本发明属于小麦品种培育技术领域，尤其涉及一种null型hmw-gs小麦的创制方法。
背景技术：
小麦因具有其它禾谷类作物均没有的“面筋蛋白”而可以加工制作成多达上百种食品。小麦“面筋蛋白”包括高分子量谷蛋白(highmolecularweightgluteninsubunits，hmw-gs)、低分子量谷蛋白(lowmolecularweightgluteninsubunits,lmw-gs)和醇溶蛋白(gliadin)三大类。小麦hmw-gs约占成熟种子总蛋白的10％，但在面筋网络中起“骨架”作用，其hmw-gs组成和表达数目都能影响面筋强度并最终决定小麦面粉加工品质(shewryandhalford2002；shewryetal.2003；yangetal.2014；wieserandkieffer；2001)。
普通小麦的第一同源群染色体长臂上有1个编码hmw-gs的复合基因位点，统称glu-1,对应于a、b和d基因组上的位点分别为glu-a1、glu-b1和glu-d1，每一位点内有两个紧密连锁的基因，分别编码分子量较大的x型和较小的y型亚基，且为共显性遗传(shewryetal.1992，2003；rasheedetal.2014)。普通小麦的3个hmw-gs基因位点理论上可表达6个亚基，但因部分基因沉默，实际上仅表达3-5个亚基，即glu-d1的dx和dy通常都表达，glu-b1的bx和by表达其中的1个或2个均表达，glu-a1的仅表达ax或ax、ay均不表达(shewryetal.1992，2003)。通常，也将glu-1位点不表达hmw-gs蛋白的情形称为null型hmw-gs，而表达其它任何蛋白亚基或类型的统称为非null型hmw-gs。在自然界天然存在六倍体小麦资源(包含育成品种)内，极难发现hmw-gs表达基因数目3个以下的，几乎找不到所有glu-1位点的全部hmw-gs基因都不表达的(基因沉默或缺失)，也即表达0个hmw-gs的六倍体小麦(zhengetal.2011)。
弱筋小麦是糕点和饼干类食品的重要原料，其对具体品质指标的要求非常苛刻,均要求为低值。国家标准(gbt17320-2013)规定，弱筋小麦的硬度指数、粗蛋白质含量(干基)、面粉湿面筋含量、zeleny沉淀值、稳定时间和吸水量要求分别<50、<12.5％、<26％、<30、<3.0min和<56ml/100g。上述要求决定了弱筋小麦具有不可替代性。近10年(2006-2015)我国生产的小麦品质以中筋和中强筋为主，强筋小麦次之，弱筋小麦最少，在测试的742个小麦品种的7561份样品中,达标弱筋品种的比例仅2％，样品比例也仅为3.8％，均小于5％(胡学旭等,2016)。弱筋小麦品种少，品质指标稳定性差，配粉困难是我国弱筋小麦生产面临的主要问题。
综上所述，现有技术存在的问题是：虽然降低普通小麦背景中表达的hmw-gs数目可在一定程度上降低小麦面粉与面筋强度相关的加工品质指标，并成为培育面筋特性趋于弱化小麦品种的潜在育种新途径。但自然界天然存在的六倍体小麦资源(含育成品种)所表达的hmw-gs数目过多，通常都在3-5个，很少在3个以下的，而找不到表达0个hmw-gs(即不表达任何hmw-gs蛋白)的六倍体小麦。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种null型hmw-gs小麦的创制方法，组装小麦三个基因组高分子量谷蛋白基因位点(glu-1)的null型hmw-gs，得到了表达0个hmw-gs的六倍体小麦，能够降低小麦面筋相关品质指标，使面筋含量下降，面筋质量趋于弱化。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种null型hmw-gs小麦的创制方法，包括以下操作：
1)以a，b两组glu-1位点表达null型hmw-gs的四倍体小麦为母本，以d组基因组glu-1位点表达非null型hmw-gs的二倍体节节麦为父本，将父本的花粉授予母本，进行属间不同物种间非同倍远缘杂交，产生三倍体杂种f1；
2)在小麦正常生长季节将三倍体杂种f1种植于田间，开花前套袋自交结实，通过母本四倍体小麦的未减数配子基因，使其染色体自动加倍成六倍体，所得种子经过根尖染色体计数排除非整倍体，并经sds-page鉴定得到a，b两组基因组glu-1位点表达null型hmw-gs、d基因组glu-1位点表达非null型hmw-gs的新六倍体小麦；
3)以a，b两组基因组glu-1位点表达null型hmw-gs、d基因组glu-1位点表达非null型hmw-gs的新六倍体小麦为母本，以d基因组glu-1位点表达null型hmw-gs的六倍体小麦为父本，进行同倍杂交，得到杂种f1；
4)将获得的杂种f1种植于田间，开花前套袋自交，收种后获得f2种子；对于f2种子分单粒利用半粒法sds-page鉴定hmw-gs组成，舍去a、b和d任一个基因组glu-1位点表达非null型hmw-gs的六倍体小麦种子，从中筛选、保留表达0个hmw-gs的含胚半粒种子作为原始种子；
5)将原始种子发苗种植于田间，开花前套袋自交，单粒传法自交至f6种植成株系。
所述的三倍体杂种f1的获取为：
当母本幼穗抽出1/2旗叶以上至全部抽出但尚未自交授粉时，除去基部和顶部发育不良小穗及每小穗中间的小花，剪去小花1/3的颖片使柱头露出，并同时去掉3个花药直至所有小花均去雄完成，然后以透明的杂交袋套袋；
去雄后第2-4天连续3天将父本的花粉授予母本去雄的柱头，进行属间不同物种间非同倍远缘杂交，结实产生的杂交种子得到三倍体杂种f1。
所述的单粒传法为：
以原始种子发苗种植于田间，开花前套袋自交，收种后获得f3种子；
收获的f3种子分单粒发苗种植于温室，开花前套袋自交，收种后获得f4种子；
收获的f4种子分单粒发苗种植于温室，开花前套袋自交，收种后获得f5种子；
收获的f5种子分单粒种植于田间，开花前套袋自交，分单株收获f6种子。
收获的f6每个单株的种子按株系种植于田间，成熟后按株系收获f7种子，然后磨粉测定其沉降值、湿面筋含量、面筋指数、形成时间、稳定时间和评价值。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明首先通过聚合四倍体小麦(栽培二粒)a、b基因组glu-1位点表达的null型hmw-gs与二倍体节节麦d基因组glu-1位点表达的非null型hmw-gs，再通过非同倍远缘杂交产生三倍体杂种f1，该杂种通过染色体自动加倍将a、b基因组glu-1位点表达的null型以及d基因组glu-1位点表达的非null型hmw-gs导入新六倍体小麦，然后聚合六倍体小麦d基因组glu-1位点的null型hmw-gs，后代经过sds-page筛选鉴定hmw-gs组成，连续多代自交，最终得到3个基因组上的glu-1位点均表达null型hmw-gs,也即表达0个hmw-gs的六倍体普通小麦。
以表达5个hmw-gs的弱筋小麦品种川农16为对照，表达0个hmw-gs的小麦在决定面筋特性的主要相关加工指标上都较对照有明显降低，使面筋特性趋于变弱。
附图说明
图1为本发明的null型hmw-gs小麦的构建流程示意图；
图2为本发明实施例提供的普通小麦hmw-gs鉴定图。
图3是本发明提供的沉降值测试结果。结果表明，表达0个hmw-gs的六倍体小麦品系h5和f12的沉降值显著低于弱筋小麦川农16。
图4是本发明提供的湿面筋含量(14％水分)测试结果。结果表明，表达0个hmw-gs的六倍体小麦品系h5和f12的沉降值显著低于弱筋小麦川农16。
图5是本发明提供的形成时间测试结果。表达0个hmw-gs的六倍体小麦品系h5和f12的形成时间显著低于弱筋小麦川农16。
图6是本发明提供的稳定时间测试结果。表达0个hmw-gs的六倍体小麦品系h5和f12的稳定时间显著低于弱筋小麦川农16。
图7是本发明提供的评价值测试结果。表达0个hmw-gs的六倍体小麦品系h5和f12的弱化度显著低于弱筋小麦川农16。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明通过创制新六倍体小麦途径，将四倍体小麦(栽培二粒)a和b基因组glu-1位点的null型hmw-gs与d基因组glu-1位点表达非null型hmw-gs聚合，最终得到表达2个hmw-gs的新六倍体小麦。该新六倍体小麦再与d基因组glu-1位点表达null型hmw-gs的六倍体小麦进行同倍杂交聚合d基因组glu-1位点的null型hmw-gs，在f2种子中筛选到3个基因组的glu-1位点均表达null型(即表达0个)hmw-gs的单粒种子。这些种子应用单粒传法自交到f6分单株收获于f7种植成株系，得到稳定表达0个hmw-gs的小麦品系。
下面结合图1及具体实施例对本发明作进一步描述。
null型hmw-gs小麦的创制方法，包括以下操作：
1)以a，b两组glu-1位点表达null型hmw-gs的四倍体小麦自然突变体为母本，当母本幼穗抽出1/2旗叶以上至全部抽出但尚未自交授粉时,用镊子除去基部和顶部发育不良小穗及每小穗中间的小花,用剪刀剪去其余保留小花1/3的颖片使柱头露出,用镊子同时去掉3个花药直至所有小花均去雄完成，然后以透明的杂交袋套袋。去雄后第2-4天连续3天以d组基因组glu-1位点表达非null型hmw-gs的二倍体节节麦为父本，将父本的花粉授予母本去雄的柱头，进行属间不同物种间非同倍远缘杂交，结实产生的杂交种子即为三倍体杂种f1；
2)在小麦正常生长季节将三倍体杂种f1种植于田间进行自交，通过母本四倍体小麦的未减数配子基因，使其染色体自动加倍成六倍体，部分可育结实，所得种子经过根尖染色体计数排除非整倍体，并经sds-page鉴定得到a，b两组基因组glu-1位点表达null型hmw-gs、d组基因组glu-1位点表达非null型hmw-gs的新六倍体小麦；
3)以d基因组glu-1位点表达非null型hmw-gs的新六倍体小麦为母本，以d基因组glu-1位点表达null型hmw-gs的六倍体小麦为父本，进行同倍杂交，得到杂种f1；
4)将获得的杂种f1种植于田间，开花前套袋自交，收种后获得f2种子；对于f2种子分单粒利用半粒法sds-page鉴定hmw-gs组成，舍去其中a、b和d任一个基因组glu-1位点表达非null型hmw-gs的小麦种子，从中筛选、保留表达0个hmw-gs的含胚半粒种子作为原始种子；
5)将原始种子发苗种植于田间，开花前套袋自交，单粒传法自交至f6种植成株系。
具体的，三倍体杂种f1种子的获得：
以glu-1位点表达null型hmw-gs(即0个)的四倍体小麦(栽培二粒)(aabb)td312(t.turgidumssp.dicoccon)与glu-1位点表达非null型hmw-gs的节节麦(dd)as60杂交，获得三倍体杂种f1种子。
具体的，新六倍体小麦的获得为：
种植三倍体杂种f1种子，利用四倍体小麦的未减数配子自动加倍，开花前套袋自交结实，经sds-page鉴定hmw-gs组成和细胞学根尖鉴定染色体数目，获得d基因组glu-1位点表达非null型、而a、b基因组的glu-1位点表达null型hmw-gs的新六倍体小麦(aabbdd),其染色体数目为42条，并共表达2个hmw-gs。
sds-page鉴定的具体实施方案如下：
(1)用刀片刮取种子远离胚端的少量胚乳并成细粉，按照每4mg样品加入100μl蛋白提取液的比例加入提取液，室温下振荡1.5h，于100℃沸水中变性5min，8000×rpm4℃离心5min。
提取液组成：62.5mmtris-hcl(ph6.8)，10％(v/v)丙三醇，2％(w/v)sds，0.002％(w/v)溴酚蓝，3.0％(v/v)β-巯基乙醇；
分离胶缓冲液(1l):溶解151.2gtris，10gsds，38g硼酸，加水定容至1l，ph值为8.9。
浓缩胶缓冲液：1.0mtris-hcl(ph6.8)，10％(w/v)sds。
电泳缓冲液：将分离胶缓冲液稀释10倍
聚丙烯酰胺凝胶组成如下:
(2)取上清液2.5μl点样，恒流20ma电泳，待溴酚蓝走出分离胶30min后，电泳结束，取下胶用染色液染色1-2h，清水漂洗脱色至凝胶背景清晰后，照相保存结果。
染色液组成(500ml)：325ml蒸馏水、0.5g考马斯亮蓝r-250、125ml异丙醇、50ml冰醋酸。
下面提供关于普通小麦及本发明选育品种的hmw-gs电泳检测结果，参图2，图中泳道1-3是普通小麦品种(系)，通常表达3-5个hmw-gs。泳道1为表达5个hmw-gs的普通小麦代表品种“川育12”，组成为1,7+8,5+10。泳道2为表达4个hmw-gs的普通小麦代表品种“中国春”，组成为null,7+8,2+12。泳道3为表达3个hmw-gs的普通小麦代表品种“繁6”，组成为null，20，2+12。泳道4为表达0个hmw-gs的四倍体小麦(栽培二粒)，即本发明a、b基因组glu-1位点null型hmw-gs的供体。泳道5为d基因组的glu-1位点表达非null型hmw-gs(即2个hmw-gs)的节节麦。泳道6为a、b基因组的glu-1位点表达null型，d基因组glu-1位点表达非null型hmw-gs(即2个hmw-gs)的新六倍体小麦。泳道7为d基因组glu-1位点表达null型hmw-gs的普通小麦。泳道8-9分别是本发明得到的表达0个hmw-gs的六倍体小麦f6株系的种子。
具体的，杂种f1的获得为：
以d基因组glu-1位点表达非null型，而a、b基因组的glu-1位点表达null型hmw-gs的新六倍体小麦(aabbdd)为母本，当母本幼穗抽出旗叶1/2以上至全部抽出但尚未自交授粉时,用镊子除去基部和顶部发育不良小穗及每小穗中间的小花,其余保留的小花用剪刀剪去1/3颖片并露出柱头,用镊子同时去掉3个花药直至所有小花均去雄完成，然后以透明的杂交袋套袋。第3天以d基因组glu-1位点表达null型hmw-gs的小麦为父本，将父本的花粉授予母本去雄的柱头，获得六倍体小麦的杂种f1。
种植该杂种f1，开花前套袋自交结实，获得f2种子。
应用半粒种子法鉴定单粒f2的hmw-gs组成，选择表达0个hmw-gs的单粒种子为原始种子。
表达0个hmw-gs的小麦应用单粒传法自交至f6代分单株收获，f7种植成株系并收获，得到稳定表达0个hmw-gs的小麦。
具体为：以原始种子发苗种植于田间，开花前套袋自交，收获f3种子；
收获的f3种子分单粒于温室发苗种植，开花前套袋自交，收获f4种子；
收获的f4种子分单粒于温室发苗种植，开花前套袋自交，收获f5种子；
收获的f5种子分单粒种植田间，开花前套袋自交，分单株收获f6种子。
f6每个单株的种子按株系种植于田间，成熟后按株系收获f7种子，然后磨粉测定其沉降值、湿面筋含量，面筋指数，形成时间、稳定时间和评价值等主要加工品质指标。
加工品质指标测定结果表明，稳定表达0个hmw-gs小麦的沉降值、湿面筋含量、面筋指数、形成时间、稳定时间和评价值等加工品质指标较表达hmw-gs不为0的弱筋小麦对照的相应指标进行比较，其具有减弱或降低这些小麦加工品质指标的作用。
以弱筋小麦川农16为对照，以上述方法所得表达0个hmw-gs的来源于不同f6株系的f7小麦品系h5和f12进行沉降值、湿面筋含量和粉质参数(形成时间、稳定时间和评价值)等测定。
具体方案如下：
1、湿面筋含量测定
采用perten2200型面筋仪，按gb/t5506.2-2008/iso21415-2:2006方法测定面筋含量。具体步骤如下：
①称取10g待测样品，准确至0.01g，选择正确的清洁筛网，并在试验前润湿。将称好的样品全部放入面筋仪洗涤室。轻轻晃动洗涤室使样品分布均匀。
②用可调移液器向待测样品中加入4.8ml氯化钠溶液。移液器流出的水流应直接对着洗涤室壁，避免其直接穿过筛网。轻轻摇动洗涤室，使溶液均匀分布在样品表面。氯化钠溶液用量应根据面筋含量高、低以及面筋强、弱进行调整。如果混合时面团很黏(洗涤室水溢出)，应减少盐溶液用量(最低4.2ml)；若混合过程中形成了很强很坚实的面团，氯化钠溶液用量可增加至5.2ml。
③洗涤过程中应注意观察洗涤室排出液的清澈度。当排出液清澈时可认为洗涤完成。用碘化钾溶液检测排出液是否还含有淀粉。
④仪器预设洗涤时间为5min，在操作过程中通常需要250-280ml氯化钠溶液。洗涤液通过仪器以预先设计的恒定流量自动传输，根据仪器的不同流量设置为50-56ml/min
⑤如果自动洗涤系统无法完成面团的充分洗涤，可以在洗涤过程中，人工加入氯化钠洗涤液,重新揉团再洗涤。
⑥洗涤完成后，用金属镊子将湿面筋从洗涤室取出，确保洗涤室不留有任何湿面筋。将面筋分成大约相等的两份，轻轻压在离心机的筛盒上。启动离心机，离心60s，用金属镊子取下湿面筋并立即称重，精确到0.01g。
⑦计算湿面筋含量，并校正到14％水分基。
计算结果：湿面筋(g)＝面筋总量(g)×100/10
湿面筋含量的校正：湿面筋含量(14％水分基)＝未修正湿面筋含量×(100-14)/(100-面粉含水量)
2、沉降值测定
采用gb/t21119-2007/iso5529:1992《小麦沉降指数测定
zeleny实验》具体操作步骤如下：
试剂配制
乳酸溶液：配置85％(v/v)浓乳酸溶液,矿物质含量不应超过40mg/kg。取250ml该浓乳酸溶液加水稀释定容至1l，加热回流6h。取一份稀释液，用氢氧化钾溶液标定(每5ml稀释溶液，约需0.5mol/l氢氧化钾溶液28ml)。其浓度应在2.7-2.8mol/l之间。将180ml乳酸稀释液与200ml99-100％(v/v)的异丙醇充分混匀，加水稀释定容至1l。将此稀释液置于带塞试剂瓶中，放置48h后使用。
溴酚蓝溶液：将4mg溴酚蓝溶解于100ml水中。
①称取3.2g小麦粉，精确至0.05g。
②将小麦粉倒入带刻度量筒。加入50ml溴酚蓝溶液，用塞子塞紧量筒。水平方向握住量筒，左右来回各震荡12次，摆幅约18cm，用时约5s，将小麦粉和试剂充分混合。
③将量筒放在振荡器上，打开秒表计时，开始震荡。5min后取下量筒，加入25ml沉淀试剂。把量筒放回振荡器上继续振摇。
④总共振摇10min后，从振摇器上取下量筒，竖直放置。
⑤准确静置5min，然后记录沉淀物体积，精确至0.5ml。
3、粉质参数测定
采用brabender公司生产的e型10g粉质仪，参照国标(gb/t14614-2006/iso5530-1：1997)进行测定，主要步骤如下：
①称取质量相当于10g(10g揉混器)水分含量14％的小麦粉实验样品，精确至0.1g。
②打开控温装置开关,加热至30℃。
③按“开始”键启动粉质仪。
④打开计算机中brabender软件,在参数试窗中输人日期、操作员姓名、样品重量(10g)、样品名称、测试时间(一般定为20min)、水份、吸水率等测试参数,然后点击“测试开始”键。
⑤揉面钵空转，仪器自动调零，提示加入面粉，打开揉面钵，加入已称好面粉。
⑥点击粉质仪的“开始”键及电脑屏幕上的“ok”键，揉面钵继续运转，预热和预搅拌1min。
⑦用滴定管向揉面钵中快速加入预定加水量。
⑧面团形成，扭距增加，电脑上自动绘制粉质曲线。
⑨达到预设20min时，仪器自动提示测试结束，关闭粉质仪。
⑩从电脑窗口上读出本次测试结果。
图3-图7分别显示本发明得到的nullhmw-gs系(即0个hmw-gs系)f7与弱筋小麦对照川农16在沉降值、湿面筋含量、形成时间、稳定时间和评价值的比较，结果显示在这些与小麦面筋相关的指标中nullhmw-gs系均低于对照。
以表达5个hmw-gs的弱筋小麦品种川农16为对照，表达0个hmw-gs的小麦在决定面筋特性的主要相关加工指标上都较对照有明显降低，使面筋特性趋于变弱。表明本发明提供的null型hmw-gs小麦，能够通过减少普通小麦背景中表达的hmw-gs数目从而降低小麦面筋相关加工品质指标，适用于培育面筋行为弱化的小麦。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。