一种野生松乳菇菌种的分离方法与流程

本发明属松乳菇菌种获得和应用领域，特别是涉及利用浙江的野生松乳菇菌种的获得和应用。

背景技术

松乳菇(lactariusdeliciosus)属红菇科、乳菇属，又名美味松乳菇、松树蘑、松菌，枞树菇，茅草菇，是一种深受欢迎的美味食用菌。我国是野生菌生物多样性特别丰富的国家之一，中国估计有10万种食药用菌，已被认识的只有1000种左右，而被利用的只有100种左右，由此可见大多数野生食药用菌未被发现、认识和利用。驯化栽培更好的食药用菌是食药用菌工作者的重要工作之一。

我国浙江、湖南、湖北、安徽、广西、贵州、云南、广东等全国大部分地区都有松乳菇的分布，且在华中、华南和华东部分地区广受老百姓欢迎。但松乳菇菌种目前很难分离成功，即使分离成功其生长速度或活性也不强，因此很多以松乳菇为研究对象的食用菌驯化和栽培活动没有办法进行。

面对这种形势，找到一种可以快速分离松乳菇菌种，并能使松乳菇菌丝在普通培养基上快速生长，是进行松乳菇研究的必要前提。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种产自浙江的野生松乳菇菌种的分离方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一种野生松乳菇菌种的分离方法，其特征在于，包括：采集野生松乳菇(lactariusdeliciosus)子实体并分离菌褶，于第一培养基中培养，将获得的菌种进行纯化，再转至普通培养基进行适应性培养，得到野生松乳菇菌种；其中，所述的第一培养基含有18-22g/l壳斗科植物水提物、18-22g/l琼脂、18-22g/l葡萄糖、0.05-0.15g/l氯化钙、0.05-0.15g/l硫酸镁、0.5-1.0g/l磷酸二氢钾、0.005-0.015g/l氯化钠、0.1-0.3g/l磷酸氢二氨、0.05-0.15g/l氯化铁、0.05-0.15g/l硫酸锌、0.03-0.08g/l硫酸铜、0.005-0.015g/l尼克酸、0.05-0.15mg/l维生素b1以及0.5-1.5g/l麦芽汁，所述的壳斗科植物水提物的制备方法包括：将壳斗科植物的干枯叶片用水熬制，壳斗科植物的干枯叶片与水的重量比为1∶80-120，过滤，所得滤液为壳斗科植物水提物。

优选地，所述的壳斗科植物为板栗(castaneamollissima)。

优选地，所述的熬制时间为5-15min。

优选地，所述的第一培养基的配制方法包括：在壳斗科植物水提物中加入琼脂并加热融化，待琼脂完全融化后加入药品，所述药品包括葡萄糖、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、磷酸氢二氨、氯化铁、硫酸锌、硫酸铜、尼克酸、维生素b1以及麦芽汁，待药品完全融化后，定容，灭菌，分装，冷凝至常温。

本发明的野生松乳菇生长于浙江。

优选地，所述的野生松乳菇从壳斗科植物树下采集。

优选地，所述的采集野生松乳菇子实体并分离菌褶的方法包括：采集野生新鲜的松乳菇子实体，去除表面杂物和灰尘，选取未暴露在空气中的菌褶进行分离。

优选地，所述的于第一培养基中培养的条件为在20-30℃暗光下培养10-15d。

优选地，所述的菌种纯化的步骤包括：将获得的菌种接种于第二培养基中进行培养以抑制细菌的生长，所述的第二培养基含葡萄糖15-25g/l、酵母膏1-3g/l、柠檬酸0.3-0.8g/l、琼脂15-25g/l，培养条件为常温避光培养。

优选地，所述的普通培养基为pda培养基，培养条件为20-30℃下暗光培养5-10d。

优选地，所述的野生松乳菇菌种的分离方法还包括：对获得的松乳菇纯菌种和分离的松乳菇子实体菌褶进行dna序列测序，将获得的序列进行比对，序列100％一致则获得的松乳菇纯菌种为纯菌种。

本发明利用特殊配制的培养基来高效分离生长于浙江的一种野生松乳菇菌种，经此特种培养基和该方法进行菌褶分离，长出菌丝后重新转接到普通培养基进行适应性培养，适应后的菌种进行微观结构和分子序列鉴定以确认是否该松乳菇的菌种，分离的菌种可用于松乳菇的后续驯化栽培等。

本发明中的特殊培养基中加入了熬制的壳斗科植物干枯叶片，同时药品中加入了硫酸锌、硫酸铜、尼克酸成分，这些成分经多次试验验证，可以使产自浙江的野生松乳菇菌丝在接种后快速萌发。

本发明所述的未暴露在空气中的菌褶(大小约2×2mm²)，而不是菌肉组织或弹射的孢子，避免污染，孢子含量高，容易萌发。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明可快速分离松乳菇纯菌种，所分离的松乳菇纯菌种能够快速生长，可用于研究以及驯化栽培。

附图说明

图1分离成功的野生松乳菇菌种。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

一种野生松乳菇菌种的分离方法，包括：

(1)第一培养基配制：所述的第一培养基含有20g/l壳斗科植物板栗水提物、20g/l琼脂、20g/l葡萄糖、0.1g/l氯化钙、0.1g/l硫酸镁、0.8g/l磷酸二氢钾、0.01g/l氯化钠、0.2g/l磷酸氢二氨、0.1g/l氯化铁、0.1g/l硫酸锌、0.05g/l硫酸铜、0.01g/l尼克酸、0.1mg/l维生素b1以及1g/l麦芽汁，其配制方法为：加入壳斗科植物板栗的干枯叶片至水中，壳斗科植物板栗的干枯叶片与水的重量比为1∶100，熬制10min后过滤，所得滤液为壳斗科植物水提物，按比例在滤液中加入琼脂并加热使其融化，待琼脂完全融化后依次加入药品，药品包括葡萄糖、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、磷酸氢二氨、氯化铁、硫酸锌、硫酸铜、尼克酸、维生素b1、麦芽汁(hb4176-3青岛海博生技术有限公司)，待药品完全融化后，定容至1000ml；121℃灭菌15min，后分装试管或平皿，冷凝至常温备用。

(2)菌种分离和培养：从浙江壳斗科植物树板栗下采集野生新鲜的松乳菇子实体，去除表面杂物和灰尘，选取未暴露在空气中的菌褶(大小约2×2mm²)进行分离，放置于已灭菌的第一培养基试管或平皿中，在25℃暗光下培养10-15d，获得松乳菇菌种。

(3)将获得的菌种进行纯化：将获得的菌种接种于第二培养基中进行培养以抑制细菌的生长，所述的第二培养基含葡萄糖20g/l、酵母膏2g/l、柠檬酸0.5g/l、琼脂20g/l，培养条件为常温避光培养，获得松乳菇的纯菌种。

(4)普通培养基转管适应：挑取纯化的松乳菇菌丝，转管至普通pda培养基试管或平板上进行适应性培养，25℃下暗光培养5-10d，获得松乳菇纯菌种。

(5)菌种鉴定：对获得的松乳菇纯菌种和分离的松乳菇子实体菌褶进行dna序列测序，将获得的序列进行比对，序列100％一致则获得的菌种为纯菌种。本发明能够分离出采集自浙江的松乳菇菌种，其他则不能。