本发明属于转基因植物的培育技术领域，具体涉及一种转基因百脉根组培苗的培育方法。
背景技术：
生物固氮在农业生产中具有十分重要的作用，它能为粮食作物提供氮素、提高产量、降低化肥用量和生产成本、减少环境污染，防治土地荒漠化、建立生态平衡和促进农业可持续发展。豆科植物能够与土壤中的根瘤菌共生形成根瘤，根瘤可将空气中的氮气固定并提供给植物生长发育。根瘤固氮必须满足两个条件，一是根瘤菌通过根毛进入根表皮细胞形成侵入线(infectionthreads,it)，即表皮细胞的遗传途径；二是植物根皮层细胞不断分裂形成膨大的根瘤原基(nidulationprimodium,np)，即皮层细胞的遗传途径。在产生有效根瘤时，植物体中有很多的基因都参与其中，其中就包括钙调素基因(cam)。早前有研究表明钙调蛋白可能是it途径参与重要调节，同时钙调蛋白基因是一个家族基因，即在生物体中存在结构和功能都有相似性的基因。在高等植物体中不同钙调蛋白基因能编码不同蛋白亚型，而且不同植物体中的钙调蛋白数量也不尽相同。早年间，有人已经研究了大豆钙调蛋白家族(scams)在不同胁迫条件下具有不同的生物化学特征及表达模式，表明不同大豆钙调蛋白家族成员有着不同功能。
百脉根作为豆科多年生植物，二倍体(2n＝12)，自花授粉，具有相对紧凑的基因组(470mb)，种子产量高，成熟时间短等特点，因此是研究豆科植物根瘤固氮机理的模式植物。但是值得注意的是，至今少有见到钙调素家族蛋白在根瘤菌-豆科植物共生固氮方面的研究报道，如百脉根中钙调素家族蛋白中哪些参与了根瘤菌-豆科植物共生固氮，表达机制如何等鲜有报道。
技术实现要素：
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种转基因百脉根组培苗的培育方法，通过农杆菌介导，将百脉根钙调蛋白基因转化到百脉根中，然后通过转基因组培实验获得过表达百脉根植株，为钙调素蛋白在根瘤菌-豆科植物共生固氮的影响奠定基础。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种转基因百脉根组培苗的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用砂纸轻柔摩擦种子，然后对其进行消毒；
(2)种子萌发
将消毒后的种子放置于浸湿的无菌滤纸上，置于室温、黑暗条件下，直至百脉根下胚轴长度为1.5-2cm；
(3)农杆菌转化及培养
将百脉根钙调素基因插入质粒中得到重组质粒，将重组质粒转化农杆菌，然后接种在yep培养基中，于28℃下培养，然后挑选阳性菌，在选择培养基中划线培养，培养温度为28℃，培养时间为2-3天；
(4)共培养
将步骤(3)所得菌置于yep培养基中，制成细胞悬浮液，然后将5-8层滤纸用共培养基浸泡，然后加入细胞悬浮液，将步骤(2)所得幼苗下胚轴切成0.5-0.6cm长，置于浸泡过细菌的滤纸上，在24℃，黑暗条件下孵育4-5天；
(5)重生
将含有下胚轴外植体的最上层滤纸从共培养基转移至再生培养基中，然后置于24℃、连续光照且光照强度为8000lx条件下培养3-4天；
(6)选择培养
将含有下胚轴外植体的滤纸从再生培养基中转移到选择培养基中，然后置于24℃、连续光照且光照强度为8000lx条件下培养，直至可分离的愈伤组织；
(7)芽诱导和延长
从下胚轴外植体中分离愈伤组织并置于含选择剂的芽诱导培养基上，然后置于24℃、光照强度为8000lx、光照时间为16h/8hday/night条件下孵育愈伤组织，每2周将其转移至新鲜的芽诱导培养基上，培养4周后去除选择剂；当形成肉眼可见的芽时，将含有芽的愈伤组织转移到芽伸长培养基中进行培养，培养温度为24℃，光照强度为8000lx，光照时间为16h/8hday/night；
(8)根诱导和延长
当单个芽长到1-2cm时切下，移至含有根诱导培养基的培养皿中，置于24℃、连续光照且光照强度为8000lx条件下培养一周，然后转移到根伸长培养基中进行培养，当根系发达后，将根置于培养了2天的根瘤菌菌液中浸泡5min，然后移栽到含有蛭石/砂混合物的栽培基质中进行炼苗，炼苗过程中温度为24℃，光照强度为5000lx，光照时间为16h/8hday/night。
进一步地，步骤(3)中yep培养基中还含有100μg/ml的rif、100μg/ml的kan和100μg/ml的strep。
进一步地，1l共培养基包括：5mm的mes0.976g、0.1x维生素b5和naa0.05μg/ml，余量为水，ph值为5.2。
进一步地，步骤(5)中1l再生培养基包括：ms培养基4.75g、蔗糖30g、(nh4)2so41.321g、agar0.6％、1x维生素b5、ba0.5μg/ml、naa0.05μg/ml、头孢噻肟300μg/ml，余量为水，ph值为5.7。
进一步地，步骤(6)中1l选择培养基包括：ms培养基4.75g、蔗糖30g、(nh4)2so41.321g、agar0.6％、1x维生素b5、ba0.5μg/ml、naa0.05μg/ml、头孢噻肟300μg/ml、kan100μg/ml，余量为水，ph值为5.7。
进一步地，步骤(7)中1l芽诱导培养基包括：ms培养基4.75g、蔗糖30g、(nh4)2so41.321g、agar0.6％、1x维生素b5、ba0.5μg/ml、naa0.05μg/ml、头孢噻肟150μg/ml、kan100μg/ml，余量为水，ph值为5.7。
进一步地，步骤(7)中1l芽伸长培养基包括：ms培养基4.75g、蔗糖30g、(nh4)2so41.321g、agar0.6％、1x维生素b5、ba0.2μg/ml、头孢噻肟150μg/ml，余量为水，ph值为5.7。
进一步地，步骤(8)中1l根诱导培养基成分为：ms培养基2.375g、蔗糖10g、agar0.6％、1/2x维生素b5、naa0.5μg/ml，余量为水，ph值为5.7。
进一步地，步骤(8)中1l根伸长培养基成分为：ms培养基2.375g、蔗糖10g、agar0.6％、1/2x维生素b5，余量为水，ph值为5.7。
本发明提供的转基因百脉根组培苗的培育方法，具有以下有益效果：
(1)本发明成本低，实际操作简单。
(2)扩增系数大，少量材料就能得到大量植株，即一颗种子就能取3-4段外植体，每个外植体脱分化可得到大量愈伤组织，一团愈伤组织就能够得到数个芽苗，最后都能诱导成完整的植株。
(3)培育过程不受时间和空间限制，能够按照人为需要进行培养。
(4)转化效率高，在短时间内能够成功转化出大量转基因植株。
具体实施方式
实施例1
一种转基因百脉根组培苗的培育方法，包括以下步骤：
(1)种子预处理
由于百脉根种子种皮较厚不透水，可先用砂纸轻柔摩擦种子，将种皮打磨轻薄，有利于种子的快速萌发。
(2)种子消毒
将预处理后的种子浸入体积分数为70％的乙醇和质量浓度为1％的sds的混合溶液中，消毒5min，然后除去乙醇，再用质量浓度为20％的naclo和质量浓度为0.1％的sds的混合溶液对种子进行消毒，消毒10min，消毒完毕后，取出种子，在无菌超净工作台中，用无菌milliq水冲洗消毒后的种子15-20次，最后将洗好的种子浸泡于无菌milliq水中，室温下过夜。
(3)种子萌发
在灭菌后的培养皿上铺0.5cm厚的无菌滤纸，用无菌milliq水浸湿，然后将步骤(2)所得种子放置于浸湿的无菌滤纸上，室温、黑暗条件下使种子发芽5-7天，直至百脉根下胚轴长度为1.5-2cm。
(4)农杆菌转化及培养
将目的基因即百脉根钙调素基因ljcams插入pub-gfp质粒中得到重组质粒，将重组质粒转化lba4404农杆菌，然后接种在yep培养基(加入工作浓度为100μg/ml的rif、100μg/ml的kan抗生素和100μg/ml的strep)后，于28℃下培养，然后挑选单个菌落，经pcr检测，挑选出阳性菌；采用无菌牙签挑取阳性农杆菌，然后在选择培养基中划线培养，在28℃下培养3天，以未转化农杆菌作为阴性对照。
本发明培养基中所表述激素和抗生素浓度均为最终浓度。
(5)共培养
准备共培养板：将大于5层无菌滤纸放置在培养皿的中心，并用约8ml共培养培养基浸泡，每个菌种制作5个平板。
上述共培养培养基成分为：浓度为5mm的mes0.976g，然后添加ddh2o至1l，并调节培养基ph值为5.2，经灭菌冷却至50℃左右后加入终浓度为0.1x维生素b5(sigmag5768)和naa0.05μg/ml。
使用无菌刮刀将步骤(4)中在选择培养基中培养3天的细菌刮到含有约5mlyep培养基的无菌管中，轻轻旋涡以使悬浮细胞浸入培养基中，然后将1ml的悬浮细胞均匀地倒入含有共培养培养基的培养皿中。
将幼苗下胚轴横向切成2-3片，每个长度约0.5cm，将其直接放在细菌浸泡的滤纸表面，在24℃，黑暗条件下孵育5天，如果培养过程中纸张变干，则要继续添加yep培养基；每个共培养板中需转移30个下胚轴外植体。
(6)重生
将含有下胚轴外植体的最上层滤纸从共培养基转移至再生培养基中，然后置于24℃、连续光照且光照强度为8000lx条件下培养4天，此时下胚轴切段会变成绿色。
上述再生培养基成分为：ms培养基4.75g、蔗糖30g、(nh4)2so41.321g、agar0.6％，添加ddh2o至1l，并调节培养基ph值为5.7，经灭菌冷却至50℃左右后加入终浓度为1x维生素b5、ba0.5μg/ml、naa0.05μg/ml、头孢噻肟300μg/ml。
(7)选择
将含有下胚轴外植体的滤纸从再生培养基中转移到选择培养基中，然后置于24℃、连续光照且光照强度为8000lx条件下培养，直至开始出现绿色愈伤组织(3-4周)，然后每周更换至新鲜的选择培养基中，此选择培养过程的培养时间总共为1-2个月。
上述选择培养基成分为：ms培养基4.75g、蔗糖30g、(nh4)2so41.321g、agar0.6％，添加ddh2o至1l，并调节培养基ph值为5.7，经灭菌冷却至50℃左右后加入终浓度为1x维生素b5、ba0.5μg/ml、naa0.05μg/ml、头孢噻肟300μg/ml、kan100μg/ml。
(8)芽诱导和延长
从下胚轴外植体中分离绿色愈伤组织并置于芽诱导培养基上，然后置于24℃、光照强度为8000lx、光照时间为16h/8hday/night条件下孵育愈伤组织，每2周将其转移至新鲜的芽诱导培养基上，培养4周后去除选择剂kan。
当形成肉眼可见的芽时，将含有芽的愈伤组织转移到芽伸长培养基中进行培养，培养温度为24℃，光照强度为8000lx，光照时间为16h/8hday/night。
上述芽诱导培养基成分为：ms培养基4.75g、蔗糖30g、(nh4)2so41.321g、agar0.6％，添加ddh2o至1l，并调节培养基ph值为5.7，经灭菌冷却至50℃左右后加入终浓度为1x维生素b5、ba0.5μg/ml、naa0.05μg/ml、头孢噻肟150μg/ml、kan100μg/ml。
芽伸长培养基成分为：ms培养基4.75g、蔗糖30g、(nh4)2so41.321g、agar0.6％，添加ddh2o至1l，并调节培养基ph值为5.7，经灭菌冷却至50℃左右后加入终浓度为1x维生素b5、ba0.2μg/ml、头孢噻肟150μg/ml。
(9)根诱导和延长
当单个芽长到1-2cm时切下，移至含有根诱导培养基的培养皿中，置于24℃、连续光照且光照强度为8000lx条件下培养一周，然后转移到根伸长培养基中进行培养，当根系发达后，将根置于培养了2天的根瘤菌nzp2235菌液中浸泡5min，然后移栽到含有蛭石/砂混合物的栽培基质中进行炼苗，炼苗过程中温度为24℃，光照强度为5000lx，光照时间为16h/8hday/night，再在苗上盖上盖子，一周后逐步揭开盖子，防止转基因苗因为环境改变过大，导致大量死亡的情况。
上述根诱导培养基成分为：ms培养基2.375g、蔗糖10g、agar0.6％，添加ddh2o至1l，并调节培养基ph值为5.7，经灭菌冷却至50℃左右后加入终浓度为1/2x维生素b5、naa0.5μg/ml。
根伸长培养基成分为：ms培养基2.375g、蔗糖10g、agar0.6％，添加ddh2o至1l，并调节培养基ph值为5.7，经灭菌冷却至50℃左右后加入终浓度为1/2x维生素b5。
本发明中使用的维生素b5为购买的试剂母液，其含量为1000x(即1000倍)。
(10)筛选
待上述植物长至5-6片复叶时，剪取部分叶片，提取其dna作为模板，截选部分gfp基因设计引物，然后进行pcr反应，若能扩增出长度为743bp的条带，说明转基因成功。
筛选过程中设计的引物序列如下：
上游引物：5'-ggccgctttacttgtacagctcgtc-3'(seqidno：1)；
下游引物：5'-cgaggaattcgatcccatggtgagc-3'(seqidno：2)。
pcr反应体系：dna模板1μl、上游引物0.5μl、下游引物0.5μl、taq酶0.25μl、10×buffer2.5μl、浓度为2.5mm的dntps2.0μl，用去离子水补足至25μl。
pcr反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸60s，共30个循环，最后72℃延伸10min。
本发明通过选择具有强启动子camv35spromoter的质粒pub-gfp，然后向该质粒上分别连接不同的百脉根钙调蛋白基因(ljcam1,ljcam2,ljcam3,ljcam4，其序列分别见seqidno:3-6)，然后借由农杆菌介导转化百脉根，再通过转基因组培实验获得过表达百脉根植株。本发明提供的培育方法，培育出的转基因植株，其成活率和转化率均较高，成活率高达90％以上，转化率达25％以上，同时培育时间短，从种子到生长成完整的植株仅需要135-150天。将该转基因植株用来进行钙调素蛋白在根瘤菌-豆科植物共生固氮方面的研究，进而丰富钙调素蛋白在植物体中的功能。
序列表
<110>四川农业大学
<120>一种转基因百脉根组培苗的培育方法
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
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