合适梯度稀释液点播接种于富硒培养基培养皿中，经紫外线辐射诱变，适温培养，观察菌落形态。选取能正常生长的菌落接种到一号试管母种培养基，适温培养，斜面铺满菌丝后，在无菌条件下，挖取黄豆大小食用菌菌种接种到二号活化试管母种培养基中，适温培养，直到菌丝萌发延伸，切取菌丝尖端转管接种到三号试管母种培养基中，适温培养，切尖端转管的方式重复以上步骤，得到四号活化试管母种、五号活化试管母种、六号试管母种，当试管母种培养基被菌丝完全覆盖即为纯化菌种。真菌菌丝细胞破壁后内容物暴露出来，遗传物质在紫外线辐射下诱变重组，经过耐硒活化得到变异菌株。由于菌丝尖端生长速度比病毒侵染速度快速，经过转接试管种，菌丝逐步脱离病毒得到纯化，纯化菌种的选择可以是二号试管母种至六号试管母种中的一个。所述食用菌菌种的来源是从有资质的科研单位购买或经国家专业机构鉴定可做安全食用的食用菌，可采取自提的方式得到食用菌菌种。食用菌菌种自提的方式可以是食用菌子实体组织分离、孢子培养、土壤残留菌丝分离培养。所述的培养温度是10摄氏度到30摄氏度之间适温培养。所述的一号至六号试管母种培养基配制方法相同：称取马铃薯200克，洗净、切成小块后加蒸馏水，沸水煮30分钟，取其煮汁加入葡萄糖30克、蛋白胨3克、磷酸二氢钾1.2克、硫酸镁0.5克、琼脂18～20克、维生素B12～5毫克，加蒸馏水定容至1000毫升，pH自然，121℃高压灭菌25～30分钟，压力归零后取出固定倒斜面，待温度降至30℃以下后使用。所述富硒培养基亚硒酸钠添加量0.01g-0.5g，其余组分和试管母种培养基相同，配置方法相同。
2菌种的耐硒驯化及筛选
在无菌条件下将纯化菌种接种到十个相同一号富硒试管母种培养基中，适温培养，观察选取生长速率最快的转管接种到二号富硒试管母种培养基中，适温培养，重复以上步骤，得到三号富硒试管母种、四号富硒试管母种、五号富硒试管母种、六号富硒母种，当富硒试管母种培养基被菌丝完全覆盖即为富硒试管母种。亚硒酸钠对菌丝生理活性有影响，菌丝培养基中亚硒酸钠含量由低到高逐步渐进添加可以减轻菌丝的应激反应。每一次选择可以淘汰遗传性状不稳定的菌种，经过转接试管种，菌丝逐步适应富硒的培养基，富硒试管母种菌种的选择可以是二号试管母种至六号试管母种中的一个。所述的培养温度是10摄氏度到30摄氏度之间适温培养。所述的一号至六号试管母种培养基添加量除亚硒酸钠外配制方法相同：称取马铃薯200克，洗净、切成小块后加蒸馏水，沸水煮30分钟，取其煮汁以及葡萄糖30克、蛋白胨3克、磷酸二氢钾1.2克、硫酸镁0.5克、琼脂18～20克、维生素B12～5毫克、加蒸馏水定容至1000毫升，pH自然，121℃高压灭菌25～30分钟，压力归零后取出固定倒斜面，待温度降至30℃以下后使用。亚硒酸钠添加量0.001g-0.5g使其浓度从一号至六号试管依次递增。
3摇瓶种子培养
将经过耐硒驯化及筛选后的菌种在无菌操作环境下用接种铲挖取黄豆大小菌种接种到250ML锥形瓶摇瓶培养基中使其漂浮，适温培养12小时-24小时后，菌种萌发，启动摇瓶培养震荡装置，转速100-160转/分钟继续培养3到7天直到产生均匀分布米粒大小菌球或米粒长短菌丝。所述的培养温度是10摄氏度到30摄氏度之间适温培养。所述的摇瓶培养基配制方法是：称取马铃薯200克，洗净、切成小块后加蒸馏水，沸水煮30分钟，取其煮汁以及葡萄糖30克、蛋白胨3克、磷酸二氢钾1.2克、硫酸镁0.5克、琼脂18～20克、维生素B12～5毫克、亚硒酸钠添加量0.05g-0.5g(与耐硒筛选后选用母种的硒浓度一致)，加蒸馏水定容至1000毫升，导入250ml锥形瓶定容100ml-120ml/瓶，用棉塞塞住，牛皮纸包扎瓶口，pH自然，121℃高压灭菌25～30分钟，压力归零后取出，待温度降至30℃以下后使用。
4发酵培养基的制备
将糖化处理液和蛋白水解液分别升温到100摄氏度维持2-5分钟高温灭活，过滤滤液导入空消过的发酵罐加蒸馏水定容，维持蒸汽压力0.1-0.12MPa原位灭菌45分钟，压力回零后强制冷却至18到26摄氏度即为发酵培养基。所述的糖化处理液配制方法：碎大米、碎玉米、碎小麦按比例称重，添加5到20倍质量的水，加入亚硒酸钠使其质量分数0.002％-0.02％，100摄氏度煮1小时，温度降温至55-65摄氏度添加淀粉酶，在55-65摄氏度之间保持30分钟-2小时，添加的淀粉酶可以是α-淀粉酶与β-淀粉酶一种或两种。所述的蛋白水解液配制方法：麸皮、菜籽饼、米糠、黄豆粉按比例称重，添加5到20倍质量的水，加入亚硒酸钠使其质量分数0.003％-0.03％，加热至55摄氏度添加蛋白酶，在55到65摄氏度之间保持30分钟到4小时，添加的蛋白酶可以是木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶和菠萝蛋白酶的一种、两种或三种。碎大米，碎玉米，碎小麦含有丰富的淀粉，经过淀粉酶水解能得到食用菌菌丝容易吸收的碳源。麸皮、菜籽饼、米糠、黄豆粉含有丰富的蛋白质和维生素矿物质，经蛋白酶水解能得到食用菌菌丝容易吸收的氮源。亚硒酸钠添加最终浓度和摇瓶种子培养基一致，亚硒酸钠经过培养基预处理可以降低毒性，易于食用菌菌丝的吸收。
5接种、培养
选取健壮无污染均匀悬浮的摇瓶种子，以无菌操作按4％-10％体积添加量加入发酵培养基中，10到30摄氏度之间适温培养，通入洁净空气培养5-10天。
6发酵液后期处理
采样分析，以单位体积离心测干物质重量和溶液发酵液PH判定培养反应终点。用4到10层纱布采用真空抽滤的方式分离菌丝和滤液，菌丝热风干燥，滤液喷雾干燥，分别包装。
实施实例一
为了更好的理解本发明，以北冬虫夏草为例说明如下：
1菌种的富硒诱变和纯化
在无菌条件下，刮取菌种加入缓冲液制成均质液，经蜗牛酶处理水解去除细胞壁，十的负一次方到十的负十次方梯度稀释液点播接种于富硒培养基培养皿中，经20w紫外灯紫外线30CM辐射5s-20s诱变，适温培养，观察菌落形态。选取能正常生长的菌落接种到一号试管母种培养基，22-25摄氏度避光培养，斜面铺满菌丝后，在无菌条件下，挖取黄豆大小食用菌菌种接种到二号活化试管母种培养基中，适温培养，直到菌丝萌发延伸，切取菌丝尖端转管接种到三号试管母种培养基中，适温培养，切尖端转管的方式重复以上步骤，得到四号活化试管母种、五号活化试管母种、六号试管母种，选取六号试管母种为纯化菌种。所述食用菌菌种的来源是湖北省武汉华中食用菌栽培研究所。所述的一号至六号试管母种培养基配制方法相同：称取马铃薯200克，洗净、切成小块后加蒸馏水，沸水煮30分钟，取其煮汁加入葡萄糖30克、蛋白胨3克、磷酸二氢钾1.2克、硫酸镁0.5克、琼脂18～20克、维生素B1 5毫克，加蒸馏水定容至1000毫升，pH自然，121℃高压灭菌25～30分钟，压力归零后取出固定倒斜面，待温度降至30℃以下后使用。所述富硒培养基亚硒酸钠添加量0.05-0.2g，其余组分和试管母种培养基相同，配置方法相同。
2菌种的耐硒驯化及筛选
在无菌条件下将纯化菌种接种到十个相同一号富硒试管母种培养基中，适温培养，观察选取生长速率最快的转管接种到二号富硒试管母种培养基中，22-25摄氏度培养，重复以上步骤，得到三号富硒试管母种、四号富硒试管母种、五号富硒试管母种、六号富硒母种，当富硒试管母种培养基被菌丝完全覆盖即为富硒试管母种。所述的一号至六号试管母种培养基添加量除亚硒酸钠外配制方法相同：称取马铃薯200克，洗净、切成小块后加蒸馏水，沸水煮30分钟，取其煮汁以及葡萄糖30克、蛋白胨3克、磷酸二氢钾1.2克、硫酸镁0.5克、琼脂18～20克、维生素B12～5毫克、加蒸馏水定容至1000毫升，pH自然，121℃高压灭菌25～30分钟，压力归零后取出固定倒斜面，待温度降至30℃以下后使用。亚硒酸钠添加量0.005g-0.2g使其浓度从一号至六号试管依次递增。
3摇瓶种子培养
将经过耐硒驯化及筛选后的菌种在无菌操作环境下用接种铲挖取黄豆大小菌种接种到250ML锥形瓶摇瓶培养基中使其漂浮，避光于22-25摄氏度培养24小时后，菌种萌发，启动摇瓶培养震荡装置，转速140转/分钟继续培养4天产生均匀分布米粒大小菌球。所述的摇瓶培养基配制方法是：称取马铃薯200克，洗净、切成小块后加蒸馏水，沸水煮30分钟，取其煮汁以及葡萄糖30克、蛋白胨3克、磷酸二氢钾1.2克、硫酸镁0.5克、琼脂18～20克、维生素B12～5毫克、亚硒酸钠添加量0.05g-0.5g(与耐硒筛选后选用母种的硒浓度一致)，加蒸馏水定容至1000毫升，导入250ml锥形瓶定容100ml/瓶，用棉塞塞住，牛皮纸包扎瓶口，pH自然，121℃高压灭菌30分钟，压力归零后取出，待温度降至22-25摄氏度使用。
4发酵培养基的制备
将糖化处理液和蛋白水解液分别升温到100摄氏度维持2分钟高温灭活，过滤滤液导入空消过的10L发酵罐加蒸馏水定容至6L，维持蒸汽压力0.12MPa原位灭菌45分钟，压力回零后强制冷却至24摄氏度即为发酵培养基。所述的糖化处理液配制方法：碎大米、碎小麦按200g∶200g比例称重，添加2L的水，加入亚硒酸钠0.2g，100摄氏度煮1小时，温度降温至55-65摄氏度添加α-淀粉酶，在55-65摄氏度之间保持1小时。所述的蛋白水解液配制方法：麸皮、黄豆粉按50g∶150g比例称重，添加2L的水，加入亚硒酸钠0.4g，加热至55摄氏度添加木瓜蛋白酶，在55到65摄氏度之间保持2小时。
5接种、培养
选取健壮无污染均匀悬浮的摇瓶种子，以5％体积添加量加入发酵灌中，24摄氏度避光恒温通入洁净空气培养。
6发酵液后期处理
采样分析，以单位体积离心测干物质重量和溶液发酵液PH判定培养反应终点。用6层纱布采用真空抽滤的方式分离菌丝和滤液，菌丝热风干燥，滤液喷雾干燥，分别包装。
实施实例二
为了更好的理解本发明，以尖顶羊肚菌为例说明如下：
1菌种的富硒诱变和纯化
在无菌条件下，刮取菌种加入缓冲液制成均质液，经蜗牛酶处理水解去除细胞壁，十的负一次方到十的负十次方梯度稀释液点播接种于富硒培养基培养皿中，经20w紫外灯紫外线30CM辐射2s-30s诱变，适温培养，观察菌落形态。选取能正常生长的菌落接种到一号试管母种培养基，15-18摄氏度避光培养，斜面铺满菌丝后，在无菌条件下，挖取黄豆大小食用菌菌种接种到二号活化试管母种培养基中，15-18摄氏度培养，直到菌丝萌发延伸，切取菌丝尖端转管接种到三号试管母种培养基中，15-18摄氏度培养，切尖端转管的方式重复以上步骤，得到四号活化试管母种、五号活化试管母种，选取五号试管母种为纯化菌种。所述食用菌菌种的来源是湖北省武汉华中食用菌栽培研究所。所述的一号至六号试管母种培养基配制方法相同：称取马铃薯200克，洗净、切成小块后加蒸馏水，沸水煮30分钟，取其煮汁加入葡萄糖30克、蛋白胨3克、磷酸二氢钾1.2克、硫酸镁0.5克、琼脂18～20克、维生素B1 5毫克，加蒸馏水定容至1000毫升，pH自然，121℃高压灭菌25～30分钟，压力归零后取出固定倒斜面，待温度降至20℃以下后使用。所述富硒培养基亚硒酸钠添加量0.05-0.2g，其余组分和试管母种培养基相同，配置方法相同。
2菌种的耐硒驯化及筛选
在无菌条件下将纯化菌种接种到十个相同一号富硒试管母种培养基中，适温培养，观察选取生长速率最快的转管接种到二号富硒试管母种培养基中，15-18摄氏度培养，重复以上步骤，得到三号富硒试管母种、四号富硒试管母种、五号富硒试管母种、六号富硒母种，当富硒试管母种培养基被菌丝完全覆盖即为富硒试管母种。所述的一号至六号试管母种培养基添加量除亚硒酸钠外配制方法相同：称取马铃薯200克，洗净、切成小块后加蒸馏水，沸水煮30分钟，取其煮汁以及葡萄糖30克、蛋白胨3克、磷酸二氢钾1.2克、硫酸镁0.5克、琼脂18～20克、维生素B12～5毫克、加蒸馏水定容至1000毫升，pH自然，121℃高压灭菌25～30分钟，压力归零后取出固定倒斜面，待温度降至20℃以下后使用。亚硒酸钠添加量0.005g-0.2g使其浓度从一号至六号试管依次递增。
3摇瓶种子培养
将经过耐硒驯化及筛选后的菌种在无菌操作环境下用接种铲挖取黄豆大小菌种接种到250ML锥形瓶摇瓶培养基中使其漂浮，避光于16摄氏度培养24小时后，菌种萌发，启动摇瓶培养震荡装置，转速135转/分钟继续培养3天产生均匀分布菌丝。所述的摇瓶培养基配制方法是：称取马铃薯200克，洗净、切成小块后加蒸馏水，沸水煮30分钟，取其煮汁以及葡萄糖30克、蛋白胨3克、磷酸二氢钾1.2克、硫酸镁0.5克、琼脂18～20克、维生素B12～5毫克、亚硒酸钠添加量0.05g-0.5g(与耐硒筛选后选用母种的硒浓度一致)，加蒸馏水定容至1000毫升，导入250ml锥形瓶定容100ml/瓶，用棉塞塞住，牛皮纸包扎瓶口，pH自然，121℃高压灭菌30分钟，压力归零后取出，待温度降至15-18摄氏度使用。
4发酵培养基的制备
将糖化处理液和蛋白水解液分别升温到100摄氏度维持2分钟高温灭活，过滤滤液导入空消过的10L发酵罐加蒸馏水定容至6L，维持蒸汽压力0.12MPa原位灭菌45分钟，压力回零后强制冷却至24摄氏度即为发酵培养基。所述的糖化处理液配制方法：碎大米、碎小麦按200g∶200g比例称重，添加2L的水，加入亚硒酸钠0.2g，100摄氏度煮1小时，温度降温至55-65摄氏度添加α-淀粉酶，在55-65摄氏度之间保持1小时。所述的蛋白水解液配制方法：麸皮、黄豆粉按50g∶150g比例称重，添加2L的水，加入亚硒酸钠0.4g，加热至55摄氏度添加木瓜蛋白酶，在55到65摄氏度之间保持2小时。
5接种、培养
选取健壮无污染均匀悬浮的摇瓶种子，以6％体积添加量加入发酵灌中，15摄氏度避光恒温通入洁净空气培养。
6发酵液后期处理
采样分析，以单位体积离心测干物质重量和溶液发酵液PH判定培养反应终点。用5层纱布采用真空抽滤的方式分离菌丝和滤液，菌丝热风干燥，滤液喷雾干燥，分别包装。
有益效果
本发明采用农副产品为主要原料节省成本，经糖化和蛋白水解处理过的发酵液富含食用菌易于吸收的碳源和氮源，还含有微量元素和维生素，是一种全营养型培养基。菌种经过活化耐硒筛选，培养基中的硒经过预处理，增强了菌种对硒的适应力和耐受力。