本发明涉及获得一种容器内促进春剑种胚发育的共生培养法，具体来说涉及一种将野生春剑(cymbidiumgoeringiivar.longibracteatum)菌根研磨成匀浆液，再通过将无菌春剑种子与匀浆液进行共生培养，促进春剑种胚发育的共生培养法。
背景技术：
春剑是我国西南地区一个独特的兰种。春剑种子细小如灰尘，不含胚乳，正常情况下难以萌发，多依赖与内生有益真菌共生而萌发。目前关于春剑种子的萌发，多是采用在无菌条件下的人工培养基中进行非共生萌发，非共生萌发的萌发时间较长且得到的幼苗在进行野外再引入时，幼苗移植到自然环境中存活率较低，并且由于无法与自然界中的真菌建立共生关系从而导致后续生长严重受限。春剑菌根匀浆液中含有多种内生真菌，通过将春剑种子与春剑菌根匀浆液在容器内进行共生培养，不仅能促进春剑种胚的生长发育，还能使春剑种胚与对应的有益真菌建立共生关系。因此，将春剑菌根匀浆液与春剑种子进行共生培养是开展春剑再引入技术的关键环节。
技术实现要素：
本发明的目的是针对花费较长时间用组织块分离的方法获得的内生菌反而是杂菌或有害菌这一不足，提供了一种直接将野生春剑菌根进行研磨，将研磨后的匀浆液与春剑种子进行共生的方法，为实现春剑再引入技术创造条件。
本发明的技术方案主要是基于以下认识。
我们将野生春剑的菌根进行研磨，用兰花土壤、苔藓以及制得的春剑菌根匀浆液制备共生基质，将春剑种子置于共生基质中进行共生生长，诱导春剑种胚发育，同时设置不加菌根匀浆液做对照实验，并对发育形成的共生体系进行镜检，以检验春剑菌根匀浆液对春剑种子发育的有效性，结果表明春剑菌根研磨液能促进春剑种胚发育并与其对应的有益真菌建立共生体系，从而实现了本发明的目的。
一种容器内促进春剑种胚发育的共生培养法，包括以下步骤：
（1）在春剑原生境范围内挖取野生春剑，剪取健康、完整的春剑菌根，将菌根置于流水下冲洗掉泥土后用酒精和升汞溶液进行消毒处理，最后用蒸馏水继续冲洗，对菌根表面的外生菌进行消毒灭活；
（2）将消毒后的菌根切割成1cm左右的小段，置于研钵中充分研磨，将研磨完成后得到的菌根匀浆液放于烧杯中保存备用；
（3）采集兰花土壤和新鲜苔藓并晾干，先往100ml三角瓶中装入适量的兰花土壤，而后在兰花土壤上平铺一层苔藓，最后均匀倒入适量的匀浆液，制成共生基质；
（4）将春剑种子接入共生基质中，同时设置不加匀浆液作为对照处理，每个处理重复10次，用牛皮纸对三角瓶进行封口后置于光照培养室培养，培养条件为：光照强度为2500lx，温度25℃，光周期12h/12hl/d；
（5）每周观察一次不同处理的种子并记录春剑种胚的发育情况，对各发育阶段的春剑种胚进行显微镜和扫描电镜观察，通过和不加匀浆液的处理组进行对比，验证共生体系的建立。
上述步骤（1）中流水下冲洗10min，蒸馏水冲洗5min，酒精和升汞消毒方式是75%酒精浸泡5min，0.1%的升汞溶液消毒4min。
上述步骤（2）中研磨春剑菌根时可加入少许蒸馏水使研磨更充分。
上述步骤（3）中兰花土壤的成分为：腐叶土、蛭石、红砂石1:1:1均匀混合。
上述步骤（3）中共生基质的配比：兰花土壤、苔藓2:1均匀混合。
上述步骤（4）中春剑种子是选取已成熟且未开裂的果荚。
本发明方法所用的春剑种子来源于西南科技大学兰科植物繁育中心。
本发明相对于现有技术具有的优点在于：国内外关于兰科共生培养的方式均是先从野生兰科植物的菌根中分离出其内生有益真菌，但这些方法获得内生菌中存在许多无用或有害的杂菌，所以不得不进行大量、复杂的筛选工作，并且不同兰科植物内生菌专一性问题使得分离有效真菌的工作愈发繁琐。本发明的方法在于野生春剑菌根中存在多种内生菌，直接研磨野生春剑菌根，则所得的匀浆液中必然包含有益内生菌，将匀浆液与春剑种子共生培养，其中有益内生菌则会在适宜的条件下侵入春剑种子细胞内，从而建立共生关系。此方法操作简单，大大缩短了共生关系建立的时间，为春剑以及其他濒危兰科植物再引入体系的建立开辟了新途径。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明提供了一种容器内促进春剑种胚发育的共生培养法，具体按照以下步骤实施：
选取来自四川通江野生春剑原生境野生春剑菌根，采集植株生长健康且菌根完整、无病虫害的野生春剑，将菌根剪下后用流水冲走泥土并维持冲洗10min，之后用75%的酒精和0.1%升汞溶液分别对菌根表面进行5min和4min的消毒处理，最后用蒸馏水清洗并维持5min，将消毒完成后的菌根放于烧杯中备用。
将消毒后的菌根切割成1cm左右的小段，每次取10小段菌根置于研钵中并往研钵中加入5ml蒸馏水后便开始进行充分研磨，待研磨充分后将得到的匀浆液倒入烧杯中保存备用。
按照腐叶土、蛭石、红砂石1:1:1的比例采集兰花土壤同时采集苔藓，将两者自然风干后先往100ml三角瓶里装入适量的兰花土壤且铺满三角瓶底即可，然后在兰花土壤表面平铺一层苔藓，最后均匀倒入10ml菌根匀浆液，从而制备出共生基质。
选取来自西南科技大学兰科植物繁育中心的已成熟且尚未开裂的春剑果荚。春剑果荚用0.1%升汞溶液和75%酒精分别消毒8min和5min后用蒸馏水清洗，待果荚干燥后用手术刀切开果皮，按每200-300粒种子均匀播种在一瓶共生基质中。设置不加匀浆液的基质作为对照组，每个处理重复10次，最后用牛皮纸对三角瓶进行封口并置于培养条件为光照强度为2500lx，温度25℃，光周期12h/12hl/d的光照培养室进行培养。
培养7周之后，春剑种子便陆续开始吸水膨大，之后春剑种胚继续生长发育到种皮破裂露出种胚、发育成原球茎以及发育形成根状茎；而未加匀浆液对照组的春剑种子在培养第5个月后才开始有种子吸水膨大，说明春剑菌根匀浆液对春剑种胚的发育具有促进作用。
分别在春剑种胚不同发育阶段中从三角瓶中夹出生长状态较好的已膨大的春剑种子、种皮破裂露出种胚的春剑种子、发育成的原球茎和发育形成的根状茎，自来水下冲洗干净并用滤纸吸干多余的水分，制成形态完整、透明且薄的切片后置于荧光倒置显微镜下观察，观察到春剑种子吸水后种皮膨胀，种皮细胞中有菌丝和菌丝结等真菌结构，种皮细胞膨胀到破裂露出种胚时菌丝和菌丝结等真菌结构仍存在于种皮细胞并且开始有菌丝侵入种胚，原球茎和根状茎阶段的细胞中也有菌丝和菌丝结等真菌结构，从而判断共生体系已建立；再将这些切片放于扫描电镜下观察，当观察到每个阶段的细胞上均有大量被一层质膜包围的球状颗粒物质时再次证明共生体系已成功建立。